不同孵化方式對仔雞盲腸菌群多樣性的影響

陳曉蕾 陳 榮 黃瑞玲 許麗惠 福建農林大學動物科學學院（蜂學學院） 福州 350002

腸道中存在數量巨大、種類復雜的細菌，它們參與宿主對營養物質的消化、吸收和代謝，影響外來致病菌在腸道內定植，調節免疫系統，保護宿主健康，提高其生產力[1]，異常的微生物群落發育可改變腸道微生物的定植，導致過敏、胃腸道疾病、肥胖、糖尿病和免疫系統發育改變等[2]。

孵化是禽類繁殖活動的一種特殊方式，分為孵化機孵化和母雞孵化。孵化機孵化相比于母雞孵化而言，可以降低母雞的就巢性，縮短母雞的就巢時間，減少母雞的體力消耗，提高產蛋率、孵化率和雛雞成活率，人工孵化技術在養雞業上大大提高了生產效率[3]。

最新研究表明，分娩方式是影響新生兒在嬰兒期腸道菌群組成的一個重要因素，剛出生的嬰兒很快就會受到來自母親和周圍環境微生物的定植，兒童期和生命后期的疾病可能是由嬰兒期腸道菌群的定植擾亂所干預的。在哺乳動物中，順產的新生動物出生時立即被暴露于產道，剖腹產的幼畜則由于沒有通過產道導致其腸道菌群多樣性發生了改變[4]。由蛋孵化出生的動物與哺乳動物有很大不同，但它們具有新生兒幾乎立即暴露在母體微生物菌群的共同特點。母雞孵化的仔雞最早是與蛋殼表面和巢穴周圍環境的細菌接觸，其腸道菌群與此有關，但是該過程仔雞容易感染母雞生殖系統內的致病菌。機器孵化通常要對蛋進行清洗和熏蒸，從而達到滅菌的效果，因此，孵化機孵化的仔雞出殼后最先接觸到的是孵化機內的環境[5]，可以減少新生仔雞接觸病原菌。

腸道微生物種類繁多，通過傳統測序法很難全面了解腸道菌群的組成，近年來，高通量測序技術分析微生物群落得到了快速的發展，大量有關腸道微生物群落的研究取得了新進展[6]。本研究選擇母雞孵化和孵化機孵化兩種孵化方式，分別采集仔雞出殼前1 d、出殼后7 d和14 d的盲腸內容物，從中提取基因組DNA，進行Illumina-Miseq高通量測序，分析不同孵化方式對新生仔雞盲腸微生物多樣性的影響，研究結果對于改善仔雞腸道健康和提高商品雞生產性能提供重要的基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 8羽健康母雞，以及所產的54枚種蛋，由福建某雞場提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組 種蛋隨機分為兩組，J組采用孵化機孵化，M組采用母雞自然孵化，分別在出殼前1 d和出殼后7 d、14 d隨機選擇3枚蛋或雞采集盲腸內容物，分別命名為J0、J1、J2和M0、M1、M2。

1.2.2 孵化與采集樣本 兩組蛋同一天開始孵化，6 d后進行照蛋，觀察胚胎發育是否正常，挑出無精蛋和死精蛋；18 d時進行第二次照蛋，挑出死胚蛋，并將J組發育正常的蛋移入出雛機中；21 d時，兩組各挑選3枚未破殼的蛋，在超凈臺內采集盲腸，立即放置-80℃冰箱中保存。仔雞孵出后全程單籠飼養，飼養環境、飼養營養和管理均保持一致，分別在出殼后7 d、14 d隨機選擇3羽雞，在超凈臺內采集盲腸內容物，充分混合均勻，分裝入提前滅菌好的離心管中，將采集的樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行腸道菌群檢測分析。

1.2.3 數據分析與處理 獲得有效數據后進行OTU（Operational taxonomic units）聚類及物種分類分析，針對OTU的聚類結果，對每個樣本所代表的OTU進行物種注釋，進而得到對應的物種信息以及基于物種的豐度分布情況。并且分析OTU的物種豐度、物種Alpha多樣性及Venn圖等，獲得樣品中物種豐度及多樣性、不同組別或不同樣本間所共有的和特有的OTU信息等。

2 結 果

2.1 測序結果 J0組和M0組的有效序列數量較少；J1組平均獲得65 602個有效序列，52 985個高通量序列；J2組共獲得67 321個有效序列，53 814個高通量序列；M1組共獲得64 122個有效序列，48 448個高通量序列；M2組共獲得63 272個有效序列，42 884個高通量序列（見表1）。

表1 有效序列和高通量序列的統計結果

2.2 OTU分析

2.2.1 OTU Venn圖分析 OTU Venn圖（見圖1），圖中不同顏色的圖形代表不同組別，不同顏色的圖形之間交疊部分數字為不同組別共有的OTU個數。從圖中可以看出，在97%的相似水平下對所有序列進行OTU劃分，共產生319個OTU，4組共同擁有156個OTU，占總OTU的48.90%；J1組與M1組共產生289個OTU，共同擁有174個OTU，其中M1組獨有的OTU個數較多，為96個；J2組與M2組共產生306個OTU，共同擁有184個OTU，其中M2組獨有的OTU個數較多，為111個。結果表明，不同孵化方式出生的仔雞盲腸菌群組成不同。

2.2.2 OTU PCA分析 圖2為基于OTU水平的PCA，X軸為PC1，Y軸為PC2，括號內的百分比表示對樣本組成差異的解釋度值，X軸與Y軸的刻度是相對距離，圖中各點表示各個樣本，不同顏色的點代表不同組別的樣本，點越接近表明樣本物種組成越相似。從圖中可以看出，J1組與M1組在PC1和PC2方向均存在分離，J2組與M2組的差異主要來自于PC1。

圖1 OTU Venn圖

圖2 基于OTU水平的PCA

2.3 Alpha多樣性分析 從表2和圖3可以看出，J1組的Chao1指數、ACE指數和Shannon指數顯著低于M1組（P＜0.05），Simpson指數顯著高于M1組（P＜0.05）；J2組的Chao1指數、ACE指數和Shannon指數顯著低于M2組（P＜0.05），Simpson指數顯著高于M2組（P＜0.05）。其中，Chao1指數和ACE指數用于反映群落豐富度，指數值越大，表明樣本中物種越豐富；Shannon指數和Simpson指數反映群落多樣性，Shannon指數值越大，表明群落多樣性越大，Simpson指數值越低，表明群落多樣性越大?？梢娔鸽u孵化出生的仔雞盲腸菌群豐富度和多樣性高于孵化機孵化。

表2 Alpha多樣性指數分析

圖3 Alpha多樣性指數的稀釋曲線

2.4 組間物種豐度差異分析 物種差異性檢驗柱狀圖可以直觀地展示豐度均值總和較大的物種的平均相對豐度，基于物種的豐度情況，運用Welch T檢驗分析不同組別表現出豐度差異的物種，對P值進行FDR校正，評估差異的顯著性。

2.4.1 門水平組間物種豐度差異分析 在門水平上，仔雞盲腸內容物中主要的菌門有（見圖4）：厚壁菌門（Firmicutes）、Campilobacterota、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）。4組樣品的優勢菌門均為厚壁菌門，J1組厚壁菌門的豐度極顯著高于M1組（P＜0.01），M1組Campilobacterota的豐度極顯著高于J1組（P＜0.01）；J2組厚壁菌門的豐度顯著高于M2組（P＜0.05），M2組變形菌門的豐度顯著高于J2組（P＜0.05）。

2.4.2 綱水平組間物種豐度差異分析 在綱水平上，仔雞盲腸內容物中主要的菌綱有（見圖5）：梭菌綱（Clostridia）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、Campylobacteria、γ-變 形 菌 綱（Gammaproteobacteria）、Coriobacteriia、未分類的厚壁菌門（unclassified_p__Firmicutes）、擬桿菌綱 （Bacteroidia）、放線菌綱（Actinobacteria）、厚壁菌綱（Negativicutes）。4組樣品的優勢菌綱均為梭菌綱，J1組梭菌綱的豐度極顯著高于M1組（P＜0.01），M1組彎曲菌綱的豐度極顯著高于J1組（P＜0.01）；J2組梭菌綱的豐度顯著高于M2組（P＜0.05），M2組芽孢桿菌綱、γ-變形菌綱和未分類的厚壁菌綱顯著高于J2組（P＜0.05）。

圖4 門水平物種差異性檢驗柱狀圖

圖5 綱水平物種差異性檢驗柱狀圖

2.4.3 目水平組間物種豐度差異分析 在目水平上，仔雞盲腸內容物中主要的菌目有（見圖6，僅展示豐度均值總和前15位的菌目）：毛螺菌目、顫螺菌目、梭菌_UCG-014目（Clostridia_UCG-014）、彎曲桿菌目、乳桿菌目（Lactobacillales）、丹毒絲菌目（Erysipelotrichales）、肽鏈球菌-組織菌目（Peptostreptococcales-Tissierellales）、腸桿菌目（Enterobacterales）、Clostridia_vadinBB60_group、單球菌目、Christensenellales、芽孢桿菌目（Bacillales）、未分類的厚壁菌。J1組乳桿菌目的豐度顯著高于M1組（P＜0.05），M1組Oscillospirales、梭菌_UCG-014目 、Campylobacterales、Clostridia_vadinBB60_group、Christensenellales、芽孢桿菌目的豐度顯著高于J1組（P＜0.05）；J2組乳桿菌目的豐度極顯著高于M2組（P＜0.01），M2組Oscillospirales、Clostridia_UCG-014、Peptostreptococcales-Tissierellales、Clostridia_vadinBB60_group的豐度極顯著高于J2組 （P＜0.01），M2組乳桿菌目、腸桿菌目、未分類的厚壁菌目的豐度顯著高于J2組（P＜0.05）。

2.4.4 科水平組間物種豐度差異分析 在科水平上，仔雞盲腸內容物中主要的菌科有（見圖7，僅展示豐度均值總和前15位的菌科）：毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、螺桿菌科（Helicobacteracea）、norank_o__Clostridia_UCG-014、Eubacterium_coprostanoligenes_group、Oscillospiraceae、Butyricicoccaceae、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、norank_o__Clostridia_vadinBB60_group、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、Christensenellaceae、Peptostreptococcaceae、Butyricicoccaceae、unclassified_o__Oscillospirales、明串珠菌科（Leuconostocaceae）。J1組毛螺旋菌科的豐度顯著高于M1組（P＜0.05），M1組瘤胃菌科的豐度高于J1組（P＞0.05），norank_o__Clostridia_UCG-014、螺桿菌科、Oscillospiraceae、norank_o__Clostridia_vadinBB60_group的豐度極顯著高于J1組（P＜0.01），Eubacterium_coprostanoligenes_group、Christensenellaceae的 豐 度顯著高于J1組（P＜0.05）；J2組毛螺旋菌科的豐度極顯著高于M2組（P＜0.01），Butyricicoccaceae的豐度顯著高于M2組（P＜0.05），M2組norank_o__Clostridia_vadinBB60_group、瘤胃菌科、norank_o__Clostridia_UCG-014、Peptostreptococcaceae的豐度極顯著高于J2組（P＜0.01），乳桿菌科、Oscillospiraceae、腸桿菌科、Butyricicoccaceae、unclassified_o__Oscillospirales、明串珠菌科的豐度顯著高于J2組（P＜0.05）。

圖7 科水平物種差異性檢驗柱狀圖

2.4.5 屬水平組間物種豐度差異分析 在屬水平上，仔雞盲腸內容物中主要的菌屬有（見圖8，僅展示豐度均值總和前 15位 的菌屬）：Ruminococcus_torques_group、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、未分類的毛螺菌科（unclassified_f__Lachnospiraceae）、norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014、norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group、 螺桿菌屬（Helicobacter）、Butyricicoccus、Eisenbergiella、乳桿菌屬（Lactobacillus）、Shuttleworthia、La chnoclostridium、Blautia、Lachnoclostridium、norank_f__Ruminococcaceae、Subdoligranulum、大腸埃氏菌屬-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）、Shuttleworthia、Lachnospiraceae_NK4A136_group。J1組Ruminococcus_torques_group、未分類的毛螺菌科、Lachnoclostridium的豐度顯著高于M1組（P＜0.05），M1組糞桿菌屬、norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014、norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group、螺桿菌屬的豐度顯著高于J1組（P＜0.05），Shuttleworthia的豐度極顯著高于J1組（P＜0.01）；J2組Ruminococcus_torques_group、未分類的毛螺菌科的豐度極顯著高于M2組（P＜0.01），norank_f__Ruminococcaceae、Subdoligranulum、Butyricicoccus、Shuttleworthia的豐度顯著高于M2組（P＜0.05），M2組 norank_f__norank_o__Clostridia_UCG -014、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_NK4A136_group的豐度極顯著高于J2組（P＜0.01），糞桿菌屬、乳桿菌屬、Eisenbergiella、大腸埃氏菌屬-志賀氏菌屬的豐度顯著高于J2組（P＜0.05）。

圖8 屬水平物種差異性檢驗柱狀圖

2.4.6 種水平組間物種豐度差異分析 在種水平上，仔雞盲腸內容物中主要的菌種有（見圖9，僅展示豐度均值總和前15位的菌種）：未培養的糞桿菌屬（uncultured_bacterium_g_Faecalibacterium）、幽門螺桿菌（Helicobacter pullorum）、uncultured_bacterium_g__Ruminococcus_torques_group、unclassified_f__Lachnospiraceae、未培養的瘤胃球菌（uncultured_bacterium_g__Ruminococcus_torques_group）、unclas_sifiedg__norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014、uncultured_Subdoligranulum_sp、uncultured_bacterium_g__Shutt-leworthia、uncultured_organism_g__Lachnoclostridium、Escherichia_coli_g__Escherichia-Shigella。J1組unclassified_f__Lachnospiraceae、uncultured_bacteriu_mg_Ruminococcus_torques_group、uncultured_Subdol-igranulum_sp、uncultured_Clostridiales_bacterium_g__Ruminococcus_torques_group的豐度顯著高于M1組（P＜0.05）；M1組unclassified_g__norank_f__norank_o__Clostridia_UCG、uncultured_bacterium_g__Shuttl-eworthia的豐度極顯著高于J1組（P＜0.01），gut_met-agenome_g__norank_f__Eubacterium_coprostanolige-n es_group、幽門螺桿菌、Butyricicoccus_pullicaecorum的豐度顯著高于J1組（P＜0.05）；J2組unclassified_f__Lachnospiraceae、uncultured_bacterium_g__Rumin-ococcus_torques_group、uncultured_Clostridiales_bac-terium_g__Ruminococcus_torques_group的豐度極顯著高于M2組（P＜0.01），M2組uncultured_bacterium_g__Faecalibacterium、Lactobacillus_oris、unclassified_g__Lactobacillus、uncultured_bacterium_g__Eisenber-giella的豐度顯著高于J2組（P＜0.05）。

圖9 種水平物種差異性檢驗柱狀圖

3 討 論

在雞的腸道內寄生多種多樣的微生物，通常稱之為腸道菌群，腸道菌群在雞體內發揮許多重要的作用，它們可以提供消化酶來源，提高營養物質的利用率；與侵入的病原菌競爭，使之無法接近腸黏膜上的附著位點；激活宿主的免疫系統，提高機體免疫防御功能。異常的腸道菌群也會表現出一些不利的方面，例如，它們與宿主競爭腸道內的營養，分泌有毒化合物，誘導炎癥反應的發生，刺激上皮細胞快速更新，從而導致雞的生長性能下降。

最新研究表明，新生動物的生產過程對其腸道菌群的多樣性構成具有決定性的意義，剛出生的嬰兒很快就會受到來自母親和周圍環境微生物的定植，剖腹產與自然順產方式出生的新生哺乳動物的腸道菌群多樣性不同[7]。雞與哺乳動物不同，其通過孵化的方式出生，主要是母雞孵化和孵化機孵化。母雞孵化的仔雞出殼后最先接觸到的是蛋殼表面、母雞以及窩巢周圍環境；孵化機孵化之前，通常會將蛋進行清洗滅菌[8]，出殼后最先接觸到的是出雛機內的環境。本研究采用兩種孵化方式，即母雞孵化和孵化機孵化，分別采集仔雞出殼前1 d、出殼后7 d和14 d的盲腸內容物，基于高通量測序探究不同孵化方式出生的仔雞盲腸微生物群落多樣性的差異。

根據OTU Venn圖分析可知，M組的OTU個數多于J組，表明不同孵化方式會影響仔雞盲腸菌群的豐度，且母雞孵化的仔雞菌群豐度更高?；贠TU水平的PCA結果顯示，J1組與M1組在PC1和PC2方向上差異較大，J2組與M2組的差異主要在PC1，表明不同孵化方式會影響仔雞盲腸的物種組成。Alpha多樣性分析結果顯示，M1組和M2組的Chao1指數、ACE指數及Shannon指數顯著高于J1組和J2組（P＜0.05），Simpson指數顯著低于J1組和J2組（P＜0.05），表明采用母雞孵化出生的仔雞盲腸菌群豐富度和多樣性大于孵化機孵化的仔雞，推測可能是由于母雞孵化的仔雞出殼后最先接觸的環境較為復雜，蛋殼表面以及巢穴周圍環境的細菌迅速在仔雞的腸道定植所致。

在門水平上，4組樣本的核心菌門均為厚壁菌門，與張亞楠[9]和楊天龍等[10]的研究結果一致。在綱水平上，4組樣本的核心菌綱均為梭菌綱，與賈福晨等[11]基于高通量測序分析雞腸道細菌群落分布特征得出的結論一致。在目水平上，M2組的乳桿菌目和腸桿菌目的豐度顯著高于J2組；高巖等[12]研究表明乳桿菌目可以調節腸道菌群的平衡，降低新生動物的腹瀉率，張春寶[13]研究表明乳桿菌目可以有效抑制腸道內大腸桿菌的數量，由此推測母雞孵化出生的小雞在腸道菌群平衡方面優于機器孵化。在科水平上，J組的毛螺菌科相對豐度高于M組，尹振晨[14]研究表明毛螺菌科與糖類、脂類和蛋白質的代謝有關；M2組的瘤胃菌科和乳桿菌科相對豐度較高，其中瘤胃菌科是活性植物降解劑，可以降解宿主難以消化的纖維素和半纖維素[15]，母雞孵化的仔雞可能由于出生后的環境不同于機器孵化的仔雞，優先定植的細菌不同，使得其腸道內的瘤胃菌科豐度較高，有利于消化飼料中的纖維素。在屬水平上，M組的糞桿菌屬是優勢菌屬，糞桿菌屬是常見的產丁酸菌，產丁酸菌作為腸道的益生菌，對動物的生理機能具有重要意義[16]，而丁酸作為腸道微生物重要的代謝產物，它能夠參與宿主的代謝，影響基因表達[17]；M2組的乳桿菌屬豐度高于J2組，乳桿菌屬是動物腸道的益生菌群，具有維持動物機體健康和免疫調節功能，其能夠利用葡萄糖進行發酵并產生乙酸和乳酸等降低腸道pH，抵御外來病原菌的入侵，促進有益菌的生長繁殖，調節營養的吸收利用。在種水平上，M1組中檢測出幽門螺桿菌，幽門螺桿菌感染是引起人慢性胃炎、消化性潰瘍的病因之一，與胃癌以及胃黏膜相關淋巴組織淋巴癌的發生密切相關[18]；M2組中存在一定量的志賀氏菌，志賀氏菌感染會導致雞出現痢疾、消瘦和明顯的腸道病變等[19]，志賀氏菌也可以通過糞口途徑感染人，最常見的癥狀是腹瀉、發燒、嘔吐、腸胃脹氣等[20]，需要注意幽門螺桿菌和志賀氏菌的公共衛生安全意義。

綜上所述，不同孵化方式對仔雞盲腸微生物的多樣性和豐度有顯著影響，使用孵化機孵化的仔雞盲腸內檢測到的菌群均為正常菌群，而母雞孵化的仔雞出殼后接觸到的環境較為復雜，致使仔雞盲腸內存在部分病原菌，但也存在乳酸桿菌屬、糞桿菌屬等有益菌屬，它們可以抵抗病原菌的定植，參與營養物質的消化、吸收和代謝。

4 結 論

本研究分析了不同孵化方式對仔雞盲腸菌群多樣性的影響，證明了孵化方式會影響腸道菌群的定植，進而影響腸道內菌群的豐度和多樣性，研究結果對于改善仔雞腸道健康和提高商品雞生產性能具有一定參考價值。

致 謝王全溪副教授對本研究和論文進行了精心指導，并提供參考資料，特此致謝。