基于系統藥理學和分子對接探討青娥丸治療絕經后骨質疏松癥的作用機制

范曉茜 陳鋒 楊文娜

1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200 2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011

骨質疏松(osteoporosis，OP)是一種代謝性骨病，主要是由于骨量丟失與降低、骨組織微結構破壞、骨脆性增加，導致患者容易出現骨折的全身代謝性骨病[1]，以骨骼疼痛、易于骨折為特征。OP的發病與年齡息息相關，隨著社會人口老齡化的加劇，現已經成為影響中老年生活質量的重要原因。我國OP的發生率約為6.6%，總患病人數達6 000～8 000萬，居世界之首，男女患病率之比為1∶(2～3)，患者多為60歲以上的老年人以及絕經期后婦女[2]，其中絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)更是嚴重困擾絕經后5～10年內的女性[3]。

目前，防治PMOP的藥物有鈣劑、維生素D、降鈣素、二膦酸鹽、雌激素及異黃酮等[4]。激素代替療法被認為是治療PMOP的最佳選擇，也是最有效的治療方法，但存在的問題是激素代替療法可能會給其他系統帶來不良反應，而其他藥物也因為不同程度的副作用，難以被廣大患者所接受[5]。中醫理論認為PMOP的發生主要與腎虛、氣血虧虛和肝血不足有關，如今臨床上使用中國傳統經典方劑治療PMOP的方法繁多，主要為六味地黃丸、左歸丸、右歸丸、金匱腎氣丸、二至丸、青娥丸等6種方劑[6]。其中青娥丸為補腎強腰壯骨經典名方，最早收錄于《太平惠民和劑局方》，由杜仲、補骨脂、核桃仁、大蒜等4味中藥組成。目前尚無使用網絡藥理學驗證青娥丸對治療PMOP作用機制的研究，為此，本研究旨在分析青娥丸的藥理作用，從而為臨床上使用青娥丸治療PMOP提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 分析青娥丸的化合物及靶點蛋白

(1)利用TCMSP數據庫及BATMAN-TCM數據庫篩選出青娥丸其涉及藥物的化合物成分，設定化合物收錄標準[7]為：口服利用度(OB%≥30%)、類藥性(DL≥0.18)；(2)選取每個化合物的前10個Related targets(相關靶點蛋白)上傳至PharmMapper數據庫，選擇物種為“Homo sapiens”，進行潛在靶點蛋白(以下簡稱“靶點”)識別，其后剔除非人源與不規范的靶點，篩選去重復后數據存檔備用。

1.2 分析PMOP的靶點蛋白

通過利用GeneCards、PubMed及CTD數據庫，檢索疾病關鍵詞“Postmenopausal osteoporosis”，結合3個數據庫，收集PMOP的相關靶點，綜合數據去重剔除后，篩選出與PMOP相關的發病機制靶點。

1.3 PMOP和青娥丸的共同交集靶點的確定

將PMOP和青娥丸各自的靶點導入Venny 2.1.0平臺，得出兩者的共同交集靶點，隨后將交集靶點上傳至STRING 11.0數據庫，限定研究物種為“Homo sapiens”，限定置信系數為0.7，進行蛋白互作網絡分析。

1.4 GO富集分析及信號通路富集分析

(1)將所得的共同交集靶點上傳至David軟件，對靶點進行GO的3種功能富集分析，包括生物學過程(biological process，BP)、細胞組成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)；(2)其后利用David軟件收集靶點富集的關鍵KEGG信號通路。其中P<0.05則代表富集結果顯著[8]。

1.5 器官定位分析

BioGPS基因信息數據庫可以顯現靶點在不同組織器官的表達量，以觀察靶點在不同組織中的表達差異。將所得的共同交集靶點上傳至BioGPS數據庫，觀察靶點在與PMOP相關器官(肺、肝、心、腎和卵巢)中的表達程度。

1.6 分子對接分析

分子對接主要是研究分子之間(如配體和受體)相互作用，并預測其結合方式和親合力的一種理論模擬方法。通過使用Cytoscape 3.6.1軟件里工具Network Analyzer計算的化合物和靶點的拓撲參數，將計算出的連通度(degree)評估節點排名前10類化合物和前20位靶點上傳至iGEMDOCK軟件進行分子對接的分析。

2 結果

2.1 青娥丸的方藥組成及其藥性分類

青娥丸由杜仲、補骨脂、胡桃仁、大蒜4味中藥組成，對青娥丸組成藥物進行藥性分類，可見歸經分類上多見于走腎、肺、脾經，功效分類上多見于補虛藥，性味分類上多見于溫、甘、辛，詳見表1。

表1 青娥丸組成藥物的藥性分類Table 1 Classification of drug properties of Qing’e pill

2.2 青娥丸的化學成分及靶點蛋白

(1)結合TCMSP及BATMAN-TCM兩個數據庫去重復篩選后，可得到青娥丸有效成分32個，其中杜仲26個，補骨脂4個，胡桃仁1個，大蒜1個，4種中藥沒有出現共同化合物，詳見表2；(2)使用PharmMapper 數據庫識別32個化合物的靶點，同時利用Cytoscape 3.6.1軟件分析并繪制“中藥-化合物-潛在靶點”圖，可見4味中藥32個化學成分對應100個潛在靶點，詳見圖1，該圖共含有136個節點，其節點大小由拓撲學參數中網絡度決定。

表2 青娥丸組成藥物的化學成分Table 2 Chemical composition of Qing'e pill

圖1 “中藥-化合物-潛在靶點”圖Fig.1 Diagram of traditional Chinese medicine-compound-potential target

2.3 PMOP的靶點蛋白

檢索關鍵詞“Postmenopausal osteoporosis”，分別在GeneCards、PubMed及CTD數據庫中收集到靶點1 069個、282個及73個，結合3個數據庫，綜合數據去重剔除后，得出PMOP的相關發病機制靶點共1 157個。

2.4 PMOP及青娥丸的共同交集靶點及靶點間的相互作用分析

(1)通過Venny軟件得出PMOP和青娥丸的共同交集靶點有45個，詳見圖2；(2)對共同的靶點構建PPI網絡，發現靶點之間的相互關系緊密，交織范圍廣泛，其中杜仲有靶點28個、補骨脂11個、胡桃仁3個、大蒜7個，杜仲中作用靶點數量占交集靶點總數的62%，補骨脂占24%，推測在使用青娥丸治療PMOP的過程中，杜仲和補骨脂發揮主要作用，這與《方劑學》書中青娥丸里杜仲為君藥，補骨脂為臣藥的中醫藥理論思想不謀而合。詳見圖3(紅：杜仲；藍：補骨脂；綠：胡桃仁；黃：大蒜)。

圖2 絕經后骨質疏松癥與青娥丸交集靶點的韋恩圖Fig.2 Venn map of the intersection target between postmenopausal osteoporosis and Qing’e pill

圖3 絕經后骨質疏松癥與青娥丸交集蛋白的互作網絡圖Fig.3 Interaction network diagram of postmenopausal osteoporosis and Qing’e pill

2.5 交集靶點的GO富集分析

45個關鍵靶點通過David軟件進行GO分析，可以看到青娥丸干預PMOP后可能參與了150個生物學過程，其中包括雌激素反應、維生素D代謝過程、雌激素代謝過程等；參與有28個細胞組成，包括細胞核、線粒體、細胞質等；參與38個分子功能，包括酶結合、藥物結合、蛋白質結合等。后利用WPS軟件的Excel繪制GO富集分析圖，詳見圖4。

圖4 青娥丸對PMOP作用靶點富集的GO分析結果圖Fig.4 Go analysis results of the concentration of the target of Qing’e pill on PMOP

2.6 交集靶點富集的KEGG-Pathway分析

45個關鍵靶點通過David軟件進行KEGG分析后，可以看到青娥丸干預PMOP后參與的主要信號通路有雌激素信號途徑、鈣信號通路、cGMP-PKG信號通路等36條，后利用OmicShare平臺繪制富集KEGG通路的氣泡圖，詳見圖5。

圖5 青娥丸對PMOP作用靶點富集的KEGG通路氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enriched by the action target of Qing’e pill on PMOP

2.7 交集靶點富集的器官定位分析

45個關鍵靶點通過BioGPS軟件進行器官定位分析，定位結果大于Median(中間值)則表明靶點在該組織器官中的表達量高，后使用Cytoscape 3.6.1軟件繪制“器官-靶點”關系圖，可見作用于肝、心、肺、腎及卵巢的靶點個數分別為42、40、39、10及4，詳見圖6。

2.8 主要化合物與主要交集靶點的分子對接分析

Network analysis工具中，化合物及靶點網絡中的網絡度(degree)越大，說明青娥丸通過該靶點治療疾病的可能性越大，根據拓撲學參數計算后，40957-99-1、beta-sitosterol和kaempferol等10個主要化合物及PTGS2、HSP90AA1和PTGS1等20個關鍵靶點的網絡度最大，詳見表3。將10個主要化合物和20個關鍵靶點通過iGEMDOCK軟件進行分子對接的分析后，得到200個對接結果，對接能量越低，說明兩者結合的穩定度可能性越大，使用TBtools軟件繪制分子對接數據熱圖，詳見圖7，可見靶點CYP3A4和化合物hirsutin_qt的結合度最高，結合力(docking fitness)為-136.804。

表3 青娥丸的化學成分-作用靶點的拓撲學參數

圖7 主要化合物和關鍵靶點的分子對接結果圖Fig.7 Molecular docking results of main compounds and key targets

3 討論

PMOP主要發生在絕經后婦女，是由于雌激素缺乏導致骨量減少及骨組織結構變化，使骨脆性增多，易于骨折的疾病，由骨折引起的疼痛、骨骼變形等癥狀嚴重困擾絕經后女性的身體健康和生活質量，甚至縮短壽命。

中醫理論認為PMOP的發生主要與腎虛有關，青娥丸4味中藥歸經分類上多見于走腎經，腎主骨生髓，藥物可通過機體作用于腎經發揮其補腎健骨之效；功效分類上多見于補虛藥，補虛藥可以消除機體因患PMOP日久所致的虛弱證候，以增強體質；性味分類上多見于溫、甘，溫屬陽，可助機體溫經通絡，味甘補益、可緩急由骨折引起的疼痛；4藥配伍同用，可加強其補腎、強筋、健骨之功效。

藥理學研究顯示青娥丸主要是通過促進骨鈣吸收，調節鈣與磷間的平衡，從而抑制破骨細胞活動，使骨代謝穩定，并調節雌激素代謝而防治PMOP[9]。本研究表明青娥丸干預PMOP與32個化學成分及100個關鍵靶點相關，通過主要化合物與主要交集靶點的分子對接分析，發現靶點CYP3A4和化合物hirsutin_qt的結合度最高，CYP3A4(細胞色素P450 3A4)是一種血紅素硫氧基化酶，可執行多種氧化反應，故推測hirsutin_qt能夠通過與CYP3A4的高度結合，作用于PMOP，以調節機體的氧化反應。而杜仲中的木脂素、苯丙素化學成分可增強免疫作用，補骨脂中的豆甾醇可作為維生素D3的生產原料[10]，由此推測青娥丸可在一定程度上預防PMOP的加重。

在對靶點的GO富集分析過程中，發現靶點參與了150個生物學過程、28個細胞組成及38個分子功能，表明青娥丸干預PMOP的生物功能主要體現在雌激素調節、骨礦化調控、因子結合的調控等方面。而通過靶點富集的通路分析，發現靶點主要涉及鈣信號通路、雌激素信號途徑、cGMP-PKG信號通路等36條關鍵效應通路。Wang等[11]通過實驗研究表明通過調控鈣信號通路能夠對成骨的誘導性產生重要影響。任茜[12]使用50 Hz 0.6 mT低頻脈沖電磁場照射處理大鼠顱骨成骨細胞，實驗結果顯示cGMP/PKG信號途徑被激活，成骨細胞礦化也變得成熟，由此可以推測cGMP-PKG信號通路與骨形成有密切聯系。另有Evellyn等[13]和Liu等[14]實驗研究發現刺激雌激素信號途徑可調控機體對雌激素的分泌水平。綜上推測青娥丸可能通過調控鈣信號通路、雌激素信號途徑及cGMP-PKG信號通路等關鍵效應通路對因雌激素減少而導致的骨量丟失狀況有所改善。

將靶點導入BioGPS數據庫中進行器官定位后發現，定位至心、肝、肺三種臟器的靶點數量最多，同時也有關鍵靶點定位于與PMOP密切相關的臟器：腎和卵巢，由此可以推測通過青娥丸干預PMOP后，可提高關鍵靶點蛋白在腎和卵巢組織中的表達量。而青娥丸藥物組成中杜仲、補骨脂、胡桃仁三藥均入腎經，因此青娥丸可有效改善因久患PMOP而導致的腎虛癥狀，該結果也與藥理學上青娥丸能夠補腎健骨，調節雌激素的結論相符。同時在臨床治療研究中，卞慶來等[15]研究表明使用青娥丸干預腎虛型PMOP后，患者的腰背刺痛、腰膝酸軟程度均明顯降低。另有馬陳等[16]使用青娥丸治療PMOP患者6個月后，發現青娥丸治療組腰椎、股骨頸骨密度明顯高于安慰劑對照組。以上研究也印證了青娥丸干預PMOP的臨床療效與本研究結果相符，進一步佐證了中醫學的科學性、系統性。

綜上所述，本研究以傳統中醫藥理論為支點，以客觀臨床治療為支撐，通過利用分子對接、網絡藥理學及生物信息學，結合三者的規范化、整體化、系統化的特點，深入研究青娥丸治療PMOP的作用機制，與中醫藥整體觀與辨證論治的原則不謀而合。本研究揭示青娥丸對治療PMOP具有明顯的藥理療效，同時挖掘了許多潛在的治療靶標，為下一步深入驗證奠定了良好理論基礎。目前臨床上對青娥丸干預PMOP的治療效果其證據材料尚且不足，未來仍需進一步行臨床研究以探索驗證。