高產生物膜乳酸菌抗逆性及其抗氧化特性

張 悅，賀銀鳳，顧 悅，王 艷，鄭硯學

高產生物膜乳酸菌抗逆性及其抗氧化特性

張 悅，賀銀鳳※，顧 悅，王 艷，鄭硯學

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，呼和浩特 010018）

為了揭示乳酸菌生物膜抵抗不良環境的作用機制，該研究以2株乳酸片球菌RJ2-1-4、TG1-1-10和2株植物乳桿菌RJ1-1-4、RM1-1-11（菌株均高產生物膜）為研究對象，探究浮游態、被膜態菌株對酸、堿、膽鹽、模擬人工胃腸液的耐受能力以及抗氧化能力。結果表明：在極酸條件下，菌株生長受到抑制，但是pH值3.0時，被膜態RM1-1-11生長量顯著高于浮游態（0.05）。隨著pH值遞增，菌體密度增加，在pH值7.0-9.0時，堿性環境對除TG1-1-10外其他3株菌的生長有一定抑制作用；當膽鹽濃度為0～0.03%時，菌株生長有小幅度上升，且被膜態菌株RJ2-1-4、TG1-1-10生長量顯著低于浮游態（0.05）；但隨著膽鹽濃度繼續增加，菌株生長受到抑制，除浮游態菌株TG1-1-10外，其余3株菌被膜態菌株生長量均顯著高于浮游態；菌株在模擬人工胃腸液中處理3 h后發現，相比于浮游態菌株，被膜態各菌株在胃、腸液中的存活率均有所提高。4株菌對于不同種類自由基均有一定清除能力，清除率從高到低分別為HO·、DPPH·、脂質過氧化、超氧陰離子，其中RJ1-1-4浮游態菌懸液對DPPH·清除率為214.12g/mL，RJ2-1-4被膜態無細胞提取物、TG1-1-10浮游態無細胞提取物對HO·清除率分別為713.81g/mL和637.01g/mL，RJ2-1-4浮游態無細胞提取物對超氧陰離子清除率為93.80g/mL，RM1-1-11被膜態菌懸液對脂質過氧化物的清除率為122.82g/mL。結果表明：生物被膜狀態下的乳酸菌對于酸、堿、膽鹽、模擬人工胃腸液均有一定的保護作用，但是菌株間存在特異性，即使是同一種屬也不相同；被膜態菌株的抗氧化能力高于浮游態，但是對于不同種類自由基會有不同的結果。該結果為進一步研究乳酸菌在被膜態下抵抗環境脅迫的作用機制提供依據。

菌；抗氧化；生物膜；乳酸菌；抗逆性

0 引 言

乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）在自然界中種類繁多且分布廣泛[1]，因其良好的益生特性[2-3]，被廣泛應用于食品、飼料和藥品等領域。然而，發酵產品在加工及運輸過程中，會受到一些如酸、堿、高溫等不利因素的影響，使乳酸菌活細胞數顯著減少，如果LAB對胃腸道環境不耐受，那么其發揮益生特性的能力也會受到影響。因此尋求提高LAB存活率的方法，對于有益乳酸菌發酵產品的開發利用具有重要意義。目前常用的提高LAB存活率的方法有：改良菌種保護劑法、微膠囊法、添加低聚糖等物質促進菌株生長、基因重組改良LAB特性法以及生物膜法[4-8]。生物膜是細菌粘附于惰性物體或活體生物表面生長、繁殖，由其自身分泌的胞外多聚基質所包被起來形成的一種具有高度組織化的微菌落聚集體[9]，是菌體為抵御不良環境而發展形成的一種自我保護模式。由于生物膜是菌體自身的生物合成，因此受到學術界的廣泛關注。研究證明，生物膜狀態下的乳酸菌較浮游狀態耐熱、耐氧能力大幅度提升；使用含有生物膜的納米纖維膜作為發酵劑發酵酸奶，不但顯示出優異的發酵能力，而且菌株在貨架期內的存活率更高。由此可以發現，生物膜的形成不僅可以提高菌株存活率，還促進菌株對不利環境的適應，提高細菌的耐受性，確保菌株穩定發揮益生作用[10-12]。

生物氧化（Biological Oxidation）是生物體內有機物質在酶的催化下發生氧化反應生成CO2和H2O，并釋放大量能量的過程。由于一些內源性或者外源性因素的影響，機體和細胞會處于氧化應激狀態[13]，從而引發糖尿病、阿爾茲海默癥、癌癥等一系列疾病并導致衰老[14-18]。目前對于乳酸菌抗氧化應激已得到體內外試驗的驗證，但是對其作用機制的研究尚不明確，對于被膜態菌株清除不同種類自由基能力的研究還未見報道。

本試驗選擇課題組前期分離篩選得到的4株高產生物膜乳酸菌，對其在浮游態、被膜態下對酸、堿、膽鹽、模擬人工胃腸液的存活能力，以及抗氧化能力進行探究，擬為提高乳酸菌在食品工業中的生存能力和利用率提供新的視角；同時也為乳酸菌抗氧化機理的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

本試驗受試菌株分離自西藏地區牦牛乳制品，分別為2株乳酸片球菌RJ2-1-4、TG1-1-10（分別分離自酸曲拉和牦牛酸奶）和2株植物乳桿菌RJ1-1-4、RM1-1-11（分別分離自酸曲拉和牦牛奶），均保藏于內蒙古農業大學食品生物技術團隊實驗室。

1.1.2 培養基

試驗所用到的MRS培養基參考顧悅[19]的方法配制。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH），Coolaber公司；酵母提取粉、牛肉浸粉、大豆蛋白胨、牛膽鹽，購自廣東環凱微生物科技有限公司；醋酸鈉、檸檬酸氫二胺、磷酸氫二鉀、葡萄糖、維生素C、硫酸亞鐵、水楊酸、無水乙醇、三氯乙酸，購自國藥集團化工試劑有限公司；焦性沒食子酸，購自天津市風船化學試劑科技有限公司；試驗中使用的水均為去離子水。

1.1.3 儀器與設備

HF-SAFE 1500型生物安全柜、SMART-N純水機，力康生物醫療科技控股有限公司；SX-500型全自動高壓滅菌鍋，日本TOMY公司；PB 10型酸度計，德國Sartorius公司；5810R型高速低溫離心機，德國Eppendorf公司；紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 浮游態菌株供試菌液的制備

將活化至第三代的菌液倒入10 mL離心管，10 000 r/min離心5 min后棄上清液，再加入5 mL 0.85%的生理鹽水，吹打混勻后按照上述離心條件離心處理5 min，棄上清。如此重復3次以洗滌菌體，第3次洗滌完成后棄上清，再加入適量生理鹽水，調節菌液的吸光度OD595nm值在1.0左右。此時細菌的細胞濃度為1×107CFU/mL，由此制得浮游態菌株的供試菌液[11]。

1.2.2 被膜態菌株供試菌液的制備

將菌株活化至第二代后按照2%體積分數的接菌量傳菌于新鮮培養基，吹打混勻后吸取5 mL于6孔細胞培養板中，在培養前用封口膜纏繞6孔板縫隙處，最后放入37 ℃培養箱培養24 h，得到被膜態菌株。按照1.2.1節中的方法將細菌的細胞濃度調節為1×107CFU/mL，由此獲得被膜態菌株的供試菌液[20]。

1.2.3 菌株最適生長pH值的測定

以2%體積分數的接種量，將上文制備好的浮游態和被膜態供試菌液分別接種至pH值為9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0和1.0的MRS液體培養基，以未接菌的相應pH值的培養基作為空白對照組，每個梯度設置兩個平行組。于37 ℃條件下培養24 h，測定吸光度OD595nm值，篩選出不同狀態下耐酸能力較強的菌株并確定其耐受范圍。

1.2.4 菌株對不同濃度膽鹽耐受能力的測定

以2%體積分數的接種量，將上文制備好的浮游態和被膜態供試菌液分別接種至含有質量分數分別為0、0.03%、0.10%、0.20%和0.30%的牛膽鹽MRS液體培養基，以未接菌的MRS液體培養基為空白對照，每個梯度設置兩個平行組。于37 ℃條件下培養24 h，測定吸光度OD595nm值，從而篩選出不同狀態耐膽鹽能力較強的菌種及其相應耐受范圍。

1.2.5 菌株對模擬人工胃液的耐受能力的測定

分別取浮游態和被膜態菌株的供試菌液，按照菌液∶胃液=1∶9的體積比例注入到人工胃液中，并混合均勻。在37 ℃條件下靜置培養3 h，之后適當進行梯度稀釋，選擇3個適宜稀釋度，各取1 mL加入滅菌培養皿，在培養皿中加入適量培養基與菌液一起搖勻，于37 ℃條件下培養36～48 h后再進行平板菌落計數。以人工模擬胃液中初始培養的菌株存活數作為空白對照組，求得平均值，計算存活率，從而篩選出對胃液有良好耐受性的菌株[20-21]。

胃液中存活率=(1/0)×100%（1）

式中1為經過模擬胃液培養3 h后的平板菌落總數，(CFU/mL)；0為模擬胃液初始培養的平板菌落總數，(CFU/mL)。

1.2.6 菌株對人工模擬腸液的耐受能力的測定

分別取浮游態和被膜態菌株的供試菌液，按照菌液∶腸液=1∶9的體積比例注入到人工腸液，并混合均勻，在37 ℃條件下靜置培養3 h。之后按照1.2.5節中的方法培養并進行平板菌落計數。以人工模擬腸液中初始培養的菌株存活數作為空白對照組，求得平均值，計算存活率，從而篩選出對人工模擬腸液有較好耐受性的菌株[22-23]。

腸液中存活率=(1/0)×100%（2）

式中1為經過人工模擬腸液培養3 h后的平板菌落總數，(CFU/mL)；0為人工模擬腸液初始培養的平板菌落總數，(CFU/mL)。

1.2.7 菌株抗氧化能力的測定

1）細胞懸浮液的制備

將1.2.1一節中培養的三代菌液傾倒于10 mL離心管中，離心（4 ℃，4 000 r/min，10 min），棄去上清，吸取5 mL超純水吹打混勻，重復兩次，重懸，得到細胞懸浮液。

2）無細胞提取物(Cell Free Fermentation Supernatant, CFS)的制備

將上文中制得的細胞懸浮液利用超聲波破碎儀（280 W，破碎5 s，間隔5 s，共處理10 min）冰浴處理，經顯微鏡檢查無完整細胞后離心（4 ℃，12 000 r/min，10 min）取上清液。

3）清除自由基DPPH·試驗

用維生素C溶液、1 mL蒸餾水替代樣品，分別為陽性對照組和陰性對照組，用1 mL無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液為空白組，1.5 mL蒸餾水與同體積無水乙醇混合溶液調0。清除率按公式（3）計算：其中為樣品組的吸光值，為空白組的吸光值，0為對照組的吸光值[24]。

以0、50、100、150和200g/mL的維生素C為橫坐標，對DPPH·清除率為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程為：=0.398+7.033，2=0.992，可用于后續試驗。

4）清除HO·自由基試驗

用維生素C溶液替代樣品為陽性對照組，空白組為蒸餾水。清除率按以公式（4）計算：其中為樣品組的吸光值，0為空白組的吸光值[25]。

以0、100、200、300、400、500、600、700、800g/mL的維生素C為橫坐標，對HO·清除率為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程為：=0.123+0.805，2=0.993，可用于后續試驗。

5）清除超氧陰離子試驗

用維生素C溶液替代樣品為陽性對照組，空白組為蒸餾水。清除率按以公式（5）計算：其中樣為樣品組的吸光值，空為空白組的吸光值[26-27]。

以0、50、100、150、200、250、300g/mL的維生素C為橫坐標，對超氧陰離子清除率為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程為：=0.3+10.748，2=0.993，可用于后續試驗。

6）清除脂質過氧化物試驗

用維生素C溶液替代樣品為陽性對照組，空白組為蒸餾水。清除率按以公式（6）計算：其中樣為樣品組的吸光值，空為空白組的吸光值[27]。

以0、50、100、150、200g/mL的維生素C為橫坐標，對脂質過氧化物清除率為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程為：=0.383+8.718，2=0.990，可用于后續試驗。

1.3 數據分析

利用SPSS 23.0中的one-way ANOVA和Origin 2018進行數據的分析及作圖，測定結果以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 不同狀態下乳酸菌對酸、堿耐受結果

在人體眾多防御機制中，胃酸提供的強酸環境對微生物的影響最大。胃液的pH值因個體差異和飲食結構的不同有較大波動，正常人胃液的pH值為1.5-2.0。食物在胃內停留的時間從幾分鐘到幾小時不等，因此絕大多數微生物因不耐酸而被殺滅，只有極少數具有較強耐酸能力的乳酸菌能夠順利通過胃酸屏障，到達腸道內發揮其益生作用。因此益生性乳酸菌必須具備耐酸特性，才能在胃腸消化道中保持一定的數量[28]。4株菌浮游態、被膜態菌株最適生長pH值范圍及耐酸、堿能力結果如圖 1所示。

由圖1可知，在pH值1.0-3.0時，極酸性環境完全抑制了浮游態菌株的生長，在pH值3.0時，被膜態RM1-1-11的菌體密度顯著高于浮游態（0.05）。隨著pH值遞增，菌體密度逐漸上升，浮游態的乳酸片球菌RJ2-1-4在pH值6.0時達到最大生長量，乳酸片球菌TG1-1-10、植物乳桿菌RJ1-1-4則在pH值7.0時達到最大生長量，而植物乳桿菌RM1-1-11則是在pH值9.0時達到最大生長量。在pH值7.0-9.0時，堿性環境對除RM1-1-11外其他3株菌的生長有一定抑制作用，但是4株被膜態乳酸菌生長量均高于浮游態。通過觀察圖1可以發現，在pH值為5.0-6.0的范圍內，除RM1-1-11，浮游態菌株的生長量總體上高于被膜態菌株，出現這樣的結果可能是由于酸脅迫下，相關的酸敏感應激蛋白變性甚至失去活性，生物膜結構發生改變，從而造成菌體間的拮抗，影響菌株的生長[29]。從上述結果可以得出，大部分被膜態菌株對酸堿環境的耐受能力比浮游態的高，而且存在菌株特異性。

2.2 不同狀態下乳酸菌對膽鹽耐受結果

膽鹽是肝細胞分泌的膽汁酸和牛磺酸或甘氨酸結合得到的鈉鹽或鉀鹽，人體小腸中膽鹽質量分數一般維持在0.03%～0.30%，膽鹽能夠改變菌體細胞膜的通透性，從而抑制、殺滅乳酸菌。因此，乳酸菌要在人體內發揮益生功效，必須對膽鹽有一定的耐受力[30]。4株乳酸菌浮游態和被膜態對膽鹽耐受能力如圖2所示。

由圖2可知，膽鹽濃度為0～0.03%時，菌株生長有小幅度上升，且被膜態菌株RJ2-1-4、TG1-1-10生長量顯著低于浮游態（0.05）；但隨著膽鹽濃度繼續增加，菌株生長受到抑制，此時除浮游態菌株TG1-1-10在0.10%膽鹽濃度生長量高于被膜態，其余3株菌被膜態菌株生長量均顯著高于浮游態。雖然菌株生長受到抑制，但是菌株被膜態對菌體起到保護作用，使得菌株對于高濃度膽鹽有一定耐受能力。

2.3 不同狀態下乳酸菌對人工模擬胃液的耐受能力

人體胃液的主要成分為胃蛋白酶和鹽酸，呈酸性，正常水平下維持在pH值3.0左右，空腹狀態下甚至可達到pH值1.5，因此乳酸菌對于胃液的脅迫作用要有一定抵抗作用才能生長和發揮其益生功能。浮游態及被膜態菌株耐胃液能力測定結果如表1所示。

表1 浮游態和被膜態菌株在模擬人工胃液中存活情況

注：表中不同大寫字母表示同一株乳酸菌不同狀態時差異顯著；小寫字母表示不同乳酸菌在同一狀態下差異顯著（0.05），下同。

Note: Different capital letters in the table indicate that the same strain of lactic acid bacteria has significant differences in different states; lower case letters indicate that different lactic acid bacteria have significant differences in the same state (0.05). The same below.

從表1中可以看出：在胃液中培養3 h后，相比于菌株RJ2-1-4和TG1-1-10的存活率，菌株RJ1-1-4和RM1-1-11的存活率維持在較高水平，且前兩株菌的存活率與后兩株菌存在顯著差異（0.05）。

相比于浮游態菌株，被膜態各菌株在胃液中的存活率均有所提高，在胃液中培養3 h后，存活率由小到大依次是22.13%，36.59%，58.66%，76.28%，即菌株耐胃液能力由弱到強依次是TG1-1-10，RJ2-1-4，RJ1-1-4，RM1-1-11。由此可見，生物被膜狀態下的菌株對模擬胃液的耐受性更高。

2.4 不同狀態乳酸菌對模擬人工腸液的耐受能力

腸液呈微堿性，主要成分為胰蛋白酶和膽鹽，對于乳酸菌生長有脅迫作用。乳酸菌在人體腸道內的活菌數達到108CFU/mL以上時，才滿足其發揮益生特性的要求[31]。浮游態及被膜態菌株耐腸液能力測定結果如表2所示。

表2 浮游態和被膜態菌株在模擬人工腸液中存活情況

從表2中可以看出：菌株在腸液中培養3 h后，浮游態存活率由小到大依次為34.60%，34.63%，37.78%，60.06%，即菌株RJ1-1-4，RJ2-1-4和RM1-1-11對腸液的耐受能力相近，而菌株TG1-1-10的耐受能力較高，與前三者存在顯著差異。

相比于浮游態菌株，被膜態各菌株在腸液中的存活率均有所上升，但上升幅度不同。在腸液中培養3 h后，存活率由小到大依次是41.46%，43.83%，64.97%，69.78%，即菌株RJ2-1-4和RJ1-1-4不存在顯著差異，耐受能力相對較低，菌株RM1-1-11和TG1-1-10之間也不存在顯著差異（0.05），但耐受能力相對較高。由此可見，被膜態菌株可提高對腸液環境的耐受性，提高菌株在腸道內的存活率，使其能進一步發揮其保留益生作用。

由上述對浮游態、被膜態菌株環境抗逆性的研究，不難發現生物被膜狀態下的菌株對不良環境的耐受性更強。為了驗證被膜態菌株的抗氧化特性是否強于浮游態菌株，本試驗設計不同種類自由基來探究不同狀態下菌株的抗氧化能力。

2.5 不同狀態菌乳酸菌株抗氧化能力

乳酸菌的抗氧化應激已經得到體內外的試驗證實，但是對其機理研究尚不明確。且對于被膜態菌株抗氧化的研究較少，因此通過對生物膜狀態下菌株抗氧化能力進行研究，可以為氧化應激機理的研究提供新思路。

浮游態和被膜態菌株對不同自由基的清除率如圖3所示。4株菌均有清除自由基能力，但是不同狀態對不同種類自由基的清除能力不同，且同一種屬之間清除率也不相同。對于DPPH·自由基，菌株RJ2-1-4、TG1-1-10、RM1-1-11浮游態與被膜態對自由基清除能力無顯著差異（0.05），但是經過超聲波破碎后，除RM1-1-11，其他兩株乳酸片球菌清除率均降低；而RJ1-1-4浮游態菌株對DPPH·清除率較被膜態高，其中浮游態菌懸液的清除率為214.12g/mL；大部分菌株經超聲波破碎后清除率呈現下降趨勢，說明菌株對DPPH·自由基的清除作用并非單憑胞內某些活性物質，與其活細胞的一些抗氧化機制密切相關。對于HO·自由基，兩株乳酸片球菌均表現出無細胞提取物對HO·的清除能力均顯著高于菌懸液的，菌株RJ2-1-4被膜態無細胞提取物對HO·的清除能力為713.81g/mL，而菌株TG1-1-10浮游態無細胞提取物對HO·的清除能力為637.01g/mL。兩株植物乳桿菌則表現出被膜態對HO·的清除能力均顯著高于浮游態的（0.05）。對于超氧陰離子，與HO·自由基結果相似，乳酸片球菌RJ2-1-4不同狀態下菌懸液對超氧陰離子均無清除能力，而菌懸液無細胞提取物的清除率與被膜態無細胞提取物相近，達到93.80g/mL。說明細胞內可能存在某些具備清除超氧陰離子的物質且不同菌株間存在差異。對于脂質過氧化物，菌株對其都表現出不同抑制作用，但是4株菌均表現出被膜態菌懸液的清除能力最好，其中RM1-1-11被膜態菌懸液的清除率最高，為122.82g/mL。這可能是由于清除脂質過氧化物的酶等物質大多存在于細胞表面，且菌株在成膜過程中會分泌類似物質，從而表現出被膜態菌懸液清除能力好[32]。由上述結果可知，總體上被膜態菌株的抗氧化能力高于浮游態，但是對于不同種類自由基會有不同的結果，具體作用機制還有待進一步研究。

3 結 論

1）乳酸片球菌RJ2-1-4、TG1-1-10和植物乳桿菌RJ1-1-4、RM1-1-11，4株乳酸菌在不同pH值環境中時，被膜態乳酸菌菌體密度總體上高于浮游態菌株。當pH值為5.0-6.0時，浮游態乳酸片球菌RJ2-1-4、TG1-1-10和植物乳桿菌RJ1-1-4生長量高于被膜態；乳酸片球菌RJ2-1-4、RM1-1-11在pH值7.0-9.0時，被膜態菌株生長量呈現逐漸上升的趨勢，且菌體密度高于浮游態。

2）耐膽鹽試驗中，浮游態和被膜態4株乳酸菌的生長量都會隨著膽鹽濃度的升高而下降。在膽鹽濃度為0.30%的環境下，浮游態菌株中只有菌株TG1-1-10表現出一定的耐受性，而被膜態菌株中，除了菌株RM1-1-11外，其他菌株都具有一定耐受性。

3）模擬人工胃液的耐受性試驗中，4株乳酸菌均表現出一定耐受性，但耐受能力各異。浮游態菌株中，菌株RJ1-1-4存活率最高，為56.49%；TG1-1-10存活率最低，為6.29%，說明菌株TG1-1-10的耐受能力最差。被膜態乳酸菌的耐受能力顯著提高（0.05），其中菌株RM1-1-11表現出最強耐受能力，存活率可以達到76.28%。模擬人工腸液的耐受性試驗中，浮游態菌株TG1-1-10存活率最高，為60.06%；菌株RJ1-1-4的存活率最低，為34.60%。被膜態乳酸菌對腸液的耐受能力顯著提高（0.05），耐受能力較好的菌株TG1-1-10存活率可由原來的60.06%提升至69.78%。

4）4株乳酸菌對于不同種類自由基均有一定清除能力，清除率從高到低分別為HO·、DPPH·、脂質過氧化、超氧陰離子。其中RJ2-1-4被膜態無細胞提取物、TG1-1-10浮游態無細胞提取物對HO·清除率分別為713.81g/mL和637.01g/mL，RJ1-1-4浮游態菌懸液對DPPH·清除率為214.12g/mL， RM1-1-11被膜態菌懸液對脂質過氧化物的清除率為122.82g/mL，RJ2-1-4浮游態無細胞提取物對超氧陰離子清除率為93.80g/mL。

4株高產生物膜乳酸菌在生物被膜狀態下對于酸、堿、膽鹽、人工胃腸液均有一定的耐受性，可以提高LAB在不良環境中的存活率。但是抵御不良環境的能力存在菌株差異性，即使是同一種屬的不同菌株間也不相同。因此，研究乳酸菌的生物膜，使菌株以被膜態生長，不僅可以有效提高菌株的存活率，從而增加其對外界不良環境的抵抗能力，而且對乳酸菌更好的發揮益生功效具有重要的意義。

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Stress resistance and antioxidant properties of lactic acid bacteria with high biofilm production

Zhang Yue, He Yinfeng※, Gu Yue, Wang Yan, Zheng Yanxue

(,,010018,)

Most bacteria in the natural environment choose to live in the biofilm state, due mainly to better advantage over the planktonic state. The resistance of strains to the external environment can be significantly improved, when lactic acid bacteria behave in the form of a biofilm state. Therefore, it is a benefit to investigate the stress resistance of strains in biofilm state for the production mechanism behind the lactic acid bacteria biofilm under environmental stress. In this study, two strains ofRJ2-1-4, TG1-1-10 and two strains ofRJ1-1-4, RM1-1-11 (They were both high-yield biofilm strains) were selected to systematically explore the tolerance of planktonic and biofilm strains to acid, alkali, bile salt, simulated artificial gastrointestinal fluid, and antioxidant ability. The results showed that the growth of strain was inhibited under the condition of extremely acid, but the growth of biofilm state RM1-1-11 at pH 3.0 was significantly higher than that of the planktonic state (0.05). The density of bacteria increased with the increase of pH value, whereas, the alkaline environment in pH 7.0-9.0 inhibited the growth of three strains except TG1-1-10. The growths of membranous strains RJ2-1-4 and TG1-1-10 were significantly lower than those of planktonic state (0.05), particularly that the growth of strain increased slightly, when the concentration of bile salt was 0-0.03%. However, the growth of strain was inhibited as the concentration of bile salt continued to increase. In addition, the TG1-1-10 growth of planktonic strain was higher than that of biofilm strain, whereas the growth of the other three strains in the biofilm state was significantly higher than those of planktonic strain. After the strains were treated in the simulated artificial gastrointestinal fluid for 3 hours, it was found that the survival rate of biofilm strains in the gastric and intestinal juices improved, compared with the planktonic strains. There was a certain clearance ability of four strains for different kinds of free radicals. The clearance rates were ranked in order: HO·>DPPH·> lipid peroxidation > superoxide anion. Specifically, the clearance rate of RJ2-1-4 planktonic bacteria suspension on DPPH· was 214.12g/mL, while the clearance rate of RJ2-1-4 biofilm CFS to superoxide anion was 93.8g/mL, and the clearance rates of RJ2-1-4 biofilm CFS and TG1-1-10 planktonic CFS on HO· were 713.81g/mL and 637.01g/mL, respectively. The clearance rate of lipid peroxides by RM1-1-11 biofilm suspension was 122.82g/mL. Lactic acid bacteria in biofilm state had certain protective effects on acid, alkali, bile salt and artificial gastrointestinal fluid, but there was specificity among strains, even in the same genus. The anti-oxidation ability of biofilm strain was higher than that of planktonic state, but there was a definite difference in different kinds of free radicals. The finding can provide a significant support to a further investigation on the resistance of lactic acid bacteria to environmental stress in biofilm states.

bacteria; antioxidation; biofilm; lactic acid bacteria; stress resistance

張悅，賀銀鳳，顧悅，等. 高產生物膜乳酸菌抗逆性及其抗氧化特性[J]. 農業工程學報，2021，37(6)：282-288.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.06.034 http://www.tcsae.org

Zhang Yue, He Yinfeng, Gu Yue, et al. Stress resistance and antioxidant properties of lactic acid bacteria with high biofilm production[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(6): 282-288. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.06.034 http://www.tcsae.org

2020-10-13

2021-03-09

國家自然科學基金項目(31960467)；內蒙古自治區自然科學基金項目(2019BS03002)；內蒙古自治區研究生科研創新資助項目(B20191147Z)

張悅，研究方向為食品生物技術。Email：etsu_1007623969@163.com

賀銀鳳，博士，教授，研究方向為食品生物技術。Email：heyinf6468@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.06.034

TS201.3

A

1002-6819(2021)-06-0282-07