熱帶睡蓮花青素pH示差法測定技術的摸索

黃秋偉 龍凌云 毛立彥 黃欣欣 唐毓瑋 石蘭蓉

摘 要：本研究以熱帶睡蓮“印度紅”的色素提取液作為測定材料，采用pH示差法來測定提取液中花青素含量，通過考察測定波長、測定緩沖液pH梯度、平衡時間和反應溫度對測定體系中吸光值的影響，來篩選pH示差法較優的測定條件參數，并與熱帶睡蓮“巴拿馬”一起進行花色苷含量測定驗證試驗。試驗結果表明，適合熱帶睡蓮紅色系花青素含量的pH示差法測定條件為：測定波長536 nm、測定緩沖體系為pH1.0和pH4.5、平衡時間為70 min、反應溫度為35℃。此外，“印度紅”和“巴拿馬”色素提取花青苷含量開展三次重復測定試驗的RSD值分別為2.49%、1.54%，說明測定方法具有一定的可靠穩定性。

關鍵詞：睡蓮 紅色 pH示差法 花青素

Determination of Anthocyanin in Tropical Water

Lily by pH Differential Method

HUANG Qiuwei，LONG Lingyun*，MAO Liyan，

HUANG Xinxin，TANG Yuwei，SHI Lanrong

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning， Guangxi 530001， China）

Abstract： The anthocyanin content in the pigment extracts of tropical water lily “Indian Red” and “Panama” were determined and verified by pH differential method in this study. The optimal parameters of pH differential method were selected by examining the influence of determination wavelength， buffer solution pH gradient， equilibrium time and reaction temperature on the light absorption value in the determination system. Results showed that the suitable conditions for the determination of anthocyanins in red tropical water lily by pH differential method were as follows： wavelength 536 nm， buffer systems pH1.0 and pH4.5， equilibrium time 70 min， reaction temperature 35℃. The determination test of anthocyanin in “Indian red” and “Panama” pigment was repeated three times， and the RSD values were 2.49% and 1.54% respectively， indicating that the determination method has a certain reliability and stability.

Key words：Water lily;red;pH differential method;anthocyanin

睡蓮是睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nymphaea）多年生宿根浮葉植物的統稱。依據分布區域和生態適應性可將睡蓮分為耐寒睡蓮和熱帶睡蓮兩大類，其中熱帶睡蓮的花色相較耐寒睡蓮的要多，且層次更鮮明，其常見顏色有紅色、粉色、紫色、黃色等，主要著色器官為鮮花的花瓣，而植物花色的形成主要是由花青素來決定。當前，關于睡蓮的研究報道熱點主要是基于不同技術手段探究睡蓮系統發育[1-4]、睡蓮基因組研究[5]、睡蓮代謝物組成[6]、睡蓮生理特性及其對水體修復機制[7-10]等，但關于睡蓮花青素方面的研究較少。此外，關于植物色素中的花青苷含量測定方法常見報道的有分光光度法和HPLC法[11-12]。HPLC法雖然測定結果準確度高，但要求操作專一性，成本較高，步驟繁瑣，因而研究文獻以分光光度法使用居多，其中分光光度法又分有單一pH法、pH示差法、差減法[13]等。pH示差法相對來說方便快捷，成本低，適合快速測定植物色素中花青苷含量，但根據測定對象的不同，測定條件會有所差異。本次試驗選擇熱帶睡蓮品種“印度紅”的色素提取液作為測定材料，對pH示差法測定提取液中總花青苷含量的測定條件進行篩選研究，同時選擇熱帶睡蓮品種“印度紅”和“巴拿馬”的色素提取液一起開展測定體系的驗證研究，從而為后期熱帶睡蓮色素的提取開發提供一些理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

熱帶睡蓮品種“印度紅”和“巴拿馬”：由廣西亞熱帶作物研究所睡蓮種質資源圃提供，摘取兩者的花瓣并置于45℃鼓風干燥箱中烘干至花瓣含水量控制在3%～7%，并經機械粉碎至過20目篩網;無水乙醇（AR級）2.5 L裝：成都市科隆化學品有限公司;冰乙酸、無水乙酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、氯化鉀、鹽酸等分析純試劑均采購于廣西南寧茵興科技有限公司。

1.1.2 試驗設備

T6紫外可見分光光度計：北京普析分析儀器有限公司;GR200型電子分析天平：日本A&D有限公司;DHG-9109A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司;QE-300型中藥材高速粉碎機：武義屹立工具有限公司;MJ33型快速水分測定儀：梅特勒-托利多公司;HH-S4型數顯示恒溫水浴鍋：金壇市醫療儀器廠;3-30K高速冷凍離心機：德國SIGMA公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 色素粗提液的獲取

稱取“印度紅”花瓣干粉0.5 g，采用超聲破碎-微波輔助溶劑提取方式，以60%乙醇-草酸（含0.01 g/mL草酸）為提取劑。提取條件分別設定為：料液比1：40、超聲探頭破碎時間2 min、微波溫度40 ℃、微波時間5 min、微波功率400 W。提取完成后將提取液置于20 ℃及12000 r/min的條件下離心10 min，取上清液進行抽濾，所得到的濾液即為色素提取液，將提取液置于冰箱冷藏保存。

1.2.2 花青素測量波長的選擇

取色素提取液0.2 mL置于10 mL容量瓶中，并用提取劑稀釋定容至10 mL，相當于將提取液稀釋50倍。將稀釋液置于紫外/可見分光光度計，在320～700 nm的范圍內進行波長掃描，掃描數據采集間隔為1 nm，取蒸餾水作為空白基線調零，選擇譜圖中在可見光區出現吸收峰的波長作為色素測定波長。

1.2.3 花青素測量pH的選擇

因整個測定試驗要求在pH<7的酸性環境下進行測定，因此本次試驗在pH 0.5～6范圍內配制13個pH梯度緩沖液，其中，pH 3.0～6.0緩沖液采用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液體系，具體按照表1進行配制，同時用1mol/L的鹽酸滴加微調至相應的pH值，調整過程中用pH計進行實時監測。

pH0.5、pH0.8、pH1.5、pH2.0、pH2.5緩沖液的配制：量取0.1mol/L的一水檸檬酸溶液，緩慢加入至20 mL1mol/L的鹽酸中，用pH計調整至所需的pH值;pH 1.0氯化鉀-鹽酸緩沖液的配制：取0.2 mol/L氯化鉀溶液、0.2 mol/L鹽酸、蒸餾水，三者按50：100：50的體積比混合后，用1 mol/L鹽酸微調至pH 1.0;pH 4.5乙酸鈉-醋酸緩沖液的配制：取0.2 mol/L三水乙酸鈉溶液和0.2 mol/L醋酸溶液按1：1的體積比混合后，用1 mol/L鹽酸微調至pH 4.5。取13個10 mL的容量瓶，各吸取0.2 mL置于瓶中，并吸取相對應的pH梯度緩沖液定容至刻度，混勻后，置于30℃的水浴條件下，暫定混合反應時間30 min，以蒸餾水作為空白，于測定波長處測定吸光值，選取吸光值差值最大的兩個緩沖體系作為測定pH梯度條件。

1.2.4 花青素測量反應時間與反應溫度的選擇

配制1.2.3步驟篩選出的兩個pH梯度緩沖液，分別吸取色素提取液0.2 mL置于2個10 mL容量瓶中，并分別加入相應的pH緩沖液混合定容至刻度。然后分別將混合液置于25℃、35℃、45℃的水浴鍋中，搖勻后開始計時，每隔10 min就在分別在測定波長及700 nm處測定吸光值，并用測定波長測得的OD值減去OD700 nm，求其差值來消除樣品液渾濁的影響，并以吸光值的差值作為縱坐標，反應時間作為橫坐標，做變化曲線圖，依據結果來篩選出適宜的平衡時間及反應溫度 。

1.2.5 花青素含量測定條件的穩定性驗證

各稱取熱帶睡蓮紅色品種“印度紅”和熱帶睡蓮紫色品種“巴拿馬”的花瓣干粉0.5 g，以同樣的提取方式提取色素，分別取各自的色素提取液，并按照上述試驗步驟得到的pH示差法測定條件進行測定，提取測定試驗平行重復3次，并按照下式來計算提取液花青苷含量：

花青苷含量（mg/L）=（A×MW×DF×1000）/（E×L）

該式中：A表示示差法中兩個pH梯度稀釋液所測得的吸光度的差值，其值的計算方法（OD536 nm- OD700 nm）pH1.0-（OD536 nm-OD700 nm）pH4.5;MW表示矢車菊素葡萄糖苷分子量，值為449.4g/mol;DF表示稀釋倍數，本次試驗為稀釋50倍;E表示矢車菊葡萄糖苷的摩爾消光系數，值為26900（單位為L/（mol·cm））;L表示光程的厘米數，值為1cm。

2 結果與分析

2.1 測量吸收波長的確定

經超聲破碎-微波輔助溶劑提取得到的睡蓮花色素提取液，用相應的提取溶劑稀釋50倍后波長掃描圖譜見圖1。

如圖1所示，經提取劑稀釋50倍后的色素提取液很明顯在可見光區536 nm處有一吸收峰，在此波長測得的OD值為0.413，處于朗伯比爾定律吸光值與底物濃度成正比范圍（即吸光值處于0.2～0.8），因此，本次pH示差法總花青苷含量的測量波長確定為536 nm。

2.2 測量pH梯度的確定

色素提取液與不同pH梯度緩沖液混合后，在同樣的反應溫度和反應時間條件下，其在波長536 nm處相對應的吸光值變化曲線見圖2。

如圖2所示，隨著pH逐步提高，其相對應的吸光值的變化趨勢是先表現出緩慢波動升至一個最大值，然后有規律地下降至一個最低值，最后略高于最低值呈平穩狀態。明顯看出pH 1.0混合液的OD536最大，pH 4.5混合液的OD536最小，兩者的差值最大，故本次示差法所選用的緩沖體系分別為pH 1.0、pH 4.5。

2.3 平衡時間與反應溫度的確定

兩種pH混合緩沖液在不同反應時間和反應溫度的環境條件下，其吸光值差值的變化曲線見圖3與圖4。

如圖3和圖4所示，3個溫度梯度的pH緩沖稀釋液，其吸光值差值均會隨著反應時間延長出現波動性的變化，并在60 min時出現一個高點，而當時間延長至70 min時再往后吸光值差值基本處于一個穩定的平衡狀態。此外，在相同的反應時間區段內，35℃測得的吸光值差值整體上比其它溫度的要高，且曲線穩定。因此綜合來看，本次試驗pH示差法測定睡蓮色素提取液中花青苷含量的體系中平衡時間定為70 min，反應溫度定為35℃。

2.4 測定條件的穩定性驗證結果

經超聲破碎-微波輔助溶劑提取得到的兩種色素提取液，其中，“印度紅”色素提取液經重復三次提取及測定試驗，其花青苷含量分別為261.45、274.82、268.14 mg/L，重復均值為268.14 mg/L，重復試驗結果的相對標準偏差（RSD）為2.49%;“巴拿馬”色素提取液經重復三次提取及測定試驗，其花青苷含量分別為81.86、84.37、82.70 mg/L，重復均值為82.97 mg/L，重復試驗結果的相對標準偏差（RSD）為1.54%，兩者相對標準偏差均較小。以上結果可以看出兩種色素提取液花青苷含量重復試驗具備可靠的穩定性，且“印度紅”色素提取液花青苷含量要明顯高于“巴拿馬”品種。

3 討論與結論

色素分子一般在植物體內是以花青苷的形式存在，花青苷在酸性環境下（pH<7）是穩定的，同時其吸光值隨pH值的變化而變化[14]，通過測定pH 0.5～6范圍內樣品的吸光值，可以獲得吸光度差異最大且穩定的2個pH值，在此這兩個差值最大的pH值下進行檢測的吸光值，通過相應公式的計算，即可獲得最精確花青苷含量的測定結果，本次測定結果中，pH 1.0和pH 4.5兩者吸光值之間的差值最大。此外，花青苷在緩沖液中，其結構變化是一種隨時間變化后并達到穩定的動態平衡反應。因此當用緩沖液來稀釋花色素時，混合均勻后，需要放置一段時間，待其反應穩定后再開始測定，本次測定結果中，吸光值差值曲線均為反應時間為70 min達到平衡點，時間再延長無明顯變化。花青苷大多是熱不穩定性的物質，受熱易分解失活[15]，因此緩沖液稀釋后，等待反應穩定所放置的溫度條件也是較為關鍵的因素。本次測定結果發現紅色系熱帶睡蓮花青苷最適溫度為35℃，提高至45℃時，部分花青苷結構受到破壞而導致吸光值降低。

本次研究以經乙醇-草酸提取熱帶睡蓮紅色系品種“印度紅”的色素提取液為測定對象，對pH示差法測量提取液中總花青苷含量的測定條件進行了篩選，主要考察吸收波長、緩沖液pH梯度、平衡時間和反應溫度這四個條件參數。依據篩選試驗結果，最終確定pH示差法測定熱帶睡蓮紅色總花青苷的條件，即測定波長為536 nm、緩沖體系為pH 1.0和pH 4.5、平衡時間70 min、反應溫度35℃。在此測定條件下，經過兩個熱帶睡蓮品種色素提取液的重復測定驗證試驗，所得到的吸光值準確及穩定，能夠更好代入公式換算相應的總花青苷含量，所算出來的花青苷含量重復性較好，測定體系有一定的可靠穩定性。

參考文獻

[1]? ? ?劉艷玲，徐立銘，倪學明，等. 基于ITS 序列探討睡蓮屬植物的系統發育[J]. 武漢大學學報（理學版），2005（2）：258-262.

[2]? ? ?張海平，房偉民，陳發棣，等. 部分睡蓮屬植物形態性狀的多樣性分析[J]. 南京農業大學學報，2009，32（4）：47-52.

[3]? ? ?Péter P， Kinga K M， István S， et al. Genetic Variability of Thermal Nymphaea（Nymphaeaceae） Populations Based on ISSR Markers： Implications on Relationships， Hybridization， and Conservation[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2011， 29（4）： 906-918.

[4]? ? ?蘇群，楊亞涵，田 敏，等.? 睡蓮種質資源遺傳多樣性分析及DNA 指紋圖譜構建[J]. 熱帶作物學報，2020，41（2）：258-266.

[5]? ? ? Zhang L S， Chen F， Zhang X T， et al. The water lily genome and the early evolution of

flowering plants[J]. Nature， 2020， 577（7788）： 79-84.

[6]? ? ?袁茹玉.不同品種睡蓮花揮發物組成及其茶湯功能成分和抗氧化活性評價[D]. 南京：南京農業大學，2014.

[7]? ? ?古琴.低溫脅迫對不同熱帶睡蓮品種抗寒生理的影響[J]. 上海農業學報，2016，32（5）：114-

118.

[8]? ? ?張雅君，吳含玉，張會金，等.夏季小花睡蓮挺水葉光抑制加劇的機制[J]. 植物生理學報，

2018，54（1）：54-62.

[9]? ? ?柯美玉，陳栩.光對睡蓮開花生物鐘的調控作用研究[J]. 中國園藝文摘，2018，（5）：21-25.

[10]? ? 宋力，黃勤超，黃民生. 利用荷花與睡蓮對沉積物中重金屬的修復研究[J]. 光譜學與光譜分析，2016，36（9）：2884-2888.

[11]? ? 楊萍，李哲. pH示差法與HPLC測定黑枸杞花青素方法比較[J]. 中國農機化學報，2017， 38（7）：74-78.

[12]? ? 周丹蓉，葉新福，方智振，等. HPLC法測定李果實中花色苷含量及其與pH示差法的比較研究[J]. 東南園藝，2018，（1）：1-7.

[13]? ?翦祎，韓舜愈，張波，等.? 單一pH法、pH示差法和差減法快速測定干紅葡萄酒中總花色苷含量的比較[J]. 食品工業科技，2012，33（23）：323-423.

[14]? ?桑戈，趙力，譚婷婷，等.? pH示差法測定紫薯酒中花青素的含量[J]. 釀酒科技，2015，（6）：

88-91.

[15]? ? 楊萍，李哲.? pH示差法測定黑枸杞花青素技術的研究[J]. 中國食品添加劑，2017， （10）：

107-111.