細胞凋亡對宰后肌肉嫩化作用機理的研究進展

黃峰，魏起超，李俠，劉春梅，張春暉

中國農業科學院農產品加工研究所/農業部農產品加工綜合性重點實驗室，北京 100193

0 引言

嫩度是決定肉食用品質的一個重要指標，消費調查顯示，大多數消費者對嫩度較好的肉具有更強的購買意愿[1]，且愿意購買價格高但嫩度有保證的肉[2]。與風味和多汁性不同，宰后肉的嫩度會發生不連續變化，剛屠宰的肉嫩度最好，由于尸僵的發生，嫩度會降低，隨后的解僵成熟又使嫩度逐步改善。這種不連續變化極易造成肉的最終嫩度較差且不穩定，嚴重降低肉的商品價值和消費者滿意度。為充分改善宰后肉的嫩度、縮短嫩化時間，亟需闡明宰后肉的嫩化機理。

宰后肌肉嫩化機理研究可分為以下階段：第一階段，明確肌原纖維蛋白有限降解是宰后嫩度改善的主要原因，而肌節長度主要在僵直過程影響嫩度，結締組織含量決定肉的“本底硬度”[3-4]。第二階段，集中在“鈣學說”和“鈣激活酶學說”之爭，最終明確鈣激活酶是宰后肌肉嫩度改善的主要原因[4-5]。第三階段，揭示了宰后肌細胞以凋亡的形式死亡，除鈣激活酶外，細胞凋亡酶在宰后早期肌肉嫩化中也發揮重要作用，宰后嫩化是多種內源酶協同作用的結果[6]。本文重點討論基于細胞凋亡的宰后嫩化機制最新研究進展，并分析嫩化過程中可能存在的生化調控網絡。

1 宰后肌細胞的死亡形式

1.1 細胞凋亡是宰后肌細胞死亡的主要形式

動物被屠宰放血后，肌細胞的營養基質及氧氣供應被中斷，造成活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量累積、ATP（adenosine triphosphate）逐漸耗盡等劇烈應激變化，必然導致細胞死亡[7]。目前已發現的細胞死亡方式包括凋亡、壞死、自噬等，其中凋亡和壞死是兩種主要死亡模式[8]。每種死亡方式都有其典型特征，凋亡與壞死的區別在前期研究中有詳細綜述[9]。早期有關宰后肌肉生化的研究并沒有關注細胞的死亡方式，但隨著凋亡概念引入至宰后肌肉嫩化領域[6]，宰后肌細胞死亡逐漸受到學者關注，并被認為與宰后肌肉嫩化過程高度相關[10]。OUALI等[6]發現宰后肌細胞間隙的增大并不是由傳統認為的 pH下降所引起，而可能是由細胞發生死亡、產生皺縮而導致，并最早提出宰后肌細胞是以凋亡的形式死亡[11]。隨后的相關研究也表明宰后肌細胞發生收縮、細胞核收縮并邊緣化、磷脂酰絲氨酸外翻、細胞核原位末端（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL）和laminin雙重染色呈陽性、出現凋亡小體，這些形態學變化均支持宰后肌細胞是以凋亡的形式死亡[12-14]。細胞凋亡出現的典型形態特征主要是細胞內一類稱為半胱氨酸天冬氨酸水解酶（細胞凋亡酶）的蛋白酶家族激活后，切割特定的底物引起。因此，細胞凋亡酶的激活及對相關特征底物的裂解是細胞凋亡的重要生化特征。目前，大多數研究發現宰后肌肉中細胞凋亡酶能夠被激活，如KEMP等[15]利用免疫印記技術在屠宰1 h后的豬肉背肌中檢測到細胞凋亡酶-3的酶原及激活片段，且其活性約在宰后 2 h達到最大值。CHEN等[16]在宰后雞胸肉中也檢測到細胞凋亡酶-3的激活片段，同時也檢測到血影蛋白被細胞凋亡酶-3特異性降解的120 kD片段。雖然UNDERWOOD等[17]報道宰后牛肉中細胞凋亡酶-3不能夠被激活，但大多數研究從宰后肌細胞形態學和生化特征變化方面均揭示宰后肌細胞是以凋亡的形式死亡。

1.2 宰后早期肌細胞死亡可能是從自噬到凋亡的轉化

目前的研究雖揭示了凋亡是宰后肌細胞的主要死亡方式。但肌細胞是一種典型的多核細胞，其死亡方式相比單細胞更為復雜[18]，且宰后肌肉內環境變化劇烈，宰后所有骨骼肌細胞是否都是以凋亡的形式死亡，有沒有可能存在自噬、壞死等其他死亡方式，這些都值得進一步探討。有學者認為，自噬、凋亡、壞死等可能是細胞在形態學和生化學上死亡的終點，在死亡過程中各種死亡方式間可出現并存，甚至相互轉化[19]。宰后肌肉嫩化一般分為3個階段：（1）僵直前階段，氧氣供應終止，但肌肉仍保持生理狀態。（2）僵直階段，能量被逐漸耗盡，逐漸達到最大僵直狀態，嫩度最差。（3）成熟階段，肌肉內源酶水解蛋白質，嫩度逐步改善。每個階段可能存在不同的細胞死亡變化（圖1）。動物剛被屠宰放血后，一方面ROS大量產生，促使肌細胞走向死亡；另一方面機體本能的啟動防御系統，熱休克蛋白等保護因子被激活，抵抗ROS損傷細胞，細胞發生自噬行為以保護損傷肌細胞。LANA等[20]也認為宰后肌肉中 ROS可能誘導肌細胞發生凋亡或自噬，尤其在ROS不過量時細胞會通過自噬啟動自身的防御系統。已有研究也表明，宰后肌細胞缺氧環境下出現了Becline-1和LC3蛋白表達量提高等典型自噬特征，并可通過細胞自噬誘導劑雷帕霉素及其抑制劑3-甲基腺嘌呤孵育處理調控細胞自噬，并進一步調控凋亡過程[21]。宰后肌細胞自噬應該是機體發生的一種短暫保護行為，隨著宰后時間的延長，持續的缺氧使ROS大量累積，機體的抗氧化功能消失，最終肌細胞必然凋亡。自噬和凋亡是宰后肌細胞生死走向的兩個方向，兩者發生程度的大小主要受線粒體調控。因為線粒體是產生ROS的主要場所，同時也最易受到ROS攻擊，造成線粒體損傷，其釋放出“死亡因子”或“保護因子”的多少和程度，直接調控缺氧環境下細胞是否死亡以及如何死亡。

1.3 宰后后期肌細胞可能從凋亡轉變為壞死

隨著對宰后肌細胞死亡方式研究的逐漸深入，有學者發現并不是所有的宰后肌細胞以凋亡形式死亡，隨著宰后時間延長，肌細胞中出現壞死的典型特征。如 CAO等[12]觀察宰后牛肉骨骼肌細胞形態時發現了肌纖維的玻璃化，部分細胞核的核質完全潰散，核質消失等典型壞死特征，并認為宰后肌細胞凋亡和壞死共存。DEGTEREV等[22]認為凋亡和壞死是細胞死亡的兩種極端類型，兩種死亡方式可相互轉化，并會出現凋亡和壞死特征并存的現象。因此，宰后肌細胞死亡可能存在凋亡、凋亡性壞死等多種模式共存，宰后早期出現凋亡特征，而后期轉化為壞死，且凋亡和壞死機制并不是截然分開，而是共存或者重疊（圖1）。

宰后肌細胞多種死亡模式間的交叉、轉換可能與外界刺激的強度、持續時間及動物品種等因素相關。目前關于這方面的研究還未見相關報道，從理論本質上分析，細胞內能量變化和線粒體膜通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放狀態可能是調控宰后肌細胞死亡的關鍵。首先，細胞凋亡是一個需要消耗能量的過程，而壞死的發生不需要能量。動物被屠宰放血后，機體能量再生功能喪失，殘存的ATP在無氧條件下也急劇下降，如豬肉宰后24 h的ATP幾乎被耗盡[23]，當需要大量能量的凋亡過程不能進行時，凋亡過程可能轉化為壞死。相反，如果能阻止明顯的ATP耗竭，細胞壞死可能就很難發生[19]。其次，線粒體不僅是細胞內能量代謝的場所，同時也是細胞死亡的決策者和執行者[24]。MPTP調控的線粒體死亡因子釋放是細胞內死亡級聯反應的總開關，其開放狀態直接決定著細胞以何種途徑進行死亡[25]。大多數凋亡過程需要細胞凋亡酶來完成最后的執行過程，鈣激活酶雖然也參與部分細胞凋亡過程，但其主要是執行細胞的壞死程序。如果宰后細胞是以多種死亡形式共存，凋亡過程可以轉化為壞死，那么細胞凋亡酶和鈣激活酶之間應該存在交互作用。HUANG等[26]研究發現，宰后肌肉成熟過程中細胞凋亡酶-3可以降解Calpastatin，從而影響鈣激活酶的活性，Calpastatin可能是細胞凋亡酶和鈣激活酶之間相互作用的中間鏈接，相似的試驗結果在病理性凋亡模型中也有報道[27-28]。同時也有研究表明，鈣激活酶可以直接裂解細胞凋亡酶而使其失活[29]。因此，宰后肌肉中細胞凋亡酶和鈣激活酶之間是存在相互作用的，并且細胞凋亡酶早于鈣激活酶激活，激活的細胞凋亡酶可通過降解Calpastatin參與鈣激活酶的激活過程，而激活后的鈣激活酶可使細胞凋亡酶失活。這也與宰后肌細胞從凋亡向壞死轉變的推想一致。

2 細胞凋亡酶的主要激活通路

細胞凋亡酶激活是大多數凋亡程序所必需的程序，雖然少數凋亡不需要凋亡酶參與。細胞凋亡酶激活涉及到一系列激活/抑制因子的調控，在細胞受到不同的凋亡刺激時，細胞凋亡酶按不同通路被激活。目前已發現的激活通路主要包括死亡受體通路（外通路）、線粒體通路（內通路）和內質網通路[30]（圖2）。

2.1 死亡受體通路

死亡受體通路主要涉及腫瘤壞死因子受體和接頭蛋白。腫瘤壞死因子受體以三聚體形式存在于細胞表面，具有一個胞外的配體結合結構域，一個單次跨膜結構域和一個膜內的死亡結構域（death domain，DD）。接頭蛋白一端為DD，另一端為死亡效應結構域（death effector domain，DED）。當細胞受到凋亡刺激后，腫瘤壞死因子受體的配體結合結構域與配體結合，并發生構象變化，引起其死亡結構域與接頭蛋白的死亡結構域結合。接頭蛋白另一端 DED募集凋亡啟動酶-8和-10的前體，形成死亡誘導信號復合體，凋亡啟動酶-8和-10的酶原前體互相靠近，發生自我切割而得以活化?；罨蟮牡蛲鰡用?8和-10進一步激活下游的凋亡效應酶-3、-6和-7，并由凋亡效應酶切割特定底物而完成細胞凋亡過程。

2.2 線粒體通路

線粒體通路通常在細胞內部損傷或應激條件下激活。細胞收到凋亡信號后，在Bcl家族蛋白的調控下，線粒體中細胞色素c（cytochrome c，Cyt-c）、第二線粒體來源細胞凋亡酶激活因子（second mitochondriaderived activator of caspase，SMAC）、凋亡誘導因子（apoptosis-inducing factor，AIF）和核酸內切酶 G（endonuclease G，Endo G）等凋亡因子被釋放，釋放至細胞質中的 Cyt-c與凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptotic protease activating factors 1，Apaf-1）結合。Apaf-l有一個CARD（caspase recruitment domain）結構域，一個核酸結合結構域和多個WD40結構域。生理條件下，1個CARD結構域和2個WD40結構域結合，而釋放至細胞質中的Cyt-c由于CARD與WD40結構域結合，從而釋放出Apaf-1的CARD結構域。在ATP/dATP存在下，Apaf-1進一步寡聚化，形成七聚體復合物，即凋亡小體，進而CARD結構域被暴露在外，與凋亡啟動酶-9酶原前體的CARD結構域結合，使凋亡啟動酶-9前體相互靠近，發生自我切割而活化。活化后的凋亡啟動酶-9激活下游的凋亡效應酶-3、-6和-7，導致細胞凋亡。除 Cyt-c外，線粒體釋放出的SMAC可競爭性結合細胞中存在的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP），從而起到對細胞凋亡酶的抑制作用；而AIF和Endo G可不依賴細胞凋亡酶，直接作用于細胞核，導致染色體皺縮和DNA碎片化，這也說明存在獨立于細胞凋亡酶活化的另一條凋亡通路。

2.3 內質網通路

內質網通路是指內質網受到長時間刺激或刺激強度過大時，內質網內大量錯誤蛋白或未折疊蛋白急劇增加，超過細胞生存途徑所能處理的范圍，使內質網內的穩態遭到破壞，導致細胞凋亡。細胞凋亡酶-12在內質網應激誘導的細胞凋亡途徑中具有核心作用，目前關于細胞凋亡酶-12的激活還不確定，主要存在兩種方式：一是Ⅰ型跨膜糖蛋白激酶通過受體分子TRAF2與細胞凋亡酶-12酶原反應，使細胞凋亡酶-12酶原從TRAF2上被釋放，然后經同源二聚化和自動加工過程而激活[31]；二是內質網應激過程釋放的鈣離子，激活鈣激活酶，裂解細胞凋亡酶-12的CARD前肽區域，細胞凋亡酶-12合成的p30亞基被自動加工成活躍的p20和p10亞基。激活后的細胞凋亡酶-12進一步激活凋亡效應酶3，最終導致細胞發生凋亡。

3 線粒體通路是宰后細胞凋亡酶激活的重要路徑

動物被屠宰后，由于氧供應的終止，肌細胞很快處于無氧環境。在這種條件下，肌細胞可能以線粒體通路來進行凋亡[32]。相關試驗結果也表明，宰后肌肉中細胞凋亡酶-9早于細胞凋亡酶-3激活，且兩者之間具有相關性[33]。HUANG等[34]在宰后牛肉中發現線粒體中的Cyt-c可被釋放至胞漿中，并認為Bax可能是調控細胞凋亡的關鍵因子。WANG等[35]在宰后牦牛肉中檢測到線粒體活性氧大量累積、膜電位下降、MPTP開放、Cyt-c釋放、細胞凋亡酶激活等線粒體通路的典型特征。R?NNING等[36]利用原代牛骨骼肌細胞缺氧模型也檢測到了線粒體膜電位的下降和Cyt-c的釋放。這些結果均說明線粒體通路是宰后肌肉細胞凋亡酶的一條重要激活路徑。

3.1 宰后肌肉線粒體凋亡因子的釋放

線粒體是細胞凋亡的決策者和執行者，線粒體內Cyt-c、SMAC等凋亡因子的釋放是線粒體通路凋亡的核心程序，其釋放機理一直是凋亡研究領域的熱點和難點[37]。線粒體具有典型的脂質雙分子膜結構（圖3），包括外膜（OM）和內膜（IM），線粒體內膜中平行于外膜的部分稱為內邊界膜（IBM）；向線粒體基質折疊形成大小和形狀各異的凹陷結構稱為嵴（Cristae），內邊界膜與嵴的連接處是一種狹窄的頸狀結構，稱為嵴連接點（Crista junctions）[38]。早期研究主要認為線粒體膜通透化是引起線粒體凋亡因子釋放的主要原因，主要受Bcl家族蛋白調控。在線粒體膜結構中存在由腺苷轉移酶（ANT）、電壓依賴性陰離子通道（voltage dependent anion channel，VDAC）和親環素D共同組成的線粒體通透性膜通透轉運孔，生理情況下MPTP僅允許相對分子質量小于1.5×103的分子通過，維持線粒體膜內外的電位差。當細胞受到凋亡刺激后，Bcl蛋白家族中的促凋亡成員引發死亡效應物Bax/Bak的寡聚化，形成寡聚復合物并轉移至線粒體外膜，從而引起MPTP開放和線粒體膜電位下降并釋放凋亡因子[39]。WANG 等[35]利用環孢菌素 A（形成MPTP的抑制劑）原位處理宰后牦牛肉后發現，MPTP的開放是造成線粒體膜電位下降和Cyt-c釋放的原因，并可通過激活細胞凋亡酶而改善宰后嫩度。

近期的研究表明，線粒體凋亡因子釋放時，其內膜中的嵴結構會發生明顯變化，主要包括嵴的數量和形狀的改變[40]。有學者發現85%的Cyt-c存在于線粒體嵴結構上，如果外膜通透化直接釋放 Cyt-c，Cyt-c應該可自由通過嵴結構，大量 Cyt-c不可能穩定存在嵴結構上[38]。因此，線粒體凋亡因子釋放除外膜通透化外，還需要線粒體嵴的重構（嵴形態變化、嵴連接點擴大等），打開嵴內部和膜間隙的通道。視神經萎縮蛋白1（optic atrophy1，OPA1）、MICOS復合體等是調控細胞線粒體嵴重構的關鍵因子[41]。另外，線粒體作為高度動態的細胞器，細胞發生凋亡時，其外部形態也會發生改變，可從管狀向顆粒狀轉變，這種顆粒狀結構主要是由線粒體的分裂大于融合所造成[42]。

3.2 宰后肌肉線粒體損傷及對嫩度的調控

動物剛被屠宰放血后，由于氧和營養物質供應的終止，細胞內的氧化/抗氧化平衡體系被打破，ROS大量累積，必然造成肌細胞的損傷[20]。線粒體作為細胞“能量工廠”是ROS產生的主要場所，同時也是最易受ROS攻擊的細胞器。宰后肌肉線粒體會逐漸發生氧化損傷，隨著宰后時間延長，線粒體損傷水平逐漸提升，而嫩度逐步改善，兩者之間具有顯著相關性[35]。同時不同嫩度牛肉的蛋白質組學數據也發現，嫩度較好的肉具有更高的損傷水平[43]。宰后肌肉中線粒體酶（異檸檬酸脫氫酶）活性也與嫩度之間具有極顯著相關性[44]。因此，宰后肌肉線粒體會發生損傷，并可參與宰后肌肉嫩化的調控過程。

線粒體對宰后嫩化過程的調控機理可能涉及兩個方面：（1）宰后早期肌肉中的線粒體仍具有一定的活性，可通過能量代謝影響肌肉 pH的變化，從而調控宰后嫩化過程。MATARNEH等[45]研究發現，離體條件下線粒體可通過增強糖酵解通量、加速ATP水解，而加快pH的下降。該團隊的進一步研究發現F1-ATP合成酶（F1-ATPase）是線粒體發揮這一功能的主要作用者[46]。SCHEFFLER等[47]研究發現，線粒體復合物I、IV、V的抑制劑對宰后牛肉線粒體處理可加速能量代謝和pH下降。這些結果均支持線粒體通過能量代謝影響宰后嫩化過程。（2）除能量代謝外，線粒體在凋亡過程中也發揮重要作用，也可以通過釋放系列凋亡因子，調控細胞凋亡酶活性，從而影響宰后嫩化過程。許多研究已表明宰后線粒體途徑的凋亡可調控細胞凋亡酶活性和其對肌原纖維蛋白的水解，從而影響宰后嫩度變化。

3.3 宰后肌肉線粒體與內質網間可能的相互作用

線粒體在細胞凋亡的啟動和信號擴大過程中發揮重要作用。凋亡過程中線粒體中的鈣離子濃度會升高，過量鈣離子攝入（鈣超載）會導致線粒體發生腫脹、膜電勢降低，繼而觸發凋亡。近年來，凋亡過程中線粒體和內質網之間的互作也廣受關注，這種互作可能調控線粒體-內質網間 Ca2+信號傳導以及細胞凋亡過程。LIU等[48]利用蛋白質組學技術在兔肉骨骼肌中檢測到線粒體和肌漿內質網之間的交聯，并發現VDAC1、VDAC2和VDAC3可能參與了線粒體和內質網交聯體的形成。WANG等[35]發現宰后肌細胞的鈣超載影響MPTP的開放及細胞凋亡過程。HUANG等[49]研究也表明，除鈣激活酶外，鈣離子也可調控細胞凋亡酶活性而影響宰后嫩化過程。鑒于鈣離子在宰后肌細胞凋亡和嫩化過程中的重要作用，內質網作為細胞內儲存鈣離子的主要場所，也可能通過調控鈣離子釋放，從而與線粒體發生交互作用。電鏡結構下可觀察到線粒體和內質網之間存在偶聯結構，并可分離純化出偶聯結構的蛋白復合體 MAMs（mitohcondria associated membrane）[50]。宰后凋亡過程中，MAMs上的 IP3R等鈣離子調控蛋白可能介導內質網上鈣離子的釋放，鈣離子被線粒體攝入超載后，加速線粒體途徑凋亡過程的發生，而凋亡發生后 Cyt-c釋放入胞漿，通過與 IP3R結合并促進其功能，導致更多的鈣離子從內質網向線粒體傳遞，線粒體和內質網間通過鈣離子相互促進，逐步放大凋亡信號。內質網與線粒體間除通過鈣離子發生交互作用外，也有學者發現內質網參與了線粒體分離，從而導致凋亡發生。當線粒體與內質網結構偶聯形成后，內質網“纏繞”線粒體促使局部收縮，并逐步“募集”線粒體分裂相關蛋白Drp1/Dnm1等，最后將線粒體分裂為二[51]。目前，宰后肌細胞中線粒體和內質網是否發生交互及其相關機理的研究還未見相關報道。

3.4 宰后肌肉線粒體與溶酶體間可能的相互作用

線粒體損傷后其“產能”功能也逐漸喪失，從有氧呼吸到無氧酵解，不光造成ATP下降，同時還調控pH的變化。而pH的下降被認為可以破壞溶酶體膜，使組織蛋白酶得以釋放，從而參與嫩化過程[52]。因此，線粒體與溶酶體之間也可能存在交互作用。ZHANG等[53]調查了宰后牛肉溶酶體和線粒體間相互作用，發現線粒體ROS可以通過累積氧化還原活性的鐵離子來破壞溶酶體膜的穩定性，同時溶酶體釋放出的組織蛋白酶可以通過激活線粒體Bax和Bid而加速線粒體膜通透性。

4 細胞凋亡酶對宰后肌肉嫩化的作用

宰后肌肉嫩化是一個復雜的生化過程，涉及到內源酶作用下的細胞骨架及相關蛋白的有限降解。宰后肌細胞以凋亡的形式死亡，細胞凋亡酶被激活，這為其參與宰后嫩化過程提供了前提基礎。但細胞凋亡酶是否貢獻于宰后肌肉嫩化過程還要從其是否參與嫩度相關蛋白的降解來分析。目前有關細胞凋亡酶對宰后肌肉嫩化的相關研究，可歸納為以下幾個方面：

4.1 宰后細胞凋亡酶及相關調控因子與嫩度間的相關性

相關性分析是統計學中的一種重要分析方法。如果一種酶或其相關因子與宰后嫩度的變化存在顯著相關性，則可以從側面反映出這種酶類參與肌肉的宰后成熟過程。宰后細胞凋亡酶活性及相關調控因子與嫩度間的相關性被廣泛研究。KEMP等[54]發現宰后豬肉的細胞凋亡酶-3和-7的活性在宰后2 h達到最高，32 h后其活性快速下降，且其宰后0 h和32 h的活性比與嫩度間存在顯著相關性。CAO等[33]在宰后牛肉中也檢測到細胞凋亡酶活性和剪切力之間存在顯著負相關。ZHANG等[55]在宰后鴨肉中發現細胞凋亡酶活性變化與肌原纖維小片化指數（myofibrillar fragmentation index，MFI）顯著正相關，而與剪切力值顯著負相關。BERNARD等[56]的研究結果也表明抑凋亡因子熱收縮蛋白（heat shock protein，HSP）的基因表達與嫩度之間相關性極為顯著。這些結果表明細胞凋亡酶與宰后肌肉嫩度之間顯著相關，可參與宰后肌肉嫩化過程。然而，也有學者研究認為牛肉中細胞凋亡酶-3的活性逐漸下降，但與剪切力之間無顯著相關性。這些結果之間的不一致性可能與測定方法或不同物種之間的差異有關，畢竟不同動物對宰后應激條件具有不同的應答能力。

4.2 不同嫩度模型下細胞凋亡酶及相關因子變化

比較不同嫩度肌肉模型（不同部位、嫩化加速或抑制）下內源酶及相關因子的變化差異也是肉品領域研究的常用手段。宰后不同嫩度的背最長肌、腰大肌和半腱肌三部位豬肉，雖然mRNA豐度無區別，但具有不同的細胞凋亡酶3/7表達量和活性變化[15]。不同嫩度的相同部位肉也具有不同的細胞凋亡酶及相關調控因子表達，如 LAVILLE等[57]發現宰后嫩度較好的牛肉具有更高的線粒體內外膜蛋白表達量。采用不同的方法加速或抑制宰后嫩化過程后，其細胞凋亡酶及相關調控因子也發生對應的變化。如采用鈣離子注射肌肉加速嫩化過程后，除鈣激活酶加速激活外，細胞凋亡酶的活性及表達量、細胞色素c等凋亡激活因子的表達量也顯著提高，而采用鋅離子注射得到相反的結果[49]。CHEN等[58]利用低頻和高頻超聲處理改善雞肉嫩度時，發現包括細胞凋亡酶加速激活、α-spectrin被凋亡酶降解生成 120 kD特征片段等凋亡級聯反應事件。這些結果說明細胞凋亡酶參與了宰后肌肉嫩化過程，改善嫩度。

4.3 細胞凋亡酶抑制/誘導劑對宰后肌肉肌原纖維蛋白原位降解的影響

肌原纖維蛋白的有限降解是肌肉宰后嫩度改善的主要原因，利用內源酶的專一性抑制劑或誘導劑對宰后肌肉注射/浸泡處理，并分析其對肌原纖維降解的影響是探討肌肉凋亡酶是否參與宰后嫩化過程的有力證據。HUANG等[59]發現細胞凋亡酶-3專一性抑制劑DEVD-CHO可明顯抑制雞肉伴肌球蛋白、伴肌動蛋白、肌間線蛋白的降解和肌鈣蛋白-T 28—30 kD特征降解產物的生成，同時該抑制劑對鈣激活酶的活性無顯著影響。隨后HUANG等[60]利用細胞凋亡酶-6的專一性抑制劑 VEID-CHO處理雞胸肉也得到相似的結果，并揭示出該抑制劑在宰后早期能抑制肌纖維結構的弱化。CHEN等[16]發現細胞凋亡誘導劑喜樹堿和依托泊苷可加速宰后肌肉中細胞凋亡酶-3和-7的激活，提高肌鈣蛋白-T嫩度特征降解產物28—30 kD片段的含量，并加速肌纖維結構中A帶和I帶的弱化。這些結果說明，細胞凋亡酶的抑制劑或誘導劑可以影響肌原纖維蛋白的降解和肌纖維結構的變化，原位模型下揭示了細胞凋亡酶參與宰后肌肉嫩化過程。

4.4 細胞凋亡酶對宰后肌肉肌原纖維蛋白的體外降解

判斷一種肌肉內源酶是否參與宰后嫩化過程的一個重要標準，就是該酶在體外最佳條件下能否模擬自然成熟條件下肌原纖維蛋白的降解變化。體外降解模型可排除肌肉內一系列內源酶和各種激活/抑制因子的干擾作用，在宰后肌肉嫩化領域被廣泛使用。KEMP等[61]利用活性細胞凋亡酶-3體外孵育豬肉肌原纖維蛋白，利用MALDI-TOF（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight）質譜檢測到肌球蛋白輕鏈、肌鈣蛋白-T和肌動蛋白分別降解生成18、28和32 kD的產物，并通過Western發現該酶引起肌間線蛋白降解。HUANG等[62]利用活性細胞凋亡酶-3體外孵育雞肉肌原纖維蛋白，發現該酶能降解伴肌球蛋白和伴肌動蛋白，且降解變化與自然成熟過程相似，但不能導致肌間線蛋白降解，也不能使肌鈣蛋白-T降解生成28—30 kD的降解產物。MOHRHAUSER等[63]用重組細胞凋亡酶-3體外降解牛肉肌原纖維蛋白，但沒檢測到伴肌球蛋白、伴肌動蛋白、肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的任何降解產物。HUANG等[64]比較了離體條件下細胞凋亡酶-3、-6對牛肉肌原纖維蛋白降解，發現細胞凋亡酶-3可模擬伴肌球蛋白和伴肌動蛋白降解，不能降解肌間線蛋白，而凋亡效應酶6能夠模擬肌間線蛋白部分降解產物。

綜上分析，細胞凋亡酶主要在宰后早期被激活，可參與宰后嫩化過程中部分肌原纖維蛋白的有限降解，但隨著宰后時間延長，可能由于ATP的耗盡或其他因子作用導致細胞凋亡酶失活，從而使其只參與宰后早期的嫩化過程。因此，細胞凋亡酶和肉中其他內源酶一起參與蛋白質降解，改善嫩度，宰后嫩化是多種內源酶協同作用的結果。

5 結論與展望

宰后細胞死亡和肌肉嫩化是兩個高度相關的過程，在宰后肌肉嫩化的同時，伴隨著肌細胞的逐漸死亡，兩個生化過程最終都是通過內源酶對蛋白質的降解來完成。宰后僵直前期，肌細胞可能在生（自噬）與死（凋亡）之間選擇，早期細胞以自噬方式進行自我保護，但隨著ROS對細胞的損傷及ATP含量降低，最終細胞選擇以凋亡的形式死亡，凋亡過程可能持續至整個僵直期和成熟早期。隨著成熟時間的延長，除細胞凋亡外，壞死也可能參與其中，宰后肌細胞可能以多種死亡方式并存的狀態完成死亡程序，死亡方式間的轉化可能受細胞內能量變化和線粒體通透性轉換孔開放狀態所調控。未來宰后嫩化機制的研究可以在已發現的內源酶有限降解肌原纖維蛋白的基礎上，進一步從內源酶激活通路及各通路間的相互銜接方面，構建宰后肌肉嫩化的生化調控網絡，以便對宰后肌肉嫩度進行系統調控。