小麥粉及其制品中偶氮甲酰胺檢測方法研究進展

田林雙，顧鵬程，吳存兵，徐 澳，豆雪梅，史鳳珍，陳 飛*

（1.江蘇財經職業技術學院糧食與食品藥品學院，江蘇 淮安 223003；2.南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210023）

偶氮甲酰胺（azodicarbonamide，ADA）是橡膠、泡沫塑料制作中常用的發泡劑[1]，在食品行業中，ADA是小麥粉常用的食品添加劑，最大容許添加量為45 mg/kg[2]。ADA能夠氧化小麥粉中的巰基 （—SH）形成二硫鍵（S—S），使蛋白質鏈相互連接形成網狀結構，從而改善面團成型能力，提高烘焙食品的靈活性和韌性。ADA還可以氧化小麥粉中的天然色素，提高小麥粉白度[3]。在中國、美國、加拿大、巴西等國家，ADA被用作小麥粉增白劑、面筋強化劑和面團調節劑[4]。

圖1[5]為ADA在小麥粉儲存和加工過程中的化學變化。ADA在干小麥粉中性質穩定，當小麥粉與水混合后，ADA迅速轉化為聯二脲（biurea，BIU），BIU在常溫環境下性質穩定[6]，但在面制品加工過程中，蒸煮、焙烤、油炸等高溫環境會促使BIU部分降解為氨基脲（semicarbazide，SEM）[5,7-8]。ADA及其分解產物有潛在的食品安全風險，人吸入ADA可能會導致過敏和 哮喘[9-10]。SEM是獸藥呋喃西林的代謝物[11-12]，動物實驗證明SEM能夠致癌、致畸、致突變，可干擾神經系統和內分泌系統[13-15]。目前，歐盟和澳大利亞、新西蘭、新加坡、日本等地區和國家禁止在食品中添加ADA。

圖 1 ADA在小麥粉儲存和加工過程中的化學變化[5]Fig. 1 Chemical changes of ADA in wheat flour during storage and processing[5]

小麥粉及其制品中ADA的檢測方法可分為直接檢測法和間接檢測法[16]。直接檢測法以ADA為目標檢測物，間接檢測法以ADA分解產物BIU和SEM為目標檢測物。ADA在濕熱環境下很快轉化為BIU[5]，導致小麥粉制品中很難檢出ADA，因此ADA直接檢測法不能準確反映小麥粉中ADA的初始添加量，需要結合ADA間接檢測法進行判斷。

近年來，為了簡化分析步驟、縮短分析時間、減少大型分析儀器使用、促進檢測方法在不同條件實驗室的普及并滿足快速、現場檢測的需要，出現了許多ADA檢測新方法[14,16-24]，本文綜述了小麥粉及其制品中ADA檢測研究進展，分析了當前我國現行ADA檢測標準存在的問題，展望了ADA分析檢測研究的發展趨勢，為ADA分析檢測研究與實踐提供參考。

1 偶氮甲酰胺直接檢測法

1.1 高效液相色譜法

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法發展于20世紀60年代，適用于多種有機化合物的分析檢測，在食品、化工、醫藥等領域應用廣泛，目前儀器普及度較高，該法是檢測小麥粉及其制品中ADA最常用的方法[25]，我國出入境 檢驗檢疫行業標準SN/T 4677—2016《出口食品中偶氮甲酰胺的測定方法 高效液相色譜法》[26]也采用此方法，該標準采用丙酮作為提取溶劑，使用氰基（—CN）色譜柱，檢測波長245 nm，定量限為1 mg/kg，回收率為76%～103.8%。由于ADA性質不穩定，SN/T 4677—2016要求ADA標準工作液和樣品溶液的測定應在4 h內完成。關于HPLC法檢測小麥粉及其制品中ADA的研究已有多篇文獻[27-29]報道，各方法主要在ADA提取與凈化、分離條件選擇、ADA柱前衍生化3 個方面有所區別。

ADA提取溶劑主要有丙酮[28,30-31]、乙腈[32]、N,N-二甲基甲酰胺[33]和二甲基亞砜[34]。丙酮具有易揮發、毒性低、黏度小等優點，大部分研究者選擇丙酮作為提取溶劑。ADA在N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中的溶解度較高，但與丙酮相比，提取溶劑N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜不易從樣品中分離，殘留的提取溶劑對ADA色譜柱分離和紫外檢測都會產生較大干擾[35]。

適用于ADA分離的色譜柱主要有C18色譜柱[8,36]、 —CN色譜柱[37-38]和硅膠色譜柱[28]。ADA極性較大，在C18反相色譜柱中保留時間較短[39]，而在—CN色譜柱中更利于分離。ADA最大紫外吸收波長為245 nm，其次為275 nm，大部分研究者選擇245 nm作為測定波長[28,40]，但245 nm波長處提取溶劑N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜會產生紫外吸收干擾，因此一些研究者會選擇275 nm作為測定波長[34]。

為了進一步提高檢測方法的靈敏度，Yasui等[29]采用三苯基膦衍生化ADA，衍生化產物（ADA-三苯基膦）紫外吸收強，色譜柱分離效果好，小麥粉中ADA在0.25～100 mg/kg范圍內，與紫外吸收信號呈良好的線性關系，相關系數為0.9999，ADA回收率為86.9%～101.0%，定量限為0.25 mg/kg，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.9%～3.4%。

1.2 熒光比色法

與HPLC法相比，熒光比色法具有操作簡便、直觀、成本低、靈敏度高、選擇性好等特點。Chen Junyang等[19]合成基于硅納米顆粒（silicon nanoparticle，SiNPs）和量子點（quantum dot，QDs）的熒光探針（SiNPs@QDs）（圖2），該探針在445 nm和632 nm波長處分別有兩個分辨率良好的發射峰。632 nm波長處的熒光峰可被汞離子（Hg2+）猝滅，而在還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）存在的情況下，GSH的—SH與Hg2+親和力更強，632 nm波長處的熒光峰又被恢復。添加ADA后，GSH的巰基被氧化成S—S，生成氧化型GSH（glutathione oxidized，GSSG），Hg2+重新釋放出來，引起632 nm波長處的熒光再次猝滅，而SiNPs@QDs在445 nm波長處的熒光強度始終不變。該方法的ADA濃度在0.05～4 μmol/L 范圍內，與熒光強度比（F632nm/F445nm）存在良好的 線性關系，相關系數為0.995。該法檢測小麥粉中ADA的檢出限為1.86 μg/kg，回收率為96.3%～104%，RSD為4.6%～8.3%。

圖 2 熒光探針SiNPs@QDs制備過程與ADA檢測原理[19]Fig. 2 Schematic diagram displaying the preparation of SiNPs@QDs probe and the mechanism for ADA detection[19]

1.3 分光光度法

分光光度計價格便宜，是各級實驗室常用的分析儀器。基于該設備，Chen Zhiqiang等[16]開發了一種基于肉眼觀察或者可見光分光光度計定量小麥粉中ADA濃度的方法（圖3）。GSH與金納米顆粒（gold nanoparticle，AuNPs）通過Au—SH共價交聯，形成網絡結構，引起AuNPs聚合而產生顏色變化。ADA與GSH反應，使GSH失去—SH基團，從而降低AuNPs的聚合度，導致AuNPs分散。該法檢測時間僅為2 h，當ADA濃度大于0.33 μmol/L 時，肉眼即可明顯觀察到顏色變化。借助可見光分光光度計，ADA檢出限可低至0.23 μmol/L。該法用丙酮超聲提取小麥粉中ADA，氮吹濃縮，過膜檢測，僅依靠肉眼觀察，小麥粉中ADA檢出限為5.86 μg/g，借助分光光度計，ADA檢出限為3.5 μg/g，回收率為91%～104%，RSD為4%～6%[16]。綜上，分光光度法使用儀器少、成本低、速度快，適用于現場檢測。

圖 3 AuNPs分光光度法檢測ADAFig. 3 Visual detection of ADA based on ADA-induced anti-aggregation of gold nanoparticles[16]

1.4 紅外光譜法

紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）技術具有樣品前處理簡單、樣品破壞少、對環境友好、一次分析可獲得樣品中多個組分信息等優點，已廣泛應用于多種物質的定量、定性分析。早在1983年，Osborne[41]同時測定了小麥粉中抗壞血酸、ADA和半胱氨酸含量。Gao Shang等[42]用近紅外光譜結合徑向基函數法對小麥粉中的ADA進行定量分析，對ADA含量較低的樣品進行二次建模，顯著提高了預測精度。Che Wenkai等[23]對101 個不同ADA含量的小麥粉樣品進行光譜掃描，得到400～2498 nm波長范圍的光譜數據，選取4 個波段（400～438、1480～1852、1896～1938、2048～2380 nm）作為特征波段，采用徑向基函數建立預測模型，小麥粉中ADA檢出限為3.2 mg/kg，相關系數、均方根誤差、模型性能指數分別達到0.99996、0.5467、116.5858。

1.5 高光譜成像法

高光譜成像技術融合了光譜技術和機器視覺技術，采集的高光譜圖像包含物質的光譜信息和圖像信息，能夠實現樣品內外部物質成分的定性分析、定量分析和可視化表達[43]。關于小麥粉中ADA高光譜成像技術檢測，王曉彬等[20]找出了小麥粉中ADA的4 個特征吸收波段，分別為1574.38、2038.55、2166.88 nm和2269.91 nm，采用光譜相似性分析對單像素點光譜進行計算，該法可以對不同ADA添加量的小麥粉進行分類。其還采用二值圖像重構算法，對不同ADA添加量的小麥粉進行識別，ADA像素與ADA含量呈良好的線性關系，相關系數為0.9845，ADA檢出限為0.2 g/kg。

1.6 太赫茲時域光譜法

太赫茲（terahertz，THz）波是指波長為3000～30 μm范圍內的電磁波，在長波段與毫米波相重合，在短波段與紅外光重合，太赫茲時域光譜（terahertz time-domain spectroscopy，THz-TDS）法能夠獲取物質的物理結構和化學成分等重要信息。THz-TDS法輻射能量小，不會對被測物質產生破壞，適用于樣品無損檢測[44]。 方虹霞等[45]比較分析了純ADA、純小麥粉以及混有ADA小麥粉的THz-TDS，發現ADA在1.93 THz處有一個明顯的特征吸收峰，選擇偏最小二乘法定量分析小麥粉中ADA，相關系數達0.9999，標準誤差為0.06%，小麥粉中ADA檢出限為1.1 g/kg。GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》[2]規定ADA在小麥粉中的最大容許添加量為 45 mg/kg，目前該法靈敏度較低，還需要對其進行改進。

1.7 表面增強拉曼光譜法

與IR信號相比，大多數樣品的拉曼光譜信號較弱，這客觀上限制了拉曼光譜的應用和發展。但當樣品吸附于具有納米量級粗糙度的金、銀等金屬結構表面時，樣品分子的拉曼光譜信號將得到極大的增強。 自20世紀70年代表面增強拉曼光譜（surface enhancement Raman spectroscopy，SERS）法被首次報道以來，其應用受到了廣泛的關注。SERS法具有靈敏度高、選擇性強、無熒光等特性[46]，在食品安全、環境保護等領域具有廣闊的應用前景[47]。Li Menghua等[48]合成具有強等離子體共振的銀包金納米粒子（Au@AgNPs）（圖4），Au@AgNPs對含NH2的ADA有較強的吸附作用，ADA的拉曼光譜信號因此獲得顯著增強，即使ADA的濃度低至1×10-7mol/L，也能產生較為明顯的拉曼光譜信號，其建立了一種簡便、快速、靈敏、廉價、無標記的ADA檢測方法，水、小麥粉、饅頭樣品中ADA的檢出限分別為11.6 μg/kg、1.16 mg/kg和2.32 mg/kg，回收率在81%～95%之間。

圖 4 Au@AgNPs SERS法檢測ADA[48]Fig. 4 Surface enhancement Raman spectroscopic detection of ADA using Au@AgNPs as Raman amplifier[48]

1.8 電化學分析法

電化學分析法基于電化學原理和物質的電化學性質，借助電化學分析系統來實現物質的分析檢測。相對于色譜、光譜、質譜等儀器，電化學分析法儀器操作簡單、價格低廉。趙常志等[22]利用ADA在Nafion膜電極上的伏安響應，用差分脈沖伏安法測定小麥粉中ADA質量濃度。ADA質量濃度在0.93～10.5 μg/L之間，與Nafion膜電極的電流響應呈線性關系，相關系數為0.9992，ADA檢出限為0.58 μg/L。該法檢測小麥粉中ADA的檢出限為5.8 μg/kg，回收率為95.8%～104%，RSD小于5.9%。

2 基于聯二脲檢測的偶氮甲酰胺間接檢測法

與ADA相比，BIU少了一個生色基團C＝C，因此，BIU的紫外吸收性能降低，熒光吸收與發射靈敏度減弱，配備紫外、熒光檢測器（fluorescence detector，FLD）的液相色譜（liquid chromatography，LC）難以用于BIU分析檢測。目前對于小麥粉及其制品中BIU的檢測研究報道較少，已報道的文獻中均使用液相色譜-質譜 （LC-mass spectrometer，LC-MS）聯用儀（表1），電離源選用電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）或大氣壓化學電離源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI），質譜質量分析器選用四極桿質量分析器。根據是否對BIU進行衍生化，分為BIU直接測定和BIU衍生后測定。

BIU在常見的C18色譜柱中分離效果差，大部分研究者選用氨基色譜柱，Mulder等[49]采用TSK酰胺類柱，用13C,15N2-SEM和13C-氰化鉀合成了內標標準物13C,15N2-BIU， LC-MS法測定包裹小麥粉的禽肉和海產品中BIU，檢出限為10 μg/kg。Lim等[50]測定小麥粉和焙烤食品中的BIU，比較了質譜儀ESI正離子和負離子兩種電離模式，結果表明BIU對ESI正離子模式敏感度更高，樣品中BIU檢出限為3 μg/kg。袁麗紅等[51]建立了小麥粉和饅頭中BIU的檢測方法，采用固相萃取凈化BIU提取溶液，去除溶液中雜質，減弱了離子抑制，因此該法不需要價格昂貴的同位素內標，BIU的線性范圍為0.5～20 μg/kg，相關系數為0.9992，檢出限為0.1 μg/kg。阮莎莎[52]測定小麥粉、饅頭、面包、油條和面條中BIU，采用純水直接提取樣品中BIU，對于油條等油脂含量較高的樣品，用乙腈飽和的正己烷脫脂，采用同位素內標法定量，BIU質量濃度在0.2～100 μg/L范圍內，線性良好，相關系數為0.9999，BIU檢出限為5 μg/kg。趙悠悠等[53]認為普遍采用的ESI對BIU的電離效果沒有APCI效果好，其采用HPLC-APCI-MS測定面包中BIU。該法比較了水、甲醇、乙腈、5% DMF-水溶液4 種溶劑對面包中BIU的提取效果，結果表明80 ℃熱水超聲提取效果最佳。面包中BIU在0.2～10.0 mg/kg范圍內，線性良好，檢出限為 0.15 mg/kg，回收率為82%～110%，RSD為3.3%～4.1%。

為了進一步提高BIU在質譜檢測器中的響應，王雅等[54]用高錳酸鉀把BIU氧化為ADA，再用甲苯亞磺酸鈉對ADA進行衍生化，LC-MS法測定衍生化產物，用該法檢測小麥粉、饅頭、面包、油條、方便面中BIU，樣品中BIU在1～20000 μg/kg之間，線性良好，相關系數為0.9999，BIU檢出限低至0.15 μg/kg，回收率為78.3%～108.0%，RSD小于5.73%。

表 1 LC-MS法檢測小麥粉及其制品中ADA轉化產物BIUTable 1 Determination of ADA decomposition product BIU in wheat flour and its products by liquid chromatography-mass spectroscopy

3 基于氨基脲檢測的ADA間接檢測法

3.1 液相色譜-串聯質譜法

液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法儀器靈敏度高，適用于痕量物質定性與定量分析，用該法檢測SEM，檢出限一般低于1 μg/kg，是食品中SEM檢測的首選方法[55]。SEM以游離和結合兩種形式存在于食品基質中，酸法提取可以釋放食品基質中全部的SEM[8,56]。SEM的相對分子質量為75，ESI基體干擾大、靈敏度較低，用2-硝基苯甲醛過夜衍生化后，衍生物電離效率和在反相色譜柱中的保留能力均有提升[8]。HPLC-三重四極桿質譜是 LC-MS/MS法檢測小麥粉及其制品中SEM常用的儀器，該法首先將小麥粉及其制品中的ADA進行濕熱處理，使ADA轉化為SEM，然后用2-硝基苯甲醛衍生化SEM，最后通過測定SEM衍生化產物的量來間接計算ADA含量[8,56-58]。 為了進一步提高方法的靈敏度，黎娟等[59]用HPLC-四極桿/離子阱質譜測定小麥粉及其制品中SEM，檢出限低至0.1 μg/kg。雖然LC-MS/MS法高度靈敏，但也存在繁瑣、耗時、儀器昂貴等缺點，不利于方法的普及。

3.2 高效液相色譜法

HPLC法檢測小麥粉及其制品中ADA轉化產物SEM，常用紫外檢測器（ultraviolet detector，UVD）或FLD（表2）。SEM紫外響應和熒光響應均較差，需要對SEM進行衍生化，在SEM上引入紫外發色基團或熒光敏感的化學基團。Wei Tianfu等[60]以4-硝基苯甲酰氯為衍生化試劑，室溫下1 min內即可完成SEM衍生化反應，與 LC-MS/MS法常用的衍生化試劑2-硝基苯甲醛（衍生化SEM需要16 h）相比[8]，4-硝基苯甲酰氯衍生化SEM的效率提高了數百倍。衍生化產物在C18柱上的保留能力和紫外吸收均有較大幅度提升，SEM質量濃度在0.01～2.0 mg/L 范圍內，與紫外吸收信號呈良好的線性關系，相關系數為0.9991，SEM檢出限為1.8 μg/kg，可應用于小麥粉及其制品中痕量SEM的快速測定。HPLC中FLD靈敏度一般比UVD靈敏度高1～3 個數量級[55]，Kong Xiaojian等[18]以2-甲酰基苯硼酸為衍生化試劑，應用于面包、方便面、蝦等食品中SEM的測定，SEM檢測限為0.18 μg/kg。 Li Guoliang等[61]以2-(11-氫-苯并[a]咔唑)-乙基氯甲酸酯）為衍生劑，SEM檢出限為0.4 μg/kg。Wang Yinan等[62]以芴甲氧羰酰氯為衍生化試劑，SEM檢出限為0.15 μg/kg， 該方法與常見LC-MS/MS檢出限（0.1～0.8 μg/kg）相當。章建輝等[63]測定小麥粉中ADA，小麥粉濕熱處理后，丹磺酰氯衍生化ADA分解產物SEM，采用 HPLC-FLD測定，小麥粉中ADA檢出限為30 μg/kg。

表 2 HPLC法檢測小麥粉及其制品中ADA轉化產物SEMTable 2 Determination of ADA decomposition product SEM in wheat flour and its products by high performance liquid chromatography

3.3 電化學法

電化學法儀器價格低廉、操作簡單，隨著便攜式電化學工作站的普及，該法在現場檢測方面有較大應用潛力。Zhu Yudan等[17]采用微分脈沖伏安法測定小麥粉中SEM，2-硝基苯甲醛衍生化SEM，用微分脈沖伏安法對衍生化產物進行定量，SEM質量濃度在0～100 μg/L范圍內，與峰值電流呈線性關系，相關系數為0.999，小麥粉中SEM檢測限為3 μg/kg，回收率為92%～99%，相對標準偏差小于4.3%。與HPLC、LC-MS/MS法相比，該法具有有機溶劑消耗少、分析成本低等優點。

4 偶氮甲酰胺及其分解產物同時檢測

Xie Yunfei等[64]采用SERS法對小麥粉中ADA、BIU和SEM 3 種化學物質進行同時檢測，檢測限為10 μg/g，該方法可以用于小麥粉及其制品中ADA和BIU分析檢測。SEM在小麥粉及其制品中的含量一般低于1 μg/g，因此SERS法不適用于小麥粉及其制品中SEM檢測。Chen Li等[14]采用毛細管電泳同時分析小麥粉中ADA和SEM，并對毛細管電泳分離條件、萃取劑和衍生化條件進行了研究。在四硼酸鈉、β-環糊精、異丙醇、十二烷基硫酸鈉緩沖液中，25 min內ADA和SEM即可分離，ADA 和SEM的線性范圍分別為8.3×10—4～6.6×10—2mmol/L和1.9×10—3～3.4×10—2mmol/L，小麥粉中ADA和SEM的檢出限分別為0.15 mg/kg和0.045 mg/kg。該方法成功地應用于5 個小麥粉樣品中ADA和SEM的同時檢測。ADA的回收率為88.0%～93.0%，RSD為0.8%～3.0%。SEM的回收率為98.0%～106.0%，RSD為3.1%～9.1%。該法分離性能與HPLC法相當，可作為HPLC法的替代方法。

5 結 語

我國現行小麥粉及其制品中ADA檢測標準需要進一步完善。GB 1886.108—2015《食品安全國家標準 食品添加劑 偶氮甲酰胺》[65]采用硫代硫酸鈉標準溶液滴定方法檢測ADA食品添加劑中高含量的ADA，對于小麥粉及其制品中ADA添加量的檢測，目前還沒有國家標準。SN/T 4677—2016[26]采用HPLC法直接測定小麥粉及其制品中ADA。小麥粉長期存放和面制品制作過程中，ADA遇水快速轉化為BIU。甚至在ADA提取、分析檢測過程中，也同時伴隨ADA的轉化反應，ADA直接檢測法不能準確反映小麥粉中ADA的初始添加量。SN/T 4677—2016[26]要求ADA標準溶液和樣品溶液的測定必須在4 h內完成，用該方法檢測ADA標準添加量為1 mg/kg的小麥粉，回收率較差，這可能與分析檢測過程中ADA的轉化有關。可以設想，ADA標準添加量為1 mg/kg的小麥粉長時間放置后，回收率會更低。ADA遇水轉化為BIU后，BIU性質穩定，只有極少部分轉化為SEM，BIU可作為小麥粉及其制品中是否添加ADA的標記物質。目前關于小麥粉及其制品中BIU檢測研究報道較少，對該領域的研究值得研究者關注。

基于SEM衍生的HPLC法具有較大的推廣應用價值。SEM在小麥粉及其制品中含量極低，HPLC-MS/MS因為其高靈敏度特點，目前是SEM檢測的主要設備。HPLC-MS/MS 法檢測小麥粉及其制品中SEM，首先提取樣品中的SEM，再進行過夜衍生反應，用同位素SEM內標定量，最后采用HPLC-MS/MS法檢測，該過程耗時長、成本高。4-硝基苯甲酰氯[60]和芴甲氧羰酰氯[62]能夠快速衍生化SEM，分別用更為普及的HPLC-UVD和HPLC-FLP進行檢測，SEM檢出限與HPLC-MS/MS基本相當。基于SEM衍生化的HPLC-UVD和HPLC-FLP具有較大的研究空間，高靈敏度、快速穩定的衍生化試劑開發是該研究的核心內容。

光譜學方法是快速、無損、現場檢測小麥粉及其制品中ADA的有效手段。與HPLC-MS/MS、HPLC等化學分析法相比，光譜學方法具有快速、無損、低廉等諸多優勢。此外，光譜學方法能同時獲得多個物質組分信息，實現ADA、BIU和SEM的同時檢測。目前IR、 THz-TDS、SERS等光譜學方法已經用于小麥粉及其制品中ADA的檢測，但普遍存在預測精度和靈敏度不足等問題，需要在光譜數據收集與分析、方法建模等方面進一步深入研究。