基于“脾腎相關”理論防治模擬失重大鼠Wnt信號通路介導的骨形成機制研究

王榮 張林

遼寧中醫藥大學中醫學院，遼寧 沈陽 110847

隨著載人航天事業發展，航天員在空間飛行期間發生的持續性骨質減少、鈣磷再分布和代謝負平衡、骨骼生物力學性能降低等綜合表現，嚴重影響航天員在軌工作和回到地面后的身體健康水平[1]。采用尾部懸吊模擬失重造成的廢用性骨丟失是現代比較常用的研究方法[2]。基于中醫“腎主骨”“脾腎相關”理論，探究健脾方與補腎方防治模擬失重骨丟失的相互作用及其促進骨形成的經典Wnt信號通路作用機制，為尋求有效防治廢用性骨質疏松癥的中醫治法和方劑提供研究思路和理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物：健康Wistar雄性大鼠50只，SPF級，體重(200±20) g[購于遼寧長生生物科技有限公司，動物生產許可證號：SCXK(遼)2015-0001]，飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心，自由進食水，適應性喂養7 d。

1.1.2方藥制備：健脾方由生曬參、生黃芪等組成，補腎方由鹿茸、淫羊藿等組成，補腎健脾方為補腎方與健脾方的合方，全部藥材購自北京同仁堂遼寧有限責任公司。方中鹿茸打碎，過100目篩兌入藥液，3個方中其余藥物均采用常規水煎煮法提取，將所得全部藥液混合依次濃縮成0.45 g/mL、0.34 g/mL、0.79 g/mL，每個方均得到560 mL藥液備用。

1.1.3主要試劑：β-actin抗體(CST，批號：4970 s)；GAPDH抗體(ABclonal，批號：AS003)；ALP抗體(proteintech，批號：11187-1-Ap)；SPARC抗體(proteintech，批號：15274-1-Ap)；ATF4抗體(Absci，批號：#AB32007)；SFRP2抗體(Proteintech，批號：66328-1-lg)；Kremen2抗體(ABclonal，批號：A16202)；DKK-1抗體(R&D，批號：AF4010)；抗體(Absci，批號：#AB21212)；二抗羊抗鼠(ABclonal公司，批號：AS003)；二抗驢抗羊(Abbkine，批號：A21060)；二抗羊抗兔(CST，批號：7074p2)。

1.1.4主要儀器：Multiskan Fc酶標儀(賽默飛上海儀器有限公司)、Tanon5200全自動數碼凝膠圖像分析系統(上海天能科技有限公司)、X射線骨密度測定儀(法國Diagnostic Medical System SA)、CTM2050S萬能拉力試驗機(上海能共實業有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及處理：所有大鼠依據體重分層后按每組10只隨機分組，分成空白對照組、尾吊組、健脾組、補腎組、補腎健脾組。除空白對照組外，全部大鼠采用尾部懸吊法造模，前肢著地后肢懸空，身體長軸與地面呈30°角，同時對中藥干預各組大鼠予以相應健脾方、補腎方、補腎健脾方灌胃，空白對照組與尾吊組用相同體積蒸餾水灌胃，各組大鼠每日灌胃一次，每次2 mL。實驗第28天稱重后處死大鼠并在無菌環境下取大鼠的雙側股骨和脛骨并稱骨重，于-80 ℃保存。

1.2.2計算股骨和脛骨骨重與體重比值：結果以大鼠骨重與體質量的比值(mg/g)表示。

1.2.3股骨和脛骨骨密度的測定：將各組骨樣本置于X射線骨密度測定儀內，測定大鼠離體骨骨密度，以單位面積的骨礦物質含量(g/cm2)表示骨密度值。

1.2.4股骨和脛骨生物力學性能測定：測量試樣中點(受壓點)的直徑，測試時將樣本放置在萬能拉力試驗機上，兩個橫桿之間距離為20 mm，以3 mm/min的速率勻速加載至標本斷裂，由力學測試機自帶軟件記錄載荷-變形曲線并分析數據。觀察各標本股骨和脛骨最大應力、抗彎強度和斷裂力等骨生物力學指標的變化情況。

1.2.5Western blot法檢測脛骨和股骨中ALP、SPARC、ATF4、β-catenin、DKK1、Kremen2、SFRP2蛋白表達：每組隨機抽取一只大鼠脛骨，液氮研磨大鼠脛骨至粉末狀，冰上裂解，蛋白變性后以每泳道60 μg蛋白上樣，電泳，轉膜，封閉，孵育對應一抗4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min, 孵育對應二抗，洗膜，ECL法曝光，用 AlphaView SA軟件對條帶進行灰度分析，以β-actin和GAPDH作內參，計算各組骨蛋白的相對表達量，實驗重復3次。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠脛骨和股骨與體重比值、骨密度的變化情況

與空白對照組比，尾吊組大鼠脛骨和股骨與體重比值、骨密度顯著降低(P<0.01)；與尾吊組比，健脾組、補腎組大鼠脛骨和股骨與體重比值、骨密度升高(P<0.05)，補腎健脾組大鼠的脛骨和股骨與體重比值、骨密度顯著升高(P<0.01)；與補腎健脾組比，補腎組和健脾組大鼠的脛骨和股骨與體重比值、骨密度降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠脛骨和股骨與體重比值、骨密度比較Table 1 Comparison of ratio of tibia and femur to body weight and bone mineral density between rats in each group n=10)

2.2 各組大鼠股骨和脛骨力學性能的變化情況

與空白對照組比，尾吊組大鼠股骨和脛骨最大應力、抗彎強度、斷裂力降低(P<0.05)；與尾吊組比，健脾組大鼠股骨和脛骨最大應力、抗彎強度升高(P<0.05)，脛骨斷裂力升高(P<0.05)，補腎組股骨最大應力、抗彎強度、斷裂力升高(P<0.05)，脛骨抗彎強度升高(P<0.05)，補腎健脾組大鼠股骨和脛骨最大應力、抗彎強度、斷裂力升高(P<0.05)；與補腎健脾組比，健脾組和補腎組大鼠股骨最大應力、抗彎強度、斷裂力降低(P<0.05)，補腎組大鼠脛骨最大應力、斷裂力降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠股骨和脛骨力學性能變化情況Table 2 Changes of mechanical properties of the femur and tibia in each group n=8)

2.3 各組大鼠脛骨骨形成相關蛋白的變化情況

與空白對照組比，尾吊組大鼠脛骨中ALP、SPARC、ATF4蛋白表達量顯著降低(P<0.01)；與尾吊組比，健脾組和補腎組大鼠脛骨中ALP、SPARC、ATF4蛋白表達量升高(P<0.05)，補腎健脾組大鼠脛骨中ALP、SPARC、ATF4蛋白表達量顯著升高(P<0.01)；與補腎健脾組比，健脾組和補腎組大鼠脛骨中ALP、SPARC、ATF4蛋白表達量降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠脛骨中成骨相關蛋白表達情況Fig.1 Expression of osteogenic related protein in the tibia of rats in each group n=3)注：A：空白對照組；B：尾吊組；C：健脾組；D：補腎組；D：補腎健脾組。與空白對照組比，**P<0.01；與尾吊組比，#P<0.05，##P<0.01；與補腎健脾組比，▲P<0.05。

2.4 各組大鼠脛骨經典Wnt信號通路相關蛋白的變化情況

與空白對照組比，尾吊組大鼠脛骨β-catenin、 SFRP2蛋白表達量顯著降低(P<0.01)，DKK1、Kremen2蛋白表達量顯著升高(P<0.01)；與尾吊組比，健脾組和補腎健脾組大鼠脛骨β-catenin蛋白表達量顯著升高(P<0.01)，補腎組和補腎健脾組大鼠脛骨SFRP2蛋白表達量顯著升高、DKK1蛋白表達量顯著降低(P<0.01)，健脾組、補腎組和補腎健脾組大鼠脛骨Kremen2蛋白表達量降低(P<0.05)；與補腎健脾組比，補腎組大鼠脛骨β-catenin蛋白表達量降低、Kremen2蛋白表達量升高(P<0.05)，健脾組大鼠脛骨SFRP2蛋白表達量降低、DKK1蛋白表達量升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠脛骨中經典Wnt通路相關蛋白表達情況Fig.2 Expression of Wnt pathway related proteins in the tibia of rats in each group n=3)注：A：空白對照組；B：尾吊組；C：健脾組；D：補腎組；D：補腎健脾組。與空白對照組比，**P<0.01；與尾吊組比，#P<0.05，##P<0.01；與補腎健脾組比，▲P<0.05。

3 討論

祖國醫學將廢用性骨質疏松歸于“骨痿”之列，認為由于廢用日久“久臥傷氣”和飲食不調，造成脾氣虧虛，脾虛及腎，脾虛后天水谷精微不能充養腎精，骨枯髓減發為骨痿[3]。同時，體液分布與正常站立時不同[4]，下肢氣血供應不足，出現氣隨陽亢，腎氣封藏失職，“髓不生骨”，并且腎不溫煦后天脾土，則脾胃運化無力，又會加重骨痿，故脾腎虧虛是骨痿發病的主要病機。“脾腎相關”理論溯源于《素問·五臟生成篇》：“腎之合骨也，其榮發也，其主脾也”，揭示了腎與脾在人體骨骼強健等生命活動的相互協作作用。而李中梓高度概括出脾腎并重的“腎為先天之本，脾為后天之本”觀點。

經典Wnt信號通路又稱Wnt/β-catenin信號通路，在成骨細胞增殖分化過程中發揮重要地位，其主要環節為核心因子β-catenin量的積累，DKK1是通路的抑制劑，通過直接結合LRP5/6受體或與跨膜蛋白Kremen1/2形成三元復合物，阻斷向胞內傳遞Wnt信號，從而抑制骨形成降低骨量[5]。SPARC蛋白抑制脂肪形成并促進成骨細胞分化，增強經典Wnt信號通路傳導[6]。ATF4基因對促進成骨細胞分化和維持骨韌性很重要，其缺失細胞中β-catenin蛋白的水平也降低[7]。

本研究發現，大鼠經尾部懸吊28 d后，承重骨骨密度、生物力學性能下降，證明骨質丟失造模成功。本研究還觀察到脛骨ALP、SPARC、ATF4、β-catenin、SFRP2蛋白表達降低，DKK-1、Kremen2蛋白表達升高，提示尾吊造成大鼠骨丟失，經典Wnt信號通路受抑制。Bullock等[8]的研究與本研究的結果相似，在尾吊和肉毒素造成的廢用性骨質疏松動物模型中，經典Wnt途徑中細胞內信號轉導節點β-catenin發揮重要作用。本研究采用健脾方、補腎方、補腎健脾方干預尾部懸吊大鼠28 d后，各給藥組大鼠承重骨骨密度、生物力學性能、脛骨ALP蛋白表達水平都有不同程度升高，說明3種治法有促進尾吊模型大鼠骨形成的作用，由于補腎健脾方作用強于健脾方和補腎方，推測健脾方與補腎方可能存在協同作用。結果還顯示，健脾組、補腎組和補腎健脾組大鼠股骨DKK-1和Kremen2蛋白表達減少，同時SPARC、ATF4、β-catenin、SFRP2蛋白表達增加，說明三首方劑均可激活經典Wnt信號通路，促進骨形成以修復骨丟失。SFRP2蛋白對骨代謝呈現出不同的作用。有研究發現SFRP2基因促進BMSCs存活以對抗氧化應激[9]，這與本研究結果趨勢一致。然而，Jin等[10]研究發現SFRP2在體內外均通過增強β-catenin磷酸化并降低核內表達以抑制經典Wnt信號傳導，但是SFRP2不影響DKK1的表達，因此SFRP2在尾部懸吊骨丟失模型中的作用規律尚需進一步研究。本研究發現β-catenin、Kremen2蛋白的表達在健脾組和補腎健脾組無統計學差異，DKK1、SFRP2蛋白的表達在補腎組和補腎健脾組無統計學差異，但都以補腎健脾組為最優，提示補腎方與健脾方對經典Wnt信號通路上蛋白的調控靶點略有差異，具有相互促進作用，體現了特定藥效條件下中藥復方的多靶點作用特點。