鐵皮石斛共生真菌對不同碳源的適應性

徐超　張紅巖　楊鶴同　席剛俊

摘要：以蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、淀粉作為培養基中的碳源，探索鐵皮石斛共生真菌對不同碳源的適應性。結果發現，以蔗糖、葡萄糖作為碳源時，各種共生真菌的生長速度較快、菌絲干質量較高。蔗糖、葡萄糖為適用于鐵皮石斛共生真菌的外源碳源，考慮到成本，使用蔗糖更為適宜。

關鍵詞：鐵皮石斛；共生真菌；碳源

中圖分類號： S56723+901文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0147-02

收稿日期：2016-06-01

基金項目：江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2014385）；江蘇農林職業技術學院科技創新團隊項目（編號：2015kj036）。

作者簡介：徐超（1979—），男，博士，副研究員，長期從事鐵皮石斛等植物共生菌的相關研究。E-mail：cxu8888@126com。

通信作者：席剛俊，男，助理研究員，主要從事鐵皮石斛栽培技術研究。E-mail：xigangjun@163com。

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬多年生附生草本植物1]，具有很好的滋陰潤肺、抗腫瘤等功效2]，被譽為“中華九大仙草”之首3-4]。作為典型菌根共生植物，共生真菌主要寄生于鐵皮石斛的種子及根系上5-6]。碳源是生物細胞骨架構建的主要物質，也是細胞生命活動所需能源的主要提供者，因此微生物的正常生長和代謝離不開碳源。由于不同菌種代謝能力不同，對碳源的利用存在差異，導致不同菌種對各種外源碳源的適應性可能有所區別7]。目前，關于鐵皮石斛專用生物菌肥的相關報道較少。本研究通過探索鐵皮石斛共生真菌對不同外源碳源的適應性，進而篩選出適宜的外源碳源，為制備鐵皮石斛菌根菌劑提供參考。

1材料與方法

11試驗材料

供試碳源：蔗糖、葡萄糖、淀粉、麥芽糖。

供試菌種：鐵皮石斛共生真菌001、002、003，保存于江蘇農林職業技術學院生物工程技術中心。

12培養基制備

121固體培養基固體基礎培養基（PDA）：馬鈴薯200 g、瓊脂15 g，酸堿度自然，水1 000 mL8]。將供試外源碳源蔗糖、葡萄糖、淀粉和麥芽糖分別加入基礎培養基中，制成添加不同外源碳源的培養基。其中，每種碳源設5個濃度梯度：依次為1%、2%、3%、4%、5%；同時，每個梯度各設3次重復9]。將制備好的培養基分裝于150 mL三角瓶中，然后進行濕熱滅菌（121 ℃，20 min）。

122液體培養基液體基礎培養基（PD）：馬鈴薯200 g、酸堿度自然，水1 000 mL8]。不同外源碳源的添加方式和濃度梯度設置與以上固體培養基的制備方法相同。

13鐵皮石斛共生真菌的人工接種及培養

將制備好的添加不同外源碳源的培養基倒在培養皿內（直徑90 mm），約15 mL皿；用滅菌的打孔器（直徑4 mm）將預先在PDA上培養好的菌種打成菌餅，接種到PDA平板中央和液體培養基中，黑暗培養7 d（27 ℃，PRX-250A智能人工氣候箱）。

14測量方法

141菌落生長速度根據“13”節的操作步驟，黑暗培養 7 d 后，測量共生真菌在固體培養基上的菌落直徑，作為衡量菌落生長速度的參考指標。每種處理設5個重復。

142菌絲體干質量根據“13”節的操作步驟，黑暗培養7 d后，將液體培養基中的菌絲體取出，烘干后稱質量，作為衡量菌絲干質量的參考指標（60 ℃，24 h，DGG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱）。

2結果與分析

21不同外源碳源對鐵皮石斛共生真菌菌落的影響

研究發現，在人工培養過程中，鐵皮石斛共生真菌對4種供試外源碳源都可利用，但菌落的生長速度不同。其中，001菌株在添加蔗糖、葡萄糖的培養基中，生長較好，菌落最大直徑分別為718、727 cm；在添加淀粉的培養基中生長最差，最大菌落直徑僅為571 cm；002菌株在添加蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉的培養基中均生長較好，菌落最大直徑均為 900 cm；003菌株在添加蔗糖、葡萄糖和麥芽糖的培養基中生長較好，最大菌落直徑均超過880 cm，而在添加淀粉的培養基中生長稍差，最大菌落直徑僅為810 cm（表1）。

綜合以上結果，3種鐵皮石斛共生真菌在添加蔗糖、葡萄糖的培養基上生長狀況均較好，菌落直徑較大。因此，蔗糖、葡萄糖為適用于鐵皮石斛共生真菌的外源碳源。

22不同外源碳源對鐵皮石斛共生真菌菌絲干質量的影響

研究發現，在液體振蕩培養過程中，鐵皮石斛共生真菌對4種供試碳源都可利用，但碳源差異對鐵皮石斛共生真菌菌絲干質量的影響較大。在添加蔗糖、麥芽糖的培養基中進行人工培養時，3種供試真菌的菌絲體干質量均有一定優勢；而在添加葡萄糖、淀粉的培養基中進行人工培養時，各供試共生真菌的菌絲體干質量明顯較低。其中，001菌株在添加蔗糖、麥芽糖的培養基中進行人工培養時，生長狀況均較良好，菌絲體的最大干質量均在 050 g皿左右， 最適濃度為5%， 而在添加葡萄糖、淀粉的培養基中進行人工培養時，菌絲體的最大干質量均低于040 g皿；002菌株在添加蔗糖、麥芽糖的培養基中進行人工培養時，菌絲體最大干質量均超過 025 g皿，最適濃度為1%。003菌株在添加蔗糖、麥芽糖的培養基中進行人工培養時，菌絲體的最大干質量均接近 07 g皿，最適濃度為4%，而在添加葡萄糖、淀粉的培養基中進行人工培養時，最大干質量均不足05 g皿（表2）。

綜上可見，3種鐵皮石斛共生真菌在添加蔗糖、葡萄糖的培養基中進行人工培養時，共生真菌的菌絲干質量均較大。因此，蔗糖、葡萄糖為適用于鐵皮石斛共生真菌生長的碳源。

3結論與討論endprint

通過對鐵皮石斛共生真菌的菌落生長速度和菌絲體干質量進行測定，發現在以蔗糖作為碳源時，鐵皮石斛共生真菌的生長速度和菌絲干質量均較優；當以葡萄糖作為碳源時，雖然菌落生長較快，但生長勢較弱，菌絲干質量相對較低，這可能和菌種間的差異性有關。此外，與蔗糖相比，麥芽糖、葡萄糖的價格相對較高。綜合以上因素，確定蔗糖為適用于鐵皮石斛共生真菌的外源碳源。

目前，鐵皮石斛的組培技術基本成熟，但其組培苗移栽成活率低、生長緩慢，可能與缺少共生真菌有關10-11]。在鐵皮石斛人工栽培過程中，優良菌根菌劑的使用不僅對鐵皮石斛存活率具有顯著影響，對其產量的提高、抗旱性的增強也具有至關重要的作用12]；同時，共生真菌形成優勢菌群后，釋放的拮抗物質可阻止其他病原菌侵入植物體內，大大減輕植物感染病害的風險13]。陳海榮等研究發現，在紫云英根瘤菌培養基的選擇與優化過程中，無機碳源中蔗糖和甘露醇為比較理想的碳源，表明不同真菌的培養條件既有共性，也有菌株個性，對相同碳源的吸收和利用率不盡相同，對不同碳源的吸收效果也存在較大差異14]。因此，在鐵皮石斛的人工栽培過程中，使用優良的菌根菌劑是有益的；但在進行菌根真菌擴繁和菌劑制備時，為了提高菌劑生產效率，降低生產成本，預先進行菌根真菌培養條件的篩選和優化10]，逐步篩選經濟、實用、高效的基質配方是十分必要的，也是必不可少的試驗內容。

參考文獻：

1]ZK（#]中國科學院中國植物志編輯委員會中國植物志：第19卷M] 北京：科學出版社，1999：117

CM（29]2]崔虹，宋希強 菌根真菌對春石斛幼苗生長發育的影響J

KG123]ZK（#]西南林業大學學報，2011，31（2）：20-23，32

3]趙冬青 鐵皮石斛J] 農業知識，2008（19）：1

4]楊一令，來平凡，蔣士鵬 鐵皮石斛的研究進展J] 山東中醫藥大學學報，2008，32（1）：82-85

5]金輝，許忠祥，陳金花，等 鐵皮石斛組培苗與菌根真菌共培養過程中的相互作用J] 植物生態學報，2009，33（3）：433-441

6]唐鳳 鐵皮石斛的種質保存及其與共生真菌關系的初探D] 南京：南京師范大學，2005

7]王美琴，陳俊美，李新鳳 不同碳、氮源對番茄兩種內生真菌菌絲生長的影響研究J] 山西農業科學，2008，36（11）：75-77

8]李靜，吳衛東 紫銅色松乳菇栽培培養基配方篩選的研究J] 北方園藝，2009（12）：233-235

9]李文藝，劉建成 不同培養基對松乳菇菌絲生長的影響J] 食用菌，2004（4）：10-11

10]ZK（#]徐超，范克勝，張紅巖，等 鐵皮石斛菌根真菌離體培養條件初探J] 林業科技開發，2013，27（4）：96-98

11]吳慧鳳，宋希強，胡美姣 鐵皮石斛促生內生真菌的篩選與鑒定J] 西南林業大學學報，2011，31（5）：48-52

12]徐超，席剛俊，范克勝，等 不同氮源對鐵皮石斛菌根真菌生長的影響J] 江蘇農業科學，2013，41（4）：236-238

13]陳瑞蕊，林先貴，施亞琴 蘭科菌根的研究進展J] 應用與環境生物學報，2003，9（1）：97-101

14]陳海榮，郭照輝，劉前剛，等 紫云英根瘤菌培養基的選擇與優化J] 湖南農業科學，2011（1）：13-15endprint