泥鰍抗菌肽提取條件的優(yōu)化研究＊

張偉韜，彭煜琳，郭建華

（西南大學(xué)，重慶 402460）

0 引言

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是從自然界中提取的一類具有一定抗菌活性的多肽分子，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體受到病原的刺激時(shí)，生物自身的天然免疫系統(tǒng)對(duì)病原微生物產(chǎn)生的可以發(fā)揮免疫效應(yīng)的多肽類物質(zhì)[1]，對(duì)原蟲(chóng)、細(xì)菌、真菌甚至腫瘤細(xì)胞在一定程度上都具有抑制效果[2]，是生物體維持自身機(jī)體健康的重要物質(zhì)。現(xiàn)在由于抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致許多的細(xì)菌對(duì)抗生素都不敏感，即產(chǎn)生了耐藥的現(xiàn)象，因而抗菌肽這種抗生素的替代品逐漸受到重視[3]。

泥鰍具備很好的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值，中醫(yī)上對(duì)泥鰍的評(píng)價(jià)是泥鰍具有養(yǎng)腎生精、補(bǔ)鈣壯骨、補(bǔ)血補(bǔ)鐵等藥用功效，同時(shí)還有“水中人參”的佳譽(yù)，這與其具有多種活性物質(zhì)是分不開(kāi)的[4]，其中重要的一種就是泥鰍抗菌肽。park等[5]從泥鰍中分離得到一種含21 個(gè)氨基酸殘基的新抗菌肽，命名為泥鰍素，它的抗菌活性非常強(qiáng)，與現(xiàn)有的活性很強(qiáng)的M againin-Ⅱ相比，抗菌活性是它的6 倍[6]。泥鰍素對(duì)微生物有很好的廣譜抗菌效果。裴穎等[7]用組織勻漿的方法提取泥鰍抗菌肽，研究表明其對(duì)嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌效果。泥鰍抗菌肽能夠殺死眾多革蘭陽(yáng)性菌，一些革蘭陰性菌及真菌，在這一點(diǎn)上可以和某些廣譜抗生素相比。

本實(shí)驗(yàn)從泥鰍黏液中提取泥鰍抗菌肽，采用三因素三水平正交試驗(yàn)對(duì)泥鰍抗菌肽的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并確定出最佳提取工藝，為以后對(duì)泥鰍抗菌肽的提取條件提供參考。

1 試驗(yàn)材料

泥鰍購(gòu)買于重慶市榮昌區(qū)水口寺農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)（買回后清水養(yǎng)殖2天～3天），大腸桿菌（Escherichia coli）BL21菌株、冰醋酸、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB 液體培養(yǎng)基由西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院分子實(shí)驗(yàn)室提供。

2 試驗(yàn)方法

1）泥鰍抗菌肽的粗提取：挑選無(wú)藥殘、大小8 cm～10 cm的鮮活泥鰍，約20 尾～30 尾，然后清水養(yǎng)殖2 天～3 天，每天換水3 次～4 次，待其吐盡泥沙，將泥鰍放入塑料自封袋中，把帶入的水珠用濾紙擦干。輕輕揉壓，使其分泌黏液，用注射器吸取自封袋中的粘液，再將體表黏液于4℃，10 000 rpm，離心30 min；設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)見(jiàn)表1，取上清液按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)設(shè)置9 個(gè)處理組合，4℃下浸提完成后按4℃、10 000 rpm的條件，離心30 min，取上清液，調(diào)整pH 至7，冷凍干燥后-80℃保存，即為泥鰍黏液生物活性肽的粗提物質(zhì)。

表1 泥鰍抗菌肽浸提正交試驗(yàn)因素水平

2）粗提物抑菌活性的檢測(cè)：將凍干后每管內(nèi)的干粉用200微升的無(wú)菌水溶解，以大腸桿菌為受試菌，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。取100微升培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液涂在普通瓊脂培養(yǎng)基上，在濾紙片上滴10 微升抗菌肽粗提品，37℃培養(yǎng)24 h，重復(fù)3次，用氨芐西林溶液（100微克每毫升）作為陽(yáng)性對(duì)照，浸提液作為陰性對(duì)照，計(jì)算抑菌圈的平均直徑，根據(jù)抑菌圈大小判定抑菌活性。

3 結(jié)果分析

1）抑菌結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照（氨芐西林）的抑菌圈直徑為26.00 mm，陰性對(duì)照（浸提液）無(wú)抑菌圈。處理號(hào)1、2、3、4、5、6、7、8、9為試驗(yàn)組，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 泥鰍抗菌肽粗提物對(duì)大腸桿菌的正交作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2）影響泥鰍抗菌肽提取工藝的因素。利用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和直觀分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明液料比、浸提時(shí)間和乙酸濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響顯著，但浸提時(shí)間和乙酸濃度的R值（見(jiàn)表2）均為0.78，大于液料比（0.61）的R值（見(jiàn)表2）。可見(jiàn)影響泥鰍抗菌肽提取工藝的主要因素為浸提時(shí)間和乙酸濃度，料液比為次要因素。

3）不同處理組合的抑菌效果。由SPSS數(shù)據(jù)處理軟件的直觀分析可得最優(yōu)水平處理組為料液比為1∶2、浸提時(shí)間為36h、乙酸濃度為5%的組合，不在此次的9 個(gè)處理組內(nèi)，這也說(shuō)明了正交試驗(yàn)的合理性。

由表3的多重比較可知，處理4、5的抑菌圈直徑分別為9.83 mm、10.00 mm，大于其他處理組，處理4、5 和處理2、7、9、6、8、3、1 差異顯著，但處理4、5 之間差異不顯著，綜合考慮到物料成本，實(shí)際生產(chǎn)中選擇處理4作為優(yōu)化泥鰍抗菌肽提取工藝的條件。

表3 不同處理抑菌效果多重比較結(jié)果

4 討論

在自2020 年7 月開(kāi)始實(shí)施的禁止抗生素添加到飼料中的政策之后，養(yǎng)殖行業(yè)就需要尋找一種新的抗生素替代品，其中一種比較理想的替代品就是抗菌肽。在禁止添加抗生素到飼料的時(shí)代，抗菌肽可以成為抗生素的替代物[8]，與抗生素相對(duì)比，將抗菌肽作為一種飼料添加劑添加到飼料中，有很多優(yōu)點(diǎn)，最重要的是沒(méi)有藥物殘余、不會(huì)對(duì)環(huán)境有危害[9]，這就沒(méi)有了生產(chǎn)中的休藥期和棄奶期，對(duì)人也沒(méi)有由于藥殘所帶來(lái)的危害，另外還有不易對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的優(yōu)點(diǎn)，這就不會(huì)造成超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生，也不會(huì)產(chǎn)生毒性作用和其它無(wú)關(guān)的作用[10]；同時(shí)對(duì)動(dòng)物體可以有促生長(zhǎng)作用，如飼料中添加微生物源抗菌肽對(duì)于吉富羅非魚(yú)的發(fā)育過(guò)程具有促進(jìn)作用，同時(shí)有利于腸道對(duì)飼料的分解吸收[11]；在肉雞的飼料中添加抗菌肽對(duì)于其免疫器官的成熟有促進(jìn)作用，同時(shí)有利于其非特異性免疫屏障功能的提升，從而更好地殺滅病原微生物[12]；在斷奶仔豬的飼料中添加抗菌肽可以殺滅許多病原微生物，在很大程度上減少其發(fā)生腹瀉的情況[13]；在凡納濱對(duì)蝦的食物中添加抗菌肽可以增強(qiáng)其抵御外界不良條件的能力，從而減少對(duì)蝦死亡的數(shù)量[14]。基于這些優(yōu)點(diǎn)，抗菌肽可以成為抗生素的良好的替代品，同時(shí)也可以和抗生素合用來(lái)起到協(xié)同作用增強(qiáng)藥物的效果[15]。

泥鰍抗菌肽具有很好的抑菌效果和廣譜抑菌范圍，是一種比較理想的抗生素替代品，park 等[5]的試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了泥鰍抗菌肽的廣譜性，在較低的含量下可以對(duì)真菌釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）對(duì)外界環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用產(chǎn)生不利作用，還可以對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等菌體對(duì)外界環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用起到阻礙作用，同時(shí)也抑制革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，這種效果可以和一些廣譜抗生素相比較。但是目前已有的對(duì)泥鰍抗菌肽的研究較少，主要是有關(guān)抗菌肽的提取過(guò)程的研究，未對(duì)相關(guān)的提取過(guò)程進(jìn)行一定的優(yōu)化。體外提取的工藝還可以進(jìn)一步優(yōu)化，以期提高體外提取過(guò)程中粗提取的效率，從而為泥鰍抗菌肽提取進(jìn)一步的研究做鋪墊。現(xiàn)有的提取方法都是將泥鰍直接搗碎，但是這樣提取出來(lái)的抗菌肽有可能會(huì)被蛋白酶水解，而且還要加一定的蛋白酶抑制劑，同時(shí)也會(huì)混有許多的雜質(zhì)，較為繁瑣。

因而，為了尋找一種更為便捷的提取泥鰍抗菌肽的方法，本實(shí)驗(yàn)在前人工作的基礎(chǔ)上，用泥鰍為實(shí)驗(yàn)材料，從泥鰍粘液中提取抗菌肽粗提品，考慮料液比、浸提時(shí)間、乙酸濃度設(shè)計(jì)一個(gè)三因素三水平的正交試驗(yàn)，以泥鰍抗菌肽粗提品的抑菌活性為指標(biāo)，確定影響提取泥鰍抗菌肽的關(guān)鍵因素和最佳提取組合。結(jié)果表明，影響泥鰍抗菌肽提取工藝的主要因素為浸提時(shí)間和乙酸濃度，料液比為次要因素，最佳處理組合為料液比1∶2、浸提時(shí)間36 h、乙酸濃度為5%的組合。

5 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)重在研究粗提取的最佳條件，以期得到更高濃度的泥鰍抗菌肽粗提品，為下一步的研究做鋪墊,試驗(yàn)結(jié)果表明，粗提取出來(lái)的泥鰍抗菌肽對(duì)大腸桿菌具有一定的抑制作用，而且方法和原料的獲取上都較為簡(jiǎn)便，不需要進(jìn)一步的過(guò)濾，可以考慮在最適合條件下浸提然后凍干加入飼料中，研究其對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響，以期獲得進(jìn)一步的應(yīng)用途徑。同時(shí)得到泥鰍抗菌肽粗提品還可以進(jìn)一步通過(guò)凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化，進(jìn)一步提高其抑菌效果。