西藏牦牛源腹瀉病原菌的分離鑒定及耐藥性研究

張開琴，王 剛，窮 珍，巴 桑，次旺羅杰，石 次，索朗斯珠

（西藏農牧學院 動物科學學院 西藏高原動物疫病研究自治區高校重點實驗室，西藏 林芝 860000）

牦牛是高寒地區的特有牛種，草食性反芻家畜，常見于西藏、青海等高寒高海拔地區，以前被農牧民作為勞役勞動力使用，其飼養模式多為放牧散養和部分半舍式飼養[1]。牦牛大腸桿菌病是由大腸桿菌感染牦牛引起的一種以腹瀉、敗血癥為主要特征的急性傳染病，在西藏牧區流行較為普遍，不僅影響牦牛健康，還制約牦牛養殖業的發展[2]。大腸桿菌在牦牛體內屬于常在菌，可通過致病性大腸桿菌感染導致牦牛腹瀉，嚴重時還會發生死亡，目前主要依靠抗生素進行大腸桿菌病的預防和治療，易產生耐藥性[3]。大腸桿菌病的耐藥性問題已日趨嚴重，也從未停止過對其耐藥性的監測[4-7]。大量試驗證實大腸桿菌可經接合、轉座等方式進行水平傳播[8]，臨床可通過檢測耐藥基因的存在情況，對耐藥流行情況進行實時監測。本試驗以拉薩市林周縣牦牛腹瀉糞便為靶標，通過常規的細菌學實驗技術進行腹瀉病原菌的分離鑒定，然后使用國際公認的K-B紙片法對常用抗生素的藥物敏感性情況進行監測[9]。

1 試驗材料

1.1 樣品來源

本試驗的40份牦牛腹瀉糞便均采集于拉薩市林周縣某牛場。

1.2 質控菌株來源

質控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922，購自中國獸醫藥品監察所。

1.3 主要試劑

氯霉素、青霉素、多粘菌素B等15種抗菌藥物均購自杭州微生物試劑有限公司，普通肉湯培養基、普通瓊脂培養基、麥康凱培養基均購自杭州微生物試劑有限公司，沙門菌分離鑒定所用培養基干粉均購自美國BD公司，PCR試劑、核酸染料4S Red plus等購自上海生物工程有限公司。

1.4 主要儀器

高速離心機centrifuge 5804，由德國Eppendorf公司生產；PCR擴增設備，由美國Bio-Rad公司生產；移液器，由德國Eppendorf公司生產；核酸蛋白測定儀，由Thermo公司生產。

2 試驗方法

2.1 生化試驗

取純培養物進行常規生化試驗，并按照說明書判定反應結果。

2.2 藥敏試驗

藥敏試驗按照CLSI推薦的K-B法進行。抑菌結果可依據表1所列標準進行判定[10，11]。

2.3 引物設計

從GenBank中檢索已登錄的信息，用DNA Star軟件找出保守序列，然后采用Primer 5設計16S rRNA序列P基因引物（F:5′-ATGGCTCAGA TTGAACGC-3′；R：5′-CAGGTTCCCCTAC GGTTA-3′，Product：1 500 bp），沙門菌腸毒素Stn基因引物（F:5′-CTTTGGTCGTAAAATA AGGCG-3′；R：5′-TGCCCAAAGCAGAGA GATTC-3′，Product：260 bp）[12,13]，引物序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.4 PCR檢測

反應體系及條件參照相關文獻[14]，擴增后PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像儀讀數。

3 結果

3.1 腹瀉病原菌的分離鑒定

3.1.1 培養特性 根據分離菌株在培養基上的生長特性，結合染色鏡檢最終鑒定出40株革蘭氏陰性分離菌株均符合大腸桿菌特性；XLT4平板上未見黑色中心，周圍有透明暈環菌落，再經過Stn基因的分離檢測也未見目的條帶，可見糞檢病原菌中無沙門菌存在。

3.1.2 生化特性 生化特性檢測發現分離菌株基本符合大腸桿菌的生化培養特征，再結合其培養特性和形態特征，將造成此次牦牛腹瀉的病因歸結于大腸桿菌病。

3.1.3 16S rRNA序列P基因的擴增 由圖1可知，擴增所得片段大小約為1.5 kb，條帶單一，無明顯非特異性擴增現象。部分菌株的P基因擴增結果見圖1，在1 500 bp左右有特異性條帶，與目的條帶大小一致。

表1 12種抗菌藥物的藥敏試驗判定標準

圖1 部分菌株的P基因電泳

3.2 藥敏試驗

40株西藏牦牛源大腸桿菌對12種常見藥物均存在不同程度的耐藥性，具體數據見表2。

表2 40株大腸桿菌分離株藥敏試驗結果

4 討論

4.1 西藏牦牛源腹瀉病原菌分離鑒定結果

通過細菌分離鑒定，共獲得40株西藏牦牛源大腸桿菌，確定導致此次牦牛腹瀉的主要原因是大腸桿菌病。

4.2 西藏牦牛源腹瀉病原菌耐藥性流行特點

藥物敏感性結果顯示，本試驗所分離的腹瀉病原菌對青霉素、磺胺類藥物的耐藥率分別為60%、82.5%，由此可見西藏牦牛源大腸桿菌對常用抗生素存在一定的耐藥性，尤其對磺胺類藥物耐藥性最嚴重。結合藥敏試驗結果，建議該牛場可優選氨基糖胺類和喹諾酮類藥物進行治療。

4.3 合理用藥，減少耐藥現象

細菌耐藥性問題已成為國際難題，本研究也發現分離菌株對常用抗生素存在一定的耐藥性。因此，臨床用藥時要注意合理使用抗生素，并對耐藥流行情況進行監測以防耐藥性的產生[15]。