森林草莓FveD27的表達特性和功能

孫洪影，王巖，李偉佳，2，朱天姝，姜穎，許妍，吳清悅，張志宏?

1沈陽農業大學園藝學院/遼寧省草莓育種與優質栽培重點實驗室，沈陽 110866；2山西大同大學炭材料研究所，山西大同 037009

0 引言

【研究意義】植物株型對植物的生長發育起著十分重要的作用，其主要受遺傳、植物內源激素以及溫度、光周期、營養條件等內外因素共同調控，其中植物激素在株型的調節機制中具有決定性地位[1]。分枝發育不僅是決定植物株型的關鍵因素，還能影響其產量[2]。獨腳金內酯（strigolactone，SL）是近年來在植物體內發現的調控植株生長發育和形態建成的一類新型激素，具有抑制植物分枝的顯著功能[3-5]。克隆鑒定草莓SL生物合成途徑中的關鍵基因DWARF27（D27）并闡明其生物學功能，探究FveD27在草莓分枝等生長發育過程中的作用，為提高草莓產量提供理論基礎。【前人研究進展】SL是一種以類胡蘿卜素為前體合成的特異性小分子萜類化合物，D27編碼全反式-β-類胡蘿卜素異構酶，該酶處于SL生物合成的上游[6-8]。D27的功能最早在水稻中被發現，通過對d27突變體的深入研究，發現D27具有抑制水稻分蘗的作用[9-10]。之后研究人員在擬南芥中利用反向遺傳學、外源 GR24（一種以 SL為框架的人工合成物質）以及嫁接試驗證實AtD27是抑制次生芽生長所必需的[11]。此外，菊花中克隆出D27的同源基因DgD27，該基因在擬南芥的異位表達降低分枝數并使突變體d27恢復至野生型表型，表明菊花DgD27對枝條分枝的調控效果[12]。小麥中也分離出TaD27，并且TaD27-7B在擬南芥的異位表達可以恢復擬南芥d27突變體的表型，說明在小麥中TaD27的功能與AtD27相近[13]。國內外學者還分別對苜蓿、森林草莓、甘蔗以及青天葵中D27的同源基因進行克隆分析，但并未揭示其生物學功能[14-17]。【本研究切入點】目前，關于 SL合成及信號傳導基因的研究主要集中在擬南芥、水稻等模式植物，在草莓上的研究鮮有報道[2,15,18]。筆者課題組前期研究發現，無匍匐莖的森林草莓資源‘Yellow Wonder’的匍匐莖發生突變體（srp）的新莖數量減少，FveD27表達水平顯著上調[19]。此外，外源施用 5 μmol·L-1的GR24可顯著抑制森林草莓新莖分枝數量（數據尚未發表）。因此，推測FveD27具有調控草莓新莖發生的功能。【擬解決的關鍵問題】從森林草莓中克隆FveD27，通過在森林草莓中過表達FveD27來明確其生物學功能。

1 材料與方法

試驗于2016年10月至2020年9月在沈陽農業大學園藝學院/遼寧省草莓育種與優質栽培重點實驗室，以及沈陽農業大學教學科研試驗基地日光溫室完成。

1.1 植物材料

森林草莓（Fragariavesca）資源‘Yellow Wonder’（YW）用于基因克隆、基因表達分析和穩定遺傳轉化，‘Ruegen’（RG）用于 GUS組織活性試驗分析。

本氏煙草（Nicotianabenthamiana）用于基因亞細胞定位。

1.2 植物核酸的提取

草莓基因組DNA以及草莓不同器官中的總RNA提取方法參照改良版的CTAB法[20]。

1.3 引物設計與合成

參考NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中FveD27序列設計基因全長克隆、實時熒光定量PCR與亞細胞定位所需引物；利用薔薇科基因組數據庫（https://www.rosaceae.org/）獲得FveD27啟動子的參考序列設計啟動子克隆引物，引物設計采用Primer 5.0軟件，并交由金唯智生物科技有限公司（蘇州）合成。引物信息見表1。

1.4 基因編碼區擴增

使用TaKaRa公司的反轉錄（RT）試劑盒將森林草莓 YW 幼葉提取的總 RNA反轉錄為 cDNA，以cDNA為模板通過PCR擴增FveD27編碼區，反應體系為 20 μL：cDNA 0.5 μL、上下游引物（FveD27-F/R）各 0.5 μL、10×LA Buffer 2 μL、dNTP 1.6 μL、LA Taq Buffer（Mg2+）0.2 μL、ddH2O 14.7 μL。反應程序為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，32個循環；72℃ 7 min。將電泳檢測正確的產物回收純化，并連接pMD18-T，轉化大腸桿菌Trans 5α，篩選陽性克隆并測序，將序列比對正確的載體命名pMD-T-FveD27。

1.5 生物信息學分析

用蛋白質系統分析工具（http://web.expasy.org/protparam/）分析FveD27的理化參數；TMHMM跨膜分析在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測 FveD27蛋白跨膜情況，參考 NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），查找不同物種中FveD27的同源基因，用DNAMAN 6.0軟件對其氨基酸序列進行對比分析；并用MEGA 6.0軟件完成系統進化樹的繪制。

1.6 亞細胞定位

通過Plant-mPLoc軟件（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在線預測森林草莓FveD27的亞細胞定位。以重組質粒 pMD-T-FveD27為模板，用FveD27(eGFP)-F/R引物（表1）克隆獲得去除終止子的FveD27目的片段，與雙元表達載體pRI101-AN-eGFP連接獲得融合表達載體pRI101-FveD27-eGFP。參照凍融法[21]將質粒 pRI101-AN-eGFP（對照）和 pRI101-FveD27-eGFP分別轉化農桿菌GV3101。利用注射法[22]進行煙草葉片瞬時表達，之后應用TCS SP8激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國）檢測煙草葉片中綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況。

1.7 基因表達分析

以轉錄水平穩定性較好的森林草莓26S為內參基因，利用qRT-PCR分析FveD27在森林草莓‘YW’不同組織（成熟葉、幼葉、葉柄、莖尖和根）中以及野生型與過表達轉基因植株中的表達水平。本試驗采用SYBR Green熒光染料法，反應體系為10 μL：5 μL SYBR Green mix、引物（FveD27-DL-F/R 與Fve-26S-F/R）各 0.5 μL、cDNA 0.5 μL、RNase-free H2O 3.5 μL。使用QuantStudioTM6Flex熒光定量儀（Applied Biosystems，美國），qRT-PCR反應設置程序為二步法：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，40 個循環；60℃ 1 min，95℃ 15 s。參考 2-ΔΔCT法[23]對PCR結果進行分析，每個樣品進行3次生物學重復與3次技術重復。

1.8 啟動子克隆與分析

以森林草莓‘YW’幼葉DNA為模板，proFveD27-F/R為引物（表1），進行FveD27啟動子序列的克隆。將PCR產物純化與pMD18-T構成重組質粒并測序。將測序成功的陽性克隆重組質粒命名pMD-T-proFveD27。利用 PlantCARE軟件對克隆得到的FveD27啟動子順式作用元件進行在線預測分析。

表1 本試驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.9 FveD27啟動子與GUS融合載體及FveD27過表達載體的構建

利用限制性內切酶PstⅠ與XbaⅠ對 pMD-T-proFveD27以及雙元表達載體 pRI201-AN-GUS同時進行雙酶切，之后再利用T4 DNA連接酶連接載體與目的片段，使FveD27啟動子替換雙元 pRI201-ANGUS中 CaMV35S啟動子序列，得到植物融合載體pFveD27::GUS。

使用限制性內切酶SmaⅠ與KpnⅠ，對 pMD-TFveD27以及空載pRI101-AN同時進行雙酶切，之后利用T4 DNA連接酶將兩者進行連接得到過表達載體pRI101-FveD27。

1.10 草莓遺傳轉化

將pFveD27::GUS與pRI101-FveD27植物表達載體轉入農桿菌 GV3101中用于森林草莓的遺傳轉化。森林草莓葉片遺傳轉化方法采用葉盤法[24]。經農桿菌浸染后，外植體經共培養、推遲培養、卡那霉素（Kan）抗性選擇培養3個階段獲得再生抗性芽。待抗性芽長成單株，進行轉化植株葉片的Kan抗性試驗以及DNA目的片段擴增的陽性植株篩選[25]。

1.11 GUS組織化學染色

將野生型與 pRI201-FveD27-GUS轉基因陽性植株不同組織浸入 GUS染液（磷酸鈉緩沖溶液、K3[Fe(CN)6]溶液、K4[Fe(CN)6]溶液、Na2EDTA、Triton-100溶液、蒸餾水以及現用現加X-Gluc），用錫箔紙做好避光處理，37℃黑暗條件下染色12—16 h，然后加入無水乙醇進行脫色反應，利用體視顯微鏡（OLYMPUS，日本）觀察試材的染色情況[26]。

1.12 轉基因植株的表型觀察與分析

轉基因植株和非轉基因對照植株移栽到沈陽農業大學教學科研試驗基地日光溫室，培養條件為白天20—25℃，夜間12—15℃，相對濕度60%—70%，基質栽培配比是珍珠巖、蛭石、蚯蚓糞與草炭為 1∶2∶2∶4。選長勢健壯的轉基因和對照植株各10株，統一編號后用直尺、電子游標卡尺等工具進行植物學性狀調查。調查指標：株高、冠徑、新莖分枝數、葉片數、葉柄直徑、花序數等[27]。

1.13 數據統計分析

運用DPS 9.5軟件中的Duncan算法對植物學性狀調查部分數據進行差異性分析。

2 結果

2.1 FveD27的克隆及生物信息學分析

以FveD27-F/R為引物通過RT-PCR擴增出長度為789 bp的FveD27編碼區序列（圖1-A），編碼262個氨基酸。擴增序列與突變體srp轉錄組測序拼接的FveD27序列[19]長度一致（圖2），但是比NCBI中森林草莓‘Hawaii 4’的FveD27（XM_011460303.1）編碼區少3個堿基。預測的FveD27編碼蛋白的分子量和理論等電點分別為29.45 kD和8.35 kD；包含20種氨基酸，正電氨基酸32個，負電氨基酸29個；不穩定性指數為49.90，屬不穩定蛋白，且親水性平均系數（GRAVY）為-0.257，屬親水蛋白。TMHMM在線網站分析結果表明FveD27不屬于跨膜蛋白。FveD27與其他植物D27相似，具有保守的‘DUF4033’結構域（圖 3-A，3-B黑框內），該結構域家族存在于細菌和真核生物中，但其功能尚未明確。系統發育關系分析結果（圖4）表明，FveD27與薔薇科蘋果中MdD27蛋白的親緣關系最近，而與擬南芥中AtD27蛋白的親緣關系較遠。

2.2 FveD27亞細胞定位

Plant-mPLoc軟件在線預測結果表明FveD27定位在葉綠體。為驗證該結果，本研究在本氏煙草葉表皮細胞中進行 FveD27的瞬時表達分析。結果如圖 5，pRI101-AN-eGFP空載侵染的煙草細胞中，綠色熒光蛋白均勻分布在細胞核、細胞膜以及細胞質（圖 5-A—D），pRI101-FveD27-eGFP侵染的煙草細胞中，融合蛋白主要在葉綠體中表達（圖5-E—H），該結果與Plant-mPLoc軟件預測一致，表明FveD27定位于葉綠體。

2.3 FveD27表達特性

以森林草莓‘YW’的成熟葉、幼葉、葉柄、莖尖、根為試材，經qRT-PCR定量分析不同組織器官中FveD27的表達水平。結果表明，FveD27在草莓不同組織器官中表達量有明顯差異，主要在幼葉與莖尖中表達，而在葉柄與成熟葉中表達量次之，在根中表達量最低（圖6）。

以森林草莓‘YW’的幼葉 DNA為模板，利用PCR擴增出長度為1 670 bp的FveD27啟動子序列（圖1-B），該序列不包括轉錄本中的5′UTR。為進一步探索FveD27啟動子在轉錄水平的調控機制，本研究采用PlantCARE在線數據庫對FveD27啟動子區域進行分析。結果顯示（表2）：FveD27啟動子序列中，除了含有大量的 TATA-box核心啟動元件、CAAT-box啟動子和增強子共同順式作用元件外，還包含了3大類順式作用元件：（1）光響應元件；（2）環境脅迫響應元件，涉及MYB、干旱以及缺氧、厭氧；（3）激素響應元件，包括水楊酸、赤霉素與茉莉酸甲酯。因此，FveD27可能受到光信號、激素信號和逆境脅迫的調控，并參與草莓植株的生長發育。

表2 FveD27啟動子相關順式作用元件的預測Table 2 Prediction of cis-acting elements related to FveD27 promoter

為了進一步明確FveD27在草莓植株中的表達特性，將pRI201-FveD27-GUS載體進行森林草莓遺傳轉化，然后對野生型與轉基因試管苗植株進行GUS組織化學染色分析。與對照植株相比（圖7-A—D），轉基因植株的幼葉、芽等幼嫩部位（圖 7-F）藍色明顯，成熟葉（圖7-E）與葉柄（圖7-G）只有部分被染成藍色，而根部幾乎無顯色（圖7-H）。GUS染色結果與qRT-PCR（圖6）結果一致，表明FveD27在幼葉與莖尖中表達水平較高。

2.4 FveD27的功能分析

為了確定FveD27在森林草莓中的功能，本研究構建了FveD27過表達載體并利用農桿菌進行森林草莓的遺傳轉化，獲得2個FveD27過表達轉基因株系。qRT-PCR數據顯示，轉基因株系中FveD27表達量是非轉基因對照植株的16.6—52.2倍（圖8）。

為了揭示FveD27的生物學功能，將轉基因株系（T0代）和非轉基因對照植株同時移栽并在溫室中培養。對移栽40 d（處于營養生長期）的野生型與轉基因植株進行植物學性狀調查（圖 9），結果顯示該時期的轉基因植株與對照植株相比，株高并無顯著差異，冠徑增加，第三葉面積增大，葉柄直徑加粗，葉片數減少，新莖分枝數減少。

為了進一步探究FveD27在草莓生殖生長階段的影響，對生殖初期的野生型與轉基因植株進行調查。如圖10所示，在株高上，野生型與轉基因植株兩者間依舊未表現出明顯不同，相比于對照，該階段的FveD27過表達株系冠徑減小，葉片數減少，新莖分枝數減少，并且轉基因株系的花序數量明顯增多。此外，對T1代轉基因植株的表型也進行了初步觀察，結果顯示T1代轉基因植株也表現出新莖分枝減少的表型（圖11）。

3 討論

3.1 FveD27抑制草莓分枝的可能機制

分枝發育是決定植物株型的一個主要因素，對于薔薇科果樹的植株結構有著重要意義。關于D27抑制分蘗分枝的研究在水稻、擬南芥等模式植物中發現并驗證[9-11]。本研究中，FveD27過表達株系可以顯著抑制草莓新莖分枝數量，確定了該基因在高等植物中的功能保守，但其作用機制尚不清楚，為此，筆者希望在 SL抑制分枝研究結果中找到一些線索。一種為生長素極性運輸理論，當D27過量表達后，相對減弱的生長素極性運輸導致根部分泌出大量SL，從而加強分蘗芽向外生長的抑制作用。然而 SL的生物合成需要受其內、外部環境條件的協同作用，植物可能利用影響SL合成基因的轉錄來調節SL的合成和分泌[28-29]。最新研究成果闡述了 SL影響生長素運輸通道相關過程，SL干擾生長素對PIN極性靶向，是創傷后維管系統再生的關鍵調節劑[30]。第二種為腋芽形成與生長機制，植物分枝分蘗的過程一般包括腋芽的形成以及生長兩個主要階段[31]，首先是腋芽在葉腋處形成，然后由腋芽直接或間接的生長形成分蘗或分枝，之間存在短時間的休眠期，并通過激素類物質將其打破，推測該激素物質主要是 SL，其協同生長素（抑制腋芽產生）、細胞分裂素（促進分枝）一起誘導休眠期腋芽成枝構型[32-34]。近期，LUO等[35]在水培種植的水稻上使用高度空間分辨的原位雜交和轉錄組學的組合在腋芽休眠過程中取得新進展，發現 SL功能主要作用于腋芽的葉原基，并且脫落酸ABA參與SL介導的腋芽休眠，細胞分裂素CTK及ABA促進早期腋芽休眠，從而影響植物分枝；DUAN等[36]發現在水稻中SL能快速激活細胞分裂素氧化酶/脫氫酶 OsCKX9，即 SL通過OsCKX9調控CTK信號傳導通路，直接激活CTK分解代謝以調節水稻的分枝。上述研究進一步完善了多種激素協同調控分枝的網絡機制，這與FveD27啟動子作用元件分析結果相吻合（表 2），由此推測本研究中FveD27過表達株系間表型的差異性可能由相關激素間的互相作用與串擾引起，這一復雜關系網絡還需進行深入研究。

3.2 FveD27對開花的調控作用

目前為止，關于 SL的研究主要集中在植物的營養生長階段，比如：擬南芥或水稻中的下胚軸長度、根結構、枝條分枝、莖伸長、葉形等形態發生與抗逆性中的作用[37-40]。然而，對 SL在植物生殖生長中的作用知之甚少。有研究表明，與腋芽形成相關的LBD蛋白家族，其主要表達在腋芽萌動、器官形成以及側生與頂端分生組織邊界形成等方面，擬南芥中LBD蛋白家族的ASL1調控莖和花序的發育，從而影響側生分生組織的生成[41-42]，這與FveD27過表達株系中生殖生長初期階段葉柄直徑增加、花序數增加等方面的表型相近，推測D27可能與腋芽形成有關的基因存在某種未知的聯系，在表型調查過程中還發現轉基因植株表現早花特性，轉基因#1與#2株系比對照的開花時間提前5—7 d。此外，WU等[18]確定SL相關基因在發育中的心皮和花柱中高表達，并參與森林草莓果實發育的早期階段，這些結果說明SL也作用于植物開花及果實發育等過程，為本研究提供了新的方向。

綜上所述，本研究表明了 SL生物合成基因FveD27不僅有抑制草莓新莖分枝的作用，而且還影響其花序數量。通過分析討論該基因抑制分枝的可能作用機制，以及結合當前相關領域的最新研究結果，本研究找到了一條可能調控草莓株型，提高草莓產量的新思路，以期在接下來的試驗中展開深入研究。

4 結論

從森林草莓中克隆出編碼區為789 bp的FveD27序列，該基因在森林草莓的幼葉與莖尖等幼嫩部位表達量較高。FveD27定位在葉綠體。過表達FveD27的森林草莓轉基因株系表型揭示FveD27具有抑制新莖分枝的功能。