miR?330?3p靶向丙酮酸激酶M2型對胃癌細胞增殖、凋亡及有氧糖酵解進程調控機制研究

劉磊 趙羲和 田忠

中國醫科大學附屬盛京醫院1普通外科，2腫瘤科（沈陽110023）

胃癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，我國2015年胃癌新發及死亡例數分別為40.3萬、29.1萬人次，分別位居全部惡性腫瘤的第2、3位［1］，盡管外科手術及其他治療方式有了長足的發展，但胃癌患者的生存率及預后仍不樂觀，明確胃癌發生及發展的機制，從分子水平上尋找早期診斷及靶向治療措施的是當前癌癥研究的重點及難點［2］。近年來的研究認為，丙酮酸激酶M2 型（PKM2）介導的有氧糖酵解過程在腫瘤細胞的發生及發展中扮演重要角色，瓦伯格效應認為，癌細胞需要獲取足夠的能量來維持細胞生長、增殖，大部分癌組織主要利用有氧糖酵解過程快速供能，有氧糖酵解活性在癌細胞增殖及血管新生過程均發揮重要作用［3-4］。臨床研究表明，在包括胃癌的諸多惡性腫瘤組織中均可檢測到PKM2 水平的明顯升高，且其水平與患者低生存密切相關［5-6］。microRNA 是一種非編碼RNA，主要在轉錄、表觀遺傳學水平上調節基因表達，從而影響一系列生理過程。miR?300?3p 是一種腫瘤標記基因，既往已被證實在肝癌［7］、肺癌組織［8］中存在低表達，且其水平與細胞惡性生物學行為相關；HWANG 等［9］開展的一項高通量研究顯示，miR?300?3p 在胃癌細胞系及組織中表達下降。目前miR?300?3p 與PKM2 及糖酵解途徑的關系仍較少有研究涉及，本研究采用轉染實驗，在胃癌細胞株中過表達及干擾miR?300?3p、PKM2 表達，觀察miR?300?3p 與PKM2 表達量的變化，并采用增殖、侵襲、凋亡實驗分析細胞生物學行為的改變，探討miR?300?3p 及PKM2 通路在胃癌生長增殖中的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人類胃癌細胞株SGC?7901；人類正常胃粘膜上皮細胞GES?1；均購自中國科學院細胞庫。

1.2 實驗儀器與試劑細胞培養箱（日本SANYO公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）；紫外分光光度計（美國Thermo公司）；凝膠成像儀（美國BIO?RAD 公司）；PCR 儀（美國BIO?RAD 公司）；實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）。

胎牛血清（WESTEN 公司）；Trizol（Invitrogen 公司）；RNA 反轉錄試劑盒（美國BIO?RAD 公司）；CCK?8（Dojin DO 公司）；RAPI（Solarbio 公司）；Matrigel 基質膠（Solarbio 公司）；Transwell 小室（美國Corning 公司）；葡萄糖含量檢測試劑盒（北京百奧博萊科技有限公司）；乳酸含量檢測試劑盒（艾美捷生物科技有限公司）；HK 試劑盒（武漢博士康生物工程有限公司）；LDH 試劑盒（上海玨博生物科技有限公司）；熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Biovision 公司）；PKM2、GLUT1、HK2、Bax、Caspase?3 單克隆抗體（Santa Cruz 公司）；辣根過氧化物酶標記羊抗兔、兔抗羊單克隆抗體（Santa Cruz 公司）；蛋白提取試劑盒、BCA 試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞復蘇及培養取胃癌細胞系、正常胃粘膜上皮細胞置于0 ℃條件下解凍，采用DMEM 培養基連續培養24 h（37 ℃、5%CO2）；以3 000 r/min速度（離心半徑8.5 cm）離心5 min，取沉淀放入DMEM 培養基重懸，繼續培養24 h；連續進行細胞傳代3 次后進行細胞計數，取4 × 105/孔接種至培養基上，培養至細胞融合80%作用，更換不含胎牛血清的培養基。

1.3.2 細胞轉染取對數期細胞，將miR?NC、miR?330?3p?inhibitor、miR?330?3p?mimcs 轉染至胃癌細胞中，分別記為miR?NC 組、miR?330?3p?inhibitor組、miR?330?3p?mimcs 組，將miR?330?3p?inhibitor 分別與PKM2?NC、PKM2?shRNA 共轉染至胃癌細胞中，記為miR?330?3p?inhibitor+PKM2?NC 組、miR?330?3p?inhibitor+PKM2?shRNA 組；將miR?330?3p?mimcs 分別與LV?NC、LV?PKM2 共轉染至胃癌細胞中，記為miR?330?3p?mimcs+LV?NC 組、miR?330?3p?mimcs+LV?PKM2 組。具體轉染方法：取對數期生長的胃癌細胞系，以1.5 × 105/孔接種于六孔板中，采用DMEM 培養基稀釋序列至200 μmol/L，取2 μL Lipofectamin2000 RNAiMAX 加入到稀釋的轉染序列中混合，室溫孵育20 min，將復合物加入六孔板內，而后每孔加入1.9 mL DMEM 培養基，使得每孔轉染濃度為100 nmol/L，在37 ℃、5%CO2條件下孵育8 h，而后換成5%培養基繼續培養40 h。

1.3.3 CCK?8 檢測細胞增殖能力取上述1.3.2 中處理細胞，采用胰蛋白酶處理，制備細胞懸液，調整細胞數量為5 000 ～10 000 個/孔，培養24、48、72 h 時取細胞，加入10 μL CCK?8 溶液孵育4 h，測定吸光度值。

1.3.4 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力取稀釋（1∶8）后的Matrigel 均勻涂布在上層小室內，孵育4 h 后加入無血清DMEM 培養基重懸，向上室內加入細胞懸液（對數期細胞，細胞密度約為5×104/mL），下室加入含有血清的培養基，將裝置置于37 ℃、5%CO2培養箱孵育24 h，取出小室，采用PBS 沖洗并小心去除膜上的Matrigel 及細胞，采用多聚甲醛固定并加入結晶紫染料染色30 min，PBS 沖洗、晾干后置于倒置顯微鏡下觀察。

1.3.5 Annexin V/PI 法檢測細胞凋亡檢測取細胞收集于流式管內，PBS 清洗3 遍，以1 000 r/min 離心10 min，取沉淀以200 μL 結合緩沖液重懸細胞，加入FITC 標記的Annexin V 溶液及PI 溶液，混勻后室溫避光孵育20 min，加入300 μL 緩沖液混勻，流式細胞儀上樣檢測細胞凋亡。

1.3.6 有氧糖酵解作用測定（1）葡萄糖利用率及乳酸生成量測定：取上述培養細胞，采用葡萄糖含量試劑盒及乳酸試劑盒說明書進行操作，檢測培養基葡萄糖及乳酸含量，計算葡萄糖利用率及乳酸生成量。（2）己糖激酶（HK）、乳酸脫氫酶（LDH）活性測定：采用HK 及LDH 試劑盒進行操作，普通分光光度計測定吸光度值，根據標準趨勢計算活性。

1.3.7 熒光素酶報告基因檢測miR?330?3p 靶向PKM2 調控能力在TargetScan 數據庫序列尋找結合位點，構建野生型及突變型基因靶點PKM2 的熒光素酶表達載體，將載體分別與miR?NC、miR?330?3p 共轉染至胃癌細胞系內，進行雙熒光素酶報告實驗測定。

1.3.8 基因及蛋白表達（1）逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測：主要涉及miR?330?3p mRNA 表達。取處理后的細胞，采用Trizol 法提取總RNA，反轉錄試劑盒合成cDNA，進行聚合酶鏈式反應擴增，瓊脂糖凝膠檢測核酸條帶亮度，mRNA 表達量為目的基因與內參表達量的比值。（2）Western blot 法：主要涉及PKM2、GLUT1、HK2、Bax、Caspase?3 蛋白的表達。取處理后的細胞提取總蛋白，配置SDS?PAGE 膠，以80 μg 蛋白量加入點樣孔內，電泳后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，轉膜完畢后采用脫脂牛奶封閉3 h，依次加入一抗、二抗，洗脫后加入發光試劑，置于顯像儀照相，以目的基因與內參表達灰度值作為蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法采用SPSS 20.0 進行分析，數據以（）表示，組間比較行單因素方差分析及t檢驗，以P＜0.05 表示差異具統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌細胞系及胃粘膜上皮細胞miR?330?3p、PKM2 表達RT?PCR 結果顯示，胃癌細胞系及胃粘膜上皮細胞miR?330?3p 表達量分別為（0.33 ±0.10）、（0.20±0.05），差異有統計學意義（P＜0.05）；Western blot 顯示，胃癌細胞系及胃粘膜上皮細胞PKM2蛋白表達量分別為（0.34±0.10）、（1.01±0.23），兩者差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 胃癌細胞系及胃粘膜上皮細胞miR?330?3p、PKM2表達Fig.1 Expression of miR?330?3p and PKM2 in gastric cancer cell lines and gastric mucosal epithelial cells

2.2 miR?330?3p 與PKM2 的靶向關系分析生物信息學顯示，miR?330?3p 與PKM2 存在結合位點；熒光素酶報告基因檢測結果顯示，與miR?NC 組比較，miR?330?3p PKM2 野生型熒光素酶活性降低（P＜0.05）。見圖2。

2.3 miR?330?3p 轉染對胃癌細胞PKM2 表達的影響與miR?NC 組比較，miR?330?3p?inhibitor 組PKM2 表達升高，miR?330?3p?mimcs 組PKM2 表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖2 miR?330?3p 與PKM2 的靶向關系分析Fig.2 Analysis of the targeting relationship between miR?330?3p and PKM2

圖4 miR?330?3p、PKM2 轉染對胃癌細胞侵襲的影響Fig.4 The effect of miR?330?3p and PKM2 transfection on the invasion of gastric cancer cells

2.4 miR?330?3p、PKM2 轉染對胃癌細胞增殖、侵襲、凋亡的影響與miR?NC 組比較，miR?330?3p?inhibitor 組miR?330?3p 表達量降低（P＜0.05），吸光度值、侵襲細胞數增多，凋亡細胞數減少（P＜0.05），下調miR?330?3p?inhibitor 組細胞PKM2 表達，吸光度值及侵襲細胞數均明顯降低，凋亡細胞數增加（P＜0.05）。

圖3 miR?330?3p 轉染對胃癌細胞PKM2 表達的影響Fig.3 The effect of miR?330?3p transfection on the expression of PKM2 in gastric cancer cells

與miR?NC 組比較，miR?330?3p?mimcs 組miR?330?3p 表達量升高（P＜0.05），吸光度值、侵襲細胞數減少，凋亡細胞增加（P＜0.05）；上調miR?330?3p?mimcs 組細胞PKM2 表達，吸光度值及侵襲細胞數明顯升高，凋亡細胞數減少（P＜0.05）。見表2、圖4、圖5。

表2 miR?330?3p、PKM2 轉染對miR?330?3p 轉染細胞增殖、侵襲、凋亡的影響Tab.2 Effects of miR?330?3p and PKM2 transfection on the proliferation,invasion and apoptosis of miR?330?3p transfected cells x±s

圖5 miR?330?3p、PKM2 轉染對胃癌細胞凋亡的影響Fig.5 Effects of miR?330?3p and PKM2 transfection on apoptosis of gastric cancer cells

2.5 miR?330?3p、PKM2 轉染對miR?330?3p 轉染細胞有氧糖酵解的影響miR?330?3p?inhibitor 組細胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量、HK 活性、LDH 活性均顯著高于miR?NC 組（P＜0.05）；下調miR?330?3p?inhibitor 組細胞PKM2 表達，細胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量、HK 活性、LDH 活性等有氧糖酵解指標均明顯降低（P＜0.05）；miR?330?3p?mimcs 組各有氧糖酵解指標顯著低于miR?NC 組（P＜0.05），上調miR?330?3p?mimcs 組細胞PKM2 表達，有氧糖酵解指標均明顯升高（P＜0.05）。見表3。

表3 miR?330?3p、PKM2 轉染對miR?330?3p 轉染細胞有氧糖酵解的影響Tab.3 Effects of miR?330?3p and PKM2 transfection on aerobic glycolysis of miR?330?3p transfected cells±s

表3 miR?330?3p、PKM2 轉染對miR?330?3p 轉染細胞有氧糖酵解的影響Tab.3 Effects of miR?330?3p and PKM2 transfection on aerobic glycolysis of miR?330?3p transfected cells±s

別細胞葡萄糖消耗量（mmol/L） 乳糖生成量（mmol/L）HK 活性（U/g）LDH 活性（U/g）iR?NC2.22±0.504.55±0.45160.12±22.7459.63±9.64 iR?330?3p?inhibitor3.11±0.626.85±0.56196.63±18.5274.15±10.22 iR?330?3p?inhibitor+PKM2?NC3.01±0.656.83±0.63189.63±22.1475.11±9.63組m m m miR?330?3p?inhibitor+PKM2?shRNA miR?NC miR?330?3p?mimcs miR?330?3p?mimcs+LV?NC miR?330?3p?mimcs+LV?PKM2 2.55±0.45 2.22±0.50 1.52±0.41 1.49±0.38 2.01±0.48 4.85±0.50 4.55±0.45 2.96±0.56 3.11±0.48 4.55±0.52 174.14±22.63 160.12±22.74 122.41±12.56 120.41±15.63 158.63±22.01 62.12±9.63 59.63±9.64 20.74±3.96 21.01±4.12 56.34±4.12

2.6 miR?330?3p、PKM2 轉染對miR?330?3p 轉染細胞凋亡、有氧糖酵解相關基因表達的影響與miR?NC 組比較，miR?330?3p?inhibitor 組PKM2、GLUT1、HK2 表達升高，促凋亡蛋白Bax、Caspase?3表達量降低（P＜0.05）；下調miR?330?3p?inhibitor組細胞PKM2 表達，Bax、Caspase?3 等蛋白表達明顯升高，GLUT1、HK2 等蛋白明顯降低（P＜0.05）。與miR?NC 組比較，miR?330?3p?mimcs 組PKM2、GLUT1、HK2 表達降低，Bax、Caspase?3 表達量明顯升高（P＜0.05）；上調miR?330?3p?mimcs 組細胞PKM2 表達，Bax、Caspase?3 等蛋白表達明顯降低，GLUT1、HK2 等蛋白明顯升高（P＜0.05）。見表4、圖6。

3 討論

近年來的研究顯示，miRNA可發揮轉錄調控作用影響腫瘤增殖、代謝及生物學行為，miRNA在腫瘤中的表達、致癌通路已成為當前研究的熱點［10-11］。miR?330?3p 是一種被證實在多種惡性腫瘤中均存在表達降低的miRNA，既往國外開展的一項細胞及組織學研究顯示，miR?300?3p 在胃癌細胞系及組織中表達下降，而miR?300?3p 過表達可促進E?鈣黏蛋白的表達，抑制細胞的惡性生物學行為［12］；MA 等［13］近期開展的一項研究證實，過表達的miR?330?3p 可通過抑制Wnt/β?catenin 信號通路抑制細胞增殖及凋亡，有望成為胃癌的潛在治療靶點。本研究結果顯示，相比于正常胃粘膜上皮細胞，胃癌細胞系存在miR?330?3p 表達量的明顯降低，構建miR?330?3p 低表達及過表達模型，結果顯示，與對照組比較，miR?330?3p?inhibitor 組胃癌細胞增殖、侵襲作用增強，凋亡作用降低，而miR?330?3p?mimcs 組呈現相反趨勢，提示抑制miR?330?3p 表達可促進胃癌細胞的惡性生物學行為，而過表達miR?330?3p則有一定抑制作用，提示miR?330?3p 的降低可能與胃癌的發生及發展密切相關，這一結果與既往研究報道類似［14-15］。當前miR?330?3p 對腫瘤生物學行為的具體調控機制仍未明確，目前認為，糖酵解過程在腫瘤生長、增殖、轉移中均發揮重要作用，葡萄糖消耗及乳酸生成的增加是細胞糖酵解活動增強的重要指標［16-17］。本研究對胃癌細胞、miR?330?3p 低表達及過表達胃癌細胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量、HK 活性、LDH 活性等糖酵解指標進行分析，結果顯示，miR?330?3p 低表達細胞存在糖酵解指標的顯著升高，而miR?330?3p?mimcs 組糖酵解指標顯著降低，調控糖酵解相關基因表達也呈相同的趨勢，提示miR?330?3p 或可通過作用于糖酵解作用影響胃癌細胞的生物學行為。

表4 miR?330?3p、PKM2 轉染對凋亡、有氧糖酵解相關基因表達的影響Tab.4 Effects of miR?330?3p and PKM2 transfection on apoptosis and aerobic glycolysis?related gene expression

圖6 miR?330?3p、PKM2 轉染凋亡、有氧糖酵解相關基因表達的影響Fig.6 The effect of miR?330?3p and PKM2 transfection on apoptosis and aerobic glycolysis?related gene expression

PKM2 編碼的丙酮酸激酶2 型是糖酵解過程中的關鍵酶，在多種惡性腫瘤中均存在過表達［18-20］，目前認為，PKM2 或可通過增強瓦伯格效應促進腫瘤細胞生長，腫瘤細胞中的高活性的PKM2 可快速供能，也可促進糖酵解中間產物進入旁路途徑，通過一系列機制供應癌細胞物質促進其快速增殖［21］；研究證實PKM2 可與HIF?1 因子的亞單位共同影響腫瘤細胞代謝的改變［22］；WANG 等［23］開展的一項研究也表明，由EGFR 轉位至細胞核中的PKM2 可促使鈣黏蛋白轉錄增加，導致癌細胞的大量增殖。miR?330?3p 是否可通過靶向調控PKM2 影響糖酵解途徑從而影響腫瘤細胞生物學行為仍有待研究探討。為探討miR?330?3p 與PKM2 的靶向作用，本研究采用生物信息學方法及熒光素酶報告系統分析兩者的關系，結果顯示，miR?330?3p 基因3’UTR 區域與PKM2 有結合位點，熒光素酶報告系統也提示miR?330?3p?mimcs 組PKM2 野生型熒光素酶活性降低，推測miR?330?3p與PKM2 可能具有一定靶向作用關系。為進一步確定miR?330?3p 通過靶向影響PKM2 表達從而影響胃癌細胞生物學行為，本研究在miR?330?3p 轉染細胞中再分別上調或下調PKM2 表達，結果顯示，下調miR?330?3p?inhibitor 組細胞PKM2 表達后，胃癌細胞增殖及侵襲行為均降低，凋亡升高，而上調miR?330?3p?mimcs 組細胞PKM2 表達后，胃癌細胞增殖及侵襲行為也明顯升高，提示PKM2 的升高可回復miR?330?3p 升高對胃癌惡性生物學行為的抑制作用，而PKM2 的降低也可回復miR?330?3p 降低對胃癌惡性生物學行為的促進作用，兩者存在靶向作用關系。

綜上，miR?330?3p 表達與胃癌細胞增殖、凋亡及有氧糖酵解進程相關，其作用可能是通過靶向PKM2 實現，本研究的局限性在于未對PKM2 對胃癌細胞生物學行為的影響機制進行研究，擬在后續研究中探討。