基于網絡藥理學研究杜仲治療骨質疏松性骨折的作用機制

門志濤 徐敏 黃承軍 萬雷 馬江濤 黃宏興, 黃紅，*

1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006 2.柳州市中醫醫院，廣西 柳州 545001 3.廣州中醫藥大學第三附屬醫院，廣東 廣州 510378

骨質疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)是指在低能量暴力的情況下引起的骨折，骨質疏松癥一旦發生骨折，其后果往往非常嚴重，尤其對一些高齡患者來說，有些部位的骨質疏松性骨折可能是致命的打擊，甚至有人稱它為“人生最后一次骨折”。據2018年10月份國家衛生健康委發布的有關骨質疏松癥流行病學調查顯示，中國每年骨質疏松性骨折的發病率超過9%，呈逐年增高的趨勢[1]。

目前抗骨質疏松的藥物以西藥為主，但西藥胃腸道反應較大，存在過敏、癌變風險，以及費用比較昂貴等缺點。越來越多的研究表明，中醫藥對骨質疏松性骨折不僅可以顯著提高骨量和增加抗骨折能力，而且能夠有效緩解其他合并癥，其對全身整體的調節作用是中醫藥最佳優勢所在[2]。中藥療法逐漸成為治療骨質疏松性骨折安全、有效、價廉的療法之一，隨著現代醫學技術的不斷發展和完善，有學者通過研究發現運用單味中藥有效成分提取物的療效與中藥復方療效近似，這樣能解決一部分中藥服用劑量大的弊端，同時還能夠全面地調節機體功能狀態而達到治療的目的，為骨質疏松性骨折開辟多靶點治療的途徑。

在我國，杜仲已廣泛應用于骨質疏松性骨折的防治。杜仲是我國傳統的名貴中藥，屬杜仲科的植物，性味甘、微辛，性溫，中醫認為杜仲具有強筋壯骨、補益肝腎、調理沖任、固經安胎之效[3]。有學者對杜仲的有效化學成分進行了深入研究[4]，這些有效成分具有抗骨質疏松、高血糖、高血壓等多種藥理作用，而且杜仲有副作用小，價格低廉的優點，但目前針對杜仲的藥理研究基本上是針對杜仲提取物，而對其有效成分、生物活性以及作用機制的研究不甚明確，一定程度上阻礙其利用和推廣，因此，對杜仲藥理學的進一步研究意義重大。

本研究利用網絡藥理學原理及方法[5-6]，篩選鑒定杜仲的有效成分、杜仲治療骨質疏松骨折的靶標，并對篩選得出的靶標進行功能和通路富集分析，為今后骨質疏松性骨折的臨床治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的數據庫和分析平臺有：中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)，2.3(版本)； GeneCards數據庫，4.9(版本)；OMIM數據庫；Cytoscape軟件，3.7.2(版本)； Bioconductor數據庫，3.8(版本)；Perl軟件，5.26.3(版本)；R語言軟件，3.5.3(版本)；UniProt數據庫。

1.2 方法

1.2.1杜仲有效成分篩選和藥物靶點的提取：首先利用TCMSP平臺，設置檢索詞為“杜仲”，對中藥杜仲中所含有的有效成分進行篩選，過濾條件[7]為藥物類藥性>0.18(表1)，口服生物利用度>30%。對相關有效成分利用Perl軟件進行藥物靶點的提取。

1.2.2添加杜仲基因靶標名：利用Perl 5.28.1軟件和UniProt數據庫為篩選出的基因靶標添加靶標名。

1.2.3骨質疏松性骨折疾病相關靶點的獲取：利用GeneCards和OMIM數據庫對骨質疏松性骨折進行疾病靶標檢索，檢索詞為“osteoporotic fracture”和“osteoporosis fracture”。

1.2.4構建杜仲-骨質疏松性骨折靶標：應用R語言軟件對中藥杜仲的作用靶標和骨質疏松性骨折相關的基因靶標取交集處理，獲得杜仲-骨質疏松性骨折共同靶標的Venny圖(圖1)。

1.2.5中藥-疾病-靶標相互作用網絡的建立：利用Perl 5.28.1軟件對杜仲靶標和杜仲-骨質疏松性骨折疾病靶標進行逐一對應，再利用Cytoscape軟件繪制中藥-疾病-靶標互作網絡，得到中藥-成分-疾病-靶標調控思維網絡圖(圖2)。

1.2.6構建杜仲-骨質疏松性骨折疾病靶標蛋白相互作網絡和篩選關鍵核心靶標：將中藥-疾病靶標輸入STRING 11.0在線軟件中，設置最小互作分數值為0.4，篩選種屬為人，利用軟件自動繪制杜仲-骨質疏松性骨折疾病靶標蛋白相作網絡圖(圖3)，并生成數據文件結果，將結果利用R語言軟件進行計算，得出杜仲-骨質疏松性骨折疾病靶標蛋白互作網絡關鍵核心靶標的柱狀圖(圖4)。

1.2.7GO和KEGG富集分析：對中藥-疾病靶標進行“R語言”計算，得到GO功能富集分析結果(圖5)和KEGG通路富集分析結果(圖6)，以P<0.05為閾值。

表1 杜仲有效成分篩選結果

2 結果

2.1 中藥杜仲所含有效成分和靶標預測的結果

利用TCMSP計算系統生物學實驗室對杜仲的有效成分及其相關靶標進行篩選，發現杜仲的有效成分有120個，獲得相關靶標有1 487個。通過對OB和DL參數進行設置后進行人工篩選，結果得到杜仲的有效成分有28個，對應的靶標有533個。

2.2 構建的杜仲-骨質疏松性骨折疾病靶標結果

得到杜仲-骨質疏松性骨折疾病共同靶標的Venny圖(圖1)，骨質疏松性骨折疾病相關靶標2 231個，杜仲靶標98個，中藥-疾病靶標59個。

圖1 中藥-疾病靶標Fig.1 TCM-disease target

2.3 構建的中藥-疾病-靶標相互作用網絡結果

圖2中每個圓點代表一個基因或蛋白，圓點間連線顏色的不同代表聯系，如黃色代表文本挖掘證據，藍色代表蛋白同源性證據等。

圖2 中藥-疾病-靶標相互作用網絡Fig.2 The regulatory network of TCM- disease-target

圖3中青色代表骨質疏松性骨折，藍色代表的是中藥-杜仲，紫色代表的是杜仲所含有的有效成分，綠色則代表杜仲-骨質疏松性骨折共同的靶標。杜仲中有19種有效成分可作用于骨質疏松性骨折的59個基因靶標上。

圖3 中藥-疾病靶標蛋白相互作用網絡Fig.3 The protein-protein interaction network of the TCM-disease target

2.4 構建杜仲-骨質疏松性骨折疾病靶標蛋白互作網絡和篩選關鍵核心靶標的結果

從圖4中看出，杜仲與骨質疏松性骨折疾病核心基因相關度由高到低依次為：ALB、CASP3、MAPK8、VEGFA、EGFR、ESR1、MYC、CCND1、FOS、AR、CTNNB1、ERBB2、NOS3、PPARG、RELA、NR3C1、AHR、CAV1、PGR、CASP9、HIF1A、ICAM1、CCNB1、CYP3A4、IGF2、PARP1、VCAM1、CRP、ESR2、NFKBIA。

圖4 杜仲-骨質疏松性骨折核心靶標圖Fig.4 Barplot of eucommiae-OPF core target注：左縱軸為基因名，橫坐標數字為相應基因鄰接點數量，數值越高，相關度越高。

圖5 A：GO功能富集分析氣泡圖；B：GO功能富集分析柱狀圖Fig.5 A: Dotplot of GO functional enrichment analysis; B: Barplot of GO functional enrichment analysis

圖6 A：KEGG通路富集分析氣泡圖；B：KEGG通路富集分析柱狀圖Fig.6 A: Dotplot of KEGG pathway enrichment analysis; B: Barplot of KEGG pathway enrichment analysis

2.5 GO功能富集分析

利用GO功能富集分析杜仲治療骨質疏松性骨折的關鍵核心靶標的結果見圖5。杜仲治療骨質疏松性骨折的核心基因的GO功能主要涉及核受體的活動、轉錄因子活性、類固醇激素受體活性等。

2.6 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結果見圖6，杜仲治療骨質疏松性骨折的調控信號通路主要涉及：細胞凋亡信號通路、p53信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-kappaB信號通路等。

3 討論

近年來越來越多的臨床報道[8]，杜仲是治療骨質疏松性骨折使用頻率較高的單味中藥之一，杜仲能顯著提高骨質疏松性骨折的骨密度，提高抗骨折能力，其臨床療效顯著，且無明顯不良反應[9-10]，但其機理尚未明確。本研究數據分析表明，杜仲治療骨質疏松性骨折有關的主要有效成分有19種，可通過作用于59個基因靶標，通過細胞凋亡信號通路、p53信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-kappaB信號通路等多個信號通路達到治療骨質疏松性骨折的目的。

杜仲治療骨質疏松性骨折主要的有效化學成分包括皮樹脂醇、白樺脂酸、beta-谷甾醇、山柰酚、OLIVIL、刺桐靈鹼、刺五加提取物等。已有研究證實白樺脂酸[11]能夠顯著抑制破骨前體細胞RAW264.7的分化活性，可作為破骨前體細胞分化的抑制劑。山奈酚[12]可激活雌激素信號傳導，然后激活Wnt信號通路，發揮抗骨質疏松的作用。也有研究證實，山奈酚可以促進成骨細胞分化，有效改善去勢大鼠的骨密度，其作用機制可能與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路有關[13-14]。通過對杜仲主要有效成分與現已有的對其相應化合物研究結果進行分析比對，其結果基本相似，證實本研究結果具有較高的可信度。

本研究發現，杜仲治療骨質疏松性骨折的核心基因有ALB、CASP3、MAPK8、VEGFA、EGFR、ESR1、MYC、CCND1、FOS、AR、CTNNB1、ERBB2、NOS3、PPARG、RELA、NR3C1、AHR、CAV1、PGR、CASP9、HIF1A、ICAM1、CCNB1、CYP3A4、IGF2、PARP1、VCAM1、CRP、ESR2、NFKBIA。研究發現， Casp3的下調能夠有效地改善高糖抑制的成骨細胞分化水平，主要通過PI3K/Akt信號通路介導作用，使成骨細胞的凋亡降低[15-16]。ESR1在成骨細胞和破骨細胞中表達，與絕經后脊柱骨質疏松癥相關，該基因可作為識別骨質疏松癥風險增加的指標[17]。另外，杜仲治療骨質疏松性骨折的過程可能是通過調控細胞凋亡信號通路、p53信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路等主要信號通路完成的。比如：PI3K/Akt信號通路是經典的骨代謝穩態的調節信號通路[18-19]，在骨代謝過程中PI3K/Akt信號通路是多種因素的主要匯聚點之一。NF-κB信號通路[20-22]的早期激活對破骨細胞的有效形成至關重要，同樣在破骨細胞分化的中間階段也起到重要的作用，杜仲可能是通過對RANKL的反應抑制了NF-κB的早期激活，從而發揮抗破骨作用。MAPK[23-24]信號通路主要在于對骨細胞分化的調節作用。有研究表明，MAPK家族成員ERK5在流體剪切力具有顯著促進成骨細胞分化作用[25]。近現代研究發現LncRNA MALAT1在OP大鼠中低表達，它是通過增強MAPK信號通路的激活來抑制BMSC的成骨分化，從而促進OP進程，證實了MAPK信號通路與骨質疏松性骨折的相關性[26]。近年來，越來越多的研究證實，杜仲通過調節骨細胞分化和凋亡的平衡以達到抗骨質疏松的目的，其具有降低破骨細胞的分化和增殖，而在成骨細胞中，凋亡被抑制，表明杜仲通過凋亡信號通路干預骨質疏松的作用[27]。因此，綜合有關骨質疏松性骨折信號通路的文獻和本實驗研究結果可以推斷出，杜仲可能主要通過細胞凋亡信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、NF-kappa B信號通路等主要信號通路來調節骨細胞的各種生理活動，達到治療骨質疏松性骨折的目的。

綜上所述，杜仲治療骨質疏松性骨折的作用機制可能是杜仲中19種活性成分調控骨質疏松性骨折相關的59種基因，通過介導細胞凋亡信號通路、p53信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等多種信號通路的綜合作用下發揮治療作用。利用網絡藥理學方法是利用計算模型為復雜的治療性化合物提供網絡數據驅動的適應證，這項研究的發現應該得到對照臨床研究和真實世界證據的證實，后期將在此研究結果的基礎上，進一步開展動物實驗和臨床試驗研究，以驗證其具體作用機制。同時，驗證中藥單體治療疾病的同時，其對全身的調節作用效果有待于進一步研究證實。