激活BMP信號的骨細胞對骨髓基質細胞成骨及成脂分化的作用研究

趙怡心 曾繼濤 涂小林 劉宏*

1.重慶醫科大學附屬第一醫院生殖健康與不孕癥中心，重慶 400016 2.西南醫院生殖醫學中心，重慶 400016 3.重慶醫科大學生命科學研究院骨發育與再生實驗室，重慶 400016

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)自被發現以來，已有大量證據表明其信號對骨骼、心血管，神經系統等的發育途徑至關重要。早在19世紀60年代BMP被發現及命名以來[1]，BMP逐漸被應用于治療骨不連、骨折等疾病[2-4]，生物智能材料也多使用BMP配體作為骨生成的誘導因子[5]，然而目前BMP2、BMP7等僅僅作為治療骨折骨不連藥物，而未被作為增骨藥物使用，其體內增骨作用仍未得到證明。此外，隨著BMP大量應用于臨床，其副作用如增加傷口引流時間，引起骨過多增長甚至引起骨肉瘤及異位骨化也值得注意[6]，同時也有研究表明BMP作用于成骨細胞會抑制骨生成[7]。因此如何合理應用BMP治療臨床疾病是目前研究熱點。

BMP屬于轉化生長因子-β超家族， 信號的傳導由相關BMP配體與Ⅰ型受體和Ⅱ型受體組成的受體復合物結合，激活下游信號傳導，信號通路主要包括：磷酸化Smad1//5/8與通用smad即Smad4結合激活的經典信號通路及激活MAPK和p38下游的非經典信號通路[8]，最后會導致下游靶基因ID1、ID2及其他信號基因的激活[9]。

骨細胞是骨組織中的主要細胞，長期包埋于礦化的骨基質中，是成骨發育的終端。早先骨細胞被認為是一種“靜止細胞”，不影響骨形成及穩態，然而過去的十幾年提供了大量關于骨細胞的分子生物學和功能的研究。骨細胞具有多種功能，如通過調節破骨細胞和成骨細胞的活性來調節骨重建，同時還具有內分泌細胞的功能來調節遠端如腎臟、肌肉等組織器官[10]。敲除骨細胞中Wnt信號導致小鼠骨形成缺陷等研究表明靶向調控骨細胞能夠逆向調控骨形成，表明骨細胞中的信號變化能逆向調控成骨分化過程[11]。

BMP受體特異性激動(FK506)[12]被多項研究證實可以通過結合FKBP12蛋白從而阻止FKBP12蛋白與BMPR1A受體結合，從而促進BMP信號的傳導[12]。因此筆者利用該藥物激活MLO-Y4骨細胞中BMP信號，除去藥物對ST2的影響，收集條件培養基進行ST2細胞成骨分化實驗。旨在研究激活骨細胞中BMP信號對成骨分化及成脂分化的發育過程的影響，進一步了解骨細胞中BMP對骨髓基質細胞分化發育過程的逆向調控，為骨細胞靶向治療及藥物研發提供新的研究基礎材料與方法。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠骨樣細胞MLO-Y4細胞系、小鼠骨髓基質細胞ST2細胞由美國Lynda Bonewald教授贈予。αMEM培養基購自美國賽默飛世爾科技公司；胎牛血清購自加拿大Wisent公司；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒均購自上海碧云天生物工程公司。Cell Counting Kit-8 (CCK-8)檢測試劑盒購自美國bimake公司。磷酸化Smad5一抗購自杭州華安生物技術有限公司；βcatenin一抗購自美國CST公司；二抗購自武漢三鷹生物科技有限公司。逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購買于寶日醫生物技術有限公司；TrizolRNA抽提液購買于賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1小鼠骨樣細胞MLO-Y4培養上清的提取：①當100 mm培養皿MLO-Y4細胞達到80%時，加入DMSO、FK506，分別使DMSO濃度為0.5‰，藥物濃度達到5 μmol/L，培養24 h；②24 h后，吸棄含有藥物的培養基，PBS液清洗2遍，加入4 mL無血清培養基；③繼續培養24 h，收集上清，4 ℃離心，1 200 r/min，5 min；③分裝保存于-80 ℃超低溫冰箱；使用時用新鮮完全培養基稀釋至20%進行干預實驗。

1.2.2堿性磷酸酯酶染色：將ST2細胞按照4×104/孔接種于24孔板中，在DMSO組、 FK506組分別添加1 mL含0.5‰DMSO的αMEM 完全培養基、含5 μmol/L FK506的αMEM完全培養基。待其生長3 d細胞進行ALP 染色。每組實驗重復3 次。

1.2.3RNA抽提，逆轉錄及qPCR檢測：DMSO和FK506作用MLO-Y4細胞收集上清，使用時用新鮮完全培養基稀釋至20%作用ST2，培養3 d后，使用Trizol試劑提取細胞總RNA，測得RNA濃度后，按照逆轉錄試劑盒得到cDNA。使用測定相應目的基因mRNA的轉錄水平。所有樣本以GAPDH的表達水平作標準。測定引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 The primer sequences of qPCR

1.2.4Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測MLO-Y4細胞活力：將MLO-Y4細胞以8 000/孔接種于96孔板中，按上述組別分別加入含有0.5‰DMSO、0.5 μmol/L FK506的100 μL體積培養液，24 h后吸棄培養基，PBS清洗兩遍，每孔加入100 μL新鮮完全培養基及10 μL CCK8溶液，繼續培養4 h后，檢測在波長450 nm處每孔的光密度值(OD值)，按照細胞活力*(%)=[A(藥物+)-A(空白)] / [A(藥物-)-A(空白)] ×100%計算細胞活力值。每組實驗重復3次。

1.2.5蛋白免疫印跡檢測蛋白表達：提取蛋白，BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，檢測ST2細胞中β-catenin、p-smad5的表達，電泳后，轉膜，封閉2 h，敷一抗過夜，洗膜10 min，重復3次。然后室溫孵育二抗2 h，洗膜3次，每次10 min。最后顯影。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17統計軟件，計量資料以均數±標準差表示，組間差異比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 FK506增強骨細胞MLO-Y4內BMP信號但不影響MLO-Y4活性。

0.5‰DMSO和5 μmol/L FK506作用于MLO-Y4細胞24 h后，使用CCK8檢測試劑盒檢測24 h后MLO-Y4細胞活性，與對照組相比，該藥物濃度不會造成MLO-Y4細胞毒性作用(P>0.05)(圖1A)。qPCR檢測BMP信號靶基因，與對照組相比，FK506組MLOY4細胞內ID1、ID2 mRNA相對表達量上升(P<0.001)(圖1B)。該結果提示FK506可以在不影響MLO-Y4細胞活性的狀態下激活MLO-Y4細胞內的BMP信號。

圖1 FK506對MLO-Y4細胞活力及BMP信號靶基因變化的影響A：CCK8檢測細胞活力圖；B：qPCR檢測BMP信號靶基因ID1，ID2mRNA相對表達量；注：與DMSO組對比，**P<0.001。Fig.1 Influence of FK506 on MLO-Y4 cell activity and the change of BMP signal target genesA：CCK8 was used to detect cell viability；B：QPCR was used to detect the relative expression of BMP signal target genes Id1 and Id2

2.2 BMP信號激活的MLO-Y4培養上清液增強ST2細胞ALP活性及成骨礦化

將不同處理組MLO-Y4細胞培養上清以20%比例混入新鮮完全培養基處理ST2細胞3 d后，進行ALP染色，結果顯示FK506條件培養基組染色較對照組顏色加深，見圖2。以上結果提示使用BMP信號激活的MLO-Y4細胞培養上清促進ST2成骨分化。

圖2 MLO-Y4細胞培養上清作用ST2堿性磷酸酶染色圖(孔板，×200)Fig.2 ALP staining of ST2 cells after cultured with supernatant from MLO-Y4 culture (plate, ×200)

2.3 BMP信號激活的MLO-Y4培養上清液增強ST2細胞成骨細胞標志物表達

利用qPCR檢測BMP信號激活的MLO-Y4細胞培養上清對成骨分化相關標志物ALP、Runx2、OCN、BSP的mRNA表達變化，結果顯示，與對照組相比，FK506條件培養基組成骨標志物均顯著升高(P<0.001)(圖3)。該結果與ALP染色結果均一致，進一步證明了BMP信號激活的MLO-Y4細胞培養上清能夠促進ST2成骨分化。

2.4 BMP信號激活的MLO-Y4培養上清液抑制ST2細胞成脂標志物表達

成脂相關標記基因PPARγ及C/EBP 表達在各組中也有差異，FK506條件培養基組ST2細胞PPARγ、C/EBP表達量均下調(P<0.001)(圖4)。說明BMP信號增強的MLOY4細胞上清抑制ST2細胞成脂分化。

2.5 ST2細胞內Wnt及BMP信號變化

檢測成骨兩個關鍵信號Wnt信號和BMP信號在ST2細胞內的變化，通過Western blotting確定Wnt信號下游信號β-catenin，BMP信號下游信號磷酸化smad5蛋白表達差異，β-catenin蛋白表達量較對照組升高(P<0.05)，p-smad5蛋白表達量較對照組無顯著性差異(P>0.05)(圖5)。

圖3 qPCR檢測BMP信號激活的MLO-Y4細胞培養上清對ST2細胞成骨分化相關標志mRNA表達的影響Fig.3 Detection of osteogenic differentiation marker gene in ST2 cells after cultured with supernatant from BMP signal-activated MLO-Y4 culture with qPCR注：與DMSO組對比，**P<0.001。

圖4 ST2細胞成脂分化標志基因檢測Fig.4 Detection of osteogenic differentiation marker gene in ST2 cells注：與DMSO組對比，**P<0.001。

圖5 ST2細胞內β-catenin及p-smad5蛋白水平變化Fig.5 Changes of protein levels of β-catenin and p-smad5 in ST2 cells注：與DMSO組對比，*P<0.05。

3 討論

骨發育與再生受到多種信號通路調控，例如Wnt、Notch以及BMP信號等。BMP信號通過調節細胞增殖、分化和凋亡，在機體的發育和維持中發揮關鍵作用。目前已有多項研究表明BMP信號參與整個骨發育過程，早期敲除肢體芽間充質中的BMPR1A導致小鼠細胞增殖減少，肢體縮短，幾乎完全不發育；使用在Prx1-CreERT小鼠模型中敲除間充質干細胞中的BMPR1A發現小鼠松質骨皮質骨均降低，提取基因敲除小鼠BMSC發現其成骨能力降低[13]；但是也有研究發現使用Col1-Cre系統敲除成骨細胞中的BMPR1A后，Kamiya等[14]發現成骨細胞中的BMP信號可以通過上調Wnt信號抑制劑SOST的表達來負向調控骨量，后期其團隊又通過DMP1-Cre敲除小鼠骨細胞中BMPR1A，發現小鼠骨量、骨密度和機械強度顯著增加[15]。由此從干細胞分化發育到骨細胞的過程中，BMP都具有一定的調控作用。但由于在Kamiya團隊所使用的DMP1-Cre小鼠的啟動子在骨細胞和成骨細胞均有表達，并不能分辨骨細胞在其中扮演的角色，因此骨細胞中BMP信號的作用研究仍需進一步進行。

本研究采取體外細胞實驗，使用小鼠骨細胞系MLO-Y4細胞進行研究，排除了成骨細胞的影響，使用BMP信號激動劑FK506激活MLO-Y4細胞中的BMP信號后，移除藥物，繼續培養24 h，收集培養上清液，測定其對ST2細胞成骨分化的影響。由于本實驗使用的DMSO濃度為0.5‰，不影響細胞的增殖分化因此作為對照組。BMP信號激活的MLO-Y4上清可以促進ST2細胞成骨分化。提示激活BMP信號的骨細胞可以通過分泌相關細胞因子或蛋白作用于骨髓基質細胞。

為了進一步探究ST2細胞成骨分化的機制，本研究探討了成骨分化過程Wnt信號和BMP信號這兩個重要的關鍵信號。之前有報道BMP2可以刺激ST2細胞分泌Wnt5a、Wnt2b、Wnt6[16]，骨細胞激活BMP信號后是否會產生類似效應。本研究通過檢測兩種信號通路下游相關蛋白表達，發現Wnt下游信號β-catenin表達量上調，MLO-Y4細胞BMP信號被激活后會分泌相關因子，而該因子可以激活ST2細胞中Wnt信號通路而促進其成骨分化。

干細胞可以向多種類型細胞分化，從而形成一個完整的個體，包括成骨、成脂分化和成血管分化等。各種分化方向之間受到精密的調控，此消彼長或相互協調。而信號調節通常以成骨降低為代價誘導脂肪形成，反之亦然[17]。除了成骨分化發育方向，骨髓基質細胞還可以朝著成脂方向發展，本研究檢測了ST2細胞的成脂標志基因的表達量，發現BMP信號激活的MLO-Y4細胞培養上清抑制ST2細胞成脂分化標志基因的表達。說明骨細胞中BMP信號主要促進成骨分化，抑制成脂方向分化。

目前，BMP2、BMP7已經被FDA批準用作骨折、骨不連的治療藥物，但是該藥物存在隱患，例如骨增長過多，神經病變等并發癥。同時，BMP的增骨作用并未應用于治療骨質疏松等全身性骨量降低的疾病，本研究提供了靶向骨細胞激活其BMP信號促進成骨的新策略，為臨床BMP應用治療進一步發展提供方向。