果蔬中外泌體樣納米顆粒的分離、表征 和應用研究進展

楊夢楠，劉詩琦，張 靜，冉龍奕，陳忠加，馬 超,*

（1.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京 100083；2.北京林業(yè)大學工學院，北京 100083）

2013年，諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予了James E. Rothman、Randy W. Schekman和Thomas C. Südhof 3 位科學家，以表彰他們在細胞囊泡運輸的調控機制方面做出的突出貢獻。外泌體作為細胞囊泡的重要一員，相關研究亦受到廣泛關注，研究人員相繼從人、鼠、牛等動物的 組織或細胞中分離鑒定出了外泌體[1-2]。2013年，Ju Songwen等[3]通過差速離心和蔗糖梯度離心相結合的方法首次從葡萄中分離、純化出了大量50～300 nm的囊泡狀結構，并將這種由植物細胞分泌至胞外的類似于動物外泌體的囊泡稱為外泌體樣納米顆粒（exosome-like nanoparticles，ELNs），其與外泌體結構相似，且均含有蛋白質、脂質和RNA成分。之后，科學家相繼對生姜、葡萄柚、梨、檸檬等數十種果蔬中的ELNs進行了分離、純化和鑒定，對其結構和化學組成進行了表征，并對其生理功能進行了評價，發(fā)現果蔬來源的ELNs具有維持腸道穩(wěn)態(tài)等多種獨特的生理活性，并具有遞送藥物的潛在載體功能，顯示出了廣闊的應用前景。

1 外泌體的形成過程

細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是指由脂質雙層膜包裹的細胞外結構[4]，在細胞間的通訊中發(fā)揮著重要作用。EVs主要包括微泡、凋亡小體和外泌體（exosome）三大類。微泡的直徑在100～800 nm之間，主要由細胞膜通過出芽的方式形成。凋亡小體的粒徑不均，直徑在500～1200 nm之間，主要在細胞凋亡過程中通過發(fā)芽、起泡等方式形成[5]。外泌體的直徑為30～150 nm，由磷脂雙分子層包裹，其釋放過程是先由細胞膜向內凹陷形成早期內體，早期內體逐漸成熟后成為晚期內體，晚期內體的膜向內凹陷形成多個管腔囊泡，進而發(fā)展為多泡體（multivesicular body，MVB），MVB與細胞質膜融合，最終形成外泌體釋放到細胞外[6]（圖1）。與微泡和凋亡小體相比，外泌體攜帶了更多的細胞通訊信息，包括蛋白質、脂質和RNA等[7]。研究表明，植物細胞中的納米囊泡具有與動物細胞外泌體相似的生物學特性，通過內體、多泡體衍生到細胞外，這種機制已通過原位固定后的葡萄切塊的結構分析及其蛋白組學分析進行了證實。進一步對衍生的納米囊泡進行粒徑、結構和化學組成分析來鑒定ELNs[3]。

圖 1 外泌體的形成及釋放過程[7]Fig. 1 Formation and release of exosomes[7]

2 果蔬中ELNs的分離及表征方法

2.1 果蔬中ELNs的分離方法

目前，動物來源的外泌體通常采用離心法[8]、超濾法[9]、 排阻色譜法[10]、免疫親和法[11]、聚合物沉淀法[12]以及微流控技術[13-14]等方法分離。離心法是根據外泌體的密度和尺寸進行分離的一種方法，目前最為常用，該方法不受樣本容量的限制，提取得到的外泌體純度較高，但操作復雜、費時費力[8]。超濾法和排阻色譜法都是基于外泌體尺寸的分離方法，其中超濾法可以在較低的速度下完成分離，但是大量的囊泡和蛋白質可能會堵塞濾膜，降低提取效率[9]；排阻色譜法由于不受剪切力的影響，得到的納米顆粒形態(tài)較為完整，但是因為凝膠柱對樣品體積有嚴格的限制，該方法只適用于體積較小的樣品[10]。免疫親和法是基于抗原、抗體特異性結合的原理，利用外泌體表面特有的蛋白質實現對外泌體的分離[11]，但由于基質的非特異性吸附會使外泌體中含有較多的雜蛋白，導致提取得到的外泌體不純。一般認為，聚合物沉淀外泌體的機理是聚合物通過“劫持”水分子，降低外泌體的溶解度，然后在低速離心下使外泌體沉淀，該法在試劑盒中應用廣泛[12]，目前常用的聚合物是聚乙二醇，然而該方法沉降外泌體的同時也會將蛋白質沉降下來，影響外泌體的純度，同時聚合物也難以除去，影響下游分析。基于微流體的外泌體分離技術主要分為基于外泌體物理特性（粒徑、密度、表面電荷）和基于生物標記的方法[13]，該技術成本低、產品純度高、操作時間短。不同的分離方法對原料要求不同，且對外泌體產物的形態(tài)和純度等有一定的影響。因此，實際工作中通常根據外泌體的來源及研究分析的需求而選用不同的分離方法。果蔬中ELNs的分離可以借鑒動物組織中外泌體的分離方法，但鑒于果蔬的來源廣泛、成本低廉，多選用離心法對其中的ELNs進行分離和純化。與其他方法相比，離心法可以分離得到純度更高、形態(tài)更好的ELNs，且適合于稍大規(guī)模的制備。迄今為止，尚未見到超濾法、排阻色譜法、免疫親和法、聚合物沉淀法以及微流控技術應用于果蔬中ELNs的制備和純化的相關報道。

離心法包括差速離心法和密度梯度離心法。差速離心法是通過逐步提高離心速度，依次去除較大的顆粒，最終通過超高的離心速度得到ELNs[15-16]。目前，差速離心法已被用于生姜、藍莓、椰子、葡萄柚、哈密瓜、奇異果、橙子、梨、番茄、豌豆等果蔬中ELNs的分離和純化（表1）。通常，椰子等可以直接取汁；汁液豐富的果蔬，如藍莓、葡萄柚、橙子、梨等，可直接去皮榨汁；而對汁液含量較少的果蔬，如哈密瓜、奇異果、番茄、豌豆、生姜等，可在去皮后與磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）混合研磨取汁。 收集到的果蔬汁通常先在4 ℃下依次差速離心，如1200×g離心20 min、3000×g離心20 min、10000×g離心60 min，每次離心后收集上清液，去除含有大量纖維顆粒的沉淀物，然后將上清液在4 ℃、150000×g的條件下超速離心90 min，收集沉淀，并將沉淀重懸于PBS中得到ELNs[17]。如果需要進一步純化，可在差速離心基礎上對得到的ELNs再次進行密度梯度離心。如Mu Jingyao等[18]首先采用差速離心法從葡萄、葡萄柚、生姜、胡蘿卜4 種果蔬中提取得到了ELNs的粗提物，然后將其重懸后轉移至不同質量分數的不連續(xù)蔗糖介質中（8%、15%、30%、45%和60%），在4 ℃、150000×g條件下超速離心2 h，收集8%與15%、15%與30%、30%與45%蔗糖梯度層之間的條帶，經PBS稀釋后于4 ℃、150000×g條件下再次超速離心2 h，洗去蔗糖溶液，最終將得到的沉淀重懸于PBS中得到高純度的ELNs。

表 1 不同果蔬中ELNs的分離純化方法Table 1 Existing methods for separation and purification of ELNs from different fruits and vegetables

2.2 果蔬中ELNs的表征方法

果蔬中ELNs的超微結構和粒徑的表征可以借鑒動物來源外泌體的表征方法。圖2列出了6 種果蔬中ELNs的超微結構表征[18-20]。ELNs的超微結構通常借助于透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）或原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）等手段進行表征，如采用AFM對藍莓、椰子、番茄等果蔬中的ELNs進行觀察，發(fā)現這些果蔬中的ELNs主要呈圓形或橢圓形的囊泡結構[17]，與動物來源外泌體的超微結構類似；采用TEM對從葡萄柚、葡萄、生姜、胡蘿卜中分離得到的ELNs經負染后觀察，發(fā)現視野中有大量 30～200 nm的囊泡，并呈現典型的茶托型或一側凹陷的半球形結構[18]。外泌體的粒徑通常采用動態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）或納米粒徑跟蹤分析儀（nanoparticle tracking analysis，NTA）進行表征。這兩種方法都是利用光學手段來分析囊泡的粒徑分布，但DLS是通過檢測散射光強度反映納米粒子的粒徑[22]，而NTA是通過跟蹤單個納米粒子的運動軌跡反映其粒徑和濃度等信息[23]。比如，DLS分析顯示西蘭花來源的ELNs的粒徑分布在18.3～118.2 nm之間，平均為32.4 nm，Zeta電位為-39.2～-2.62 mV，平均為-17.1 mV[19]；檸檬來源的ELNs粒徑分布范圍為10～300 nm[20]；胡蘿卜來源的ELNs粒徑分布于兩個不同的范圍，即90～150 nm和800～1200 nm之間[18]；藍莓、椰子、葡萄、葡萄柚、哈密瓜、奇異果、橙子、梨、番茄、豌豆和生姜等果蔬來源的ELNs粒徑分布范圍相似，多在100～1000 nm之間[17-18]。 由于目前的分離方法尚不能將EVs分離到某一具體的亞群，因此得到的ELNs中也會含有其他囊泡，且由于來源不同，從不同果蔬中提取得到的ELNs也顯示出顯著的超微結構和粒徑的差異。

圖 2 葡萄（A）、葡萄柚（B）、生姜（C）、胡蘿卜（D）、 西蘭花（E）、檸檬（F）中ELNs的超微結構表征[18-20]Fig. 2 Ultrastructural characterization of ELNs in grape (A), grapefruit (B), ginger (C), carrot (D), broccoli (E), and lemon (F)[18-20]

3 果蔬來源ELNs的化學組成

不同來源的ELNs中既包含與細胞形成、結構和物質轉運相關的共有成分，也包含與來源細胞的生物功能 相關的特異分子。果蔬來源的ELNs和動物來源的外泌體在脂質、蛋白質和核酸等化學組成上均存在差異。

3.1 脂質

脂質是構成囊泡磷脂雙分子層的重要成分，是果蔬來源的ELNs和動物來源的外泌體中均不可或缺的組分。動物來源的外泌體中富含鞘磷脂、膽固醇和少量的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）等，這使其具有一定的剛性，從而保證了外泌體在體內的穩(wěn)定性[24-25]。 果蔬來源的ELNs富含磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、PE、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、二酰基甘油（diacyl glycerol，DAG）、三酰基甘油（triacyl glycerols，TAG）、二半乳糖基二酰基甘油（digalactosyldiacylglycerol，DGDG）和單半乳糖基二酰基甘油（monogalactosyldiacylglycerol，MGDG）等。其中，PA是重要的脂質信號分子，能夠通過不同的作用模式調節(jié)細胞進程；DGDG和MGDG是重要的糖脂，可以在凍融凍干過程中穩(wěn)定ELNs。果蔬來源的ELNs中未發(fā)現膽固醇，與動物中外泌體顯著不同。

研究表明，果蔬等植物組織中最典型的脂質是磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、PE、PI和少量的PA[26-27]，這與果蔬來源的ELNs中脂質的組成有所差異，說明果蔬在ELNs的形成過程中對其脂質進行了精確分選。生姜來源的ELNs中脂質含量最豐富的是PA，占總脂質的47%，其次為DGDG和MGDG[21]；葡萄來源的ELNs中脂質也以PA為主，占總脂質的53.2%，其次為PE，幾乎不含有DGDG和MGDG[3]；葡萄柚來源的ELNs中脂質則以PE居多，占總脂質的24%，其次為PC，而PA含量僅為總脂質1%[28]，這與葡萄和生姜顯著不同（圖3）。因此，果蔬來源的ELNs中脂質的種類和相對含量與果蔬本身有很大的關系。

圖 3 不同果蔬ELNs中脂質含量對比[3,26-27]Fig. 3 Lipid contents in ELNs from different fruits and vegetables[3,26-27]

3.2 蛋白質

動物外泌體中含有1000多種蛋白質，但這些蛋白質的組成與細胞質膜的蛋白質組成不同[29]。研究表明，動物的外泌體中含有大量的四次穿膜蛋白[30]（如CD9、CD63、CD82和CD82等）、熱休克蛋白 （heat shock protein，HSP）（如HSP70和HSP90）、與細胞內轉運和融合相關的蛋白[31-32]（如鳥苷三磷酸酶（guanosine triphosphatease，GTPases）和浮艦蛋白（flotilin）），以及胞質蛋白和膜聯(lián)蛋白[33]（如Rab11、Rab7、Rap1B）等。與動物外泌體的蛋白質組成相比，果蔬來源的ELNs中所含蛋白質的種類較少，含量較低，現已鑒定出的主要種類有調節(jié)糖脂代謝的蛋白質（包括肌動蛋白和各類酶在內的胞質蛋白）、GTPases（Rab蛋白質家族）、與膜和囊泡相關的蛋白質（如內體分揀轉運復合體（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）相關蛋白CHMP1、VAMP711）等[34-35]。從葡萄、葡萄柚、生姜、檸檬中得到的ELNs中蛋白質種類和主要高豐度蛋白的種類如表2所示。其中，葡萄衍生的ELNs中鑒定出96 種植物蛋白，含量較多的是酶（13 種）、GTPases（12 種）和與MVB形成過程相關的蛋白[34]，說明葡萄中的ELNs也是通過MVB形成的，這一過程與動物相似。與葡萄的ELNs中的蛋白質組成類似，葡萄柚來源的ELNs中的蛋白質也含有較多的酶[36]。生姜來源的ELNs中鑒定得到的蛋白種類較少，主要包括肌動蛋白和蛋白水解酶等胞質蛋白，以及水通道蛋白和氯通道蛋白等膜蛋白[37]。相較于葡萄、葡萄柚和生姜，檸檬ELNs中蛋白種類更為豐富，已鑒定出580 種，其中56.7%與動物外泌體含有的蛋白質相重合[20]，提示這些蛋白質可能是與外泌體形成相關的特征性蛋白。目前，更多的研究正致力于從不同果蔬來源的ELNs中鑒定更多種類的蛋白質，但由于ELNs制備方法、所得ELNs的純度和所用蛋白質鑒定技術的不同，最終鑒定得到的蛋白質種類尚存在較大差異。同時，動物來源的外泌體多以四次穿膜蛋白（如CD63、CD9、CD81）和腫瘤易感基因101蛋白為標志性檢測指標[38-39]，而對于果蔬來源的ELNs，其標志性蛋白尚未確定。

表 2 不同果蔬ELNs中的蛋白質種類對比Table 2 Protein profiles in ELNs from different fruits and vegetables

3.3 核酸

動物外泌體中含有豐富的信使RNA、微RNA（microRNA，miRNA）和長鏈非編碼RNA。果蔬ELNs中也含有大量的RNA，主要為miRNA，但miRNA種類明顯少于動物外泌體[40]。對生姜、椰子、哈密瓜、梨、奇異果、番茄等果蔬ELNs的研究表明，這些果蔬的ELNs中含有32～118 種短于25 nt的miRNA（表3），生姜中最少，為32 種，番茄中較多，有118 種[17]。但由于分離和鑒定方法的差異，對同一種果蔬，不同團隊鑒定出的miRNA種類也存在顯著不同，如Teng Yun等[41]從生姜ELNs中鑒定出的miRNA種類高達125 種。同時，每種果蔬ELNs中會含有一些特有的miRNA序列，且表達水平位于該果蔬前20 位。果蔬ELNs中的miRNA在ELNs的介導下可以進入細胞或細菌內，靶向并調控動物細胞或細菌的基因表達，如大豆ELNs中的MIR-5781可以直接靶向作用在炎癥反應中有重要功能的白細胞介素17A（interleukin 17A， IL-17A）[17]，生姜ELNs中某些miRNAs可以靶向鼠李糖乳桿菌從而促進吲哚-3-甲醛的產生[41]。

表 3 不同果蔬ELNs中miRNAs的差異[17]Table 3 miRNA profiles in ELNs from different fruits and vegetables[17]

4 果蔬ELNs的應用

4.1 疾病干預功能

動物來源的外泌體在細胞間通訊中扮演著重要角色，具有調控基因表達和調節(jié)細胞代謝的功能， 在炎癥發(fā)生和免疫調節(jié)等多個生理過程中發(fā)揮著重要的 作用[42-43]。如表4所示，與動物來源的外泌體類似，果蔬來源的ELNs中也含有特定的脂質、蛋白、核酸等成分，每種成分都可能通過某種特殊的機制發(fā)揮相應的生物學功能，從而對疾病的發(fā)生、發(fā)展起到一定的作用。

葡萄、西蘭花和生姜來源的ELNs在維持腸道穩(wěn)態(tài)、預防結腸炎發(fā)生中具有潛在的干預作用，可以在一定程度上預防由葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）引發(fā)的小鼠結腸炎。腸干細胞在維持腸道組織的穩(wěn)定性中具有重要作用，葡萄來源的ELNs可以穿過 腸道黏液進而被小鼠腸干細胞吸收，并通過Wnt/β-catenin途徑誘導Lgr5hi腸道干細胞增殖，從而加速腸黏膜上皮的恢復，避免由DSS引起的結腸炎[3]。西蘭花來源的ELNs可以靶向樹突狀細胞（dendritic cell，DC），激活DC中腺苷單磷酸激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），從而減少細胞因子干擾素γ（interferon γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的釋放，并提高抗炎因子的表達，防止腸道DC的激活，進而誘導形成耐受性DC[19]，使DSS引發(fā)的小鼠結腸炎癥狀得到改善。生姜來源的ELNs可以通過其中的miRNAs調節(jié)小鼠腸道中乳桿菌的基因表達，在促進乳桿菌繁殖的同時，產生更多具有保護腸道作用的芳烴受體的配體，如吲哚-3-甲醛等，進而誘導腸組織產生更多的白細胞介素-22，有助于維持腸道穩(wěn)態(tài)，改善結腸炎[41-44]。此外，生姜來源的ELNs在預防和治療慢性牙周炎[45]以及保護酒精引起的肝損傷方面也具有潛在的干預作用[46]。

表 4 果蔬來源的ELNs和動物來源的外泌體的化學組成Table 4 Chemical compositions of ELNs derived from fruits and vegetables and exosomes derived from animals

果蔬來源的ELNs在抗腫瘤方面也具有潛在的應用價值，如檸檬來源的ELNs可以誘導腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）的表達，增加促凋亡基因Bad和Bax的表達，降低抗凋亡基因Survivin和Bcl-xl表達；同時，還可以引起血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）的表達下調，從而抑制血管的生成[20]。這表明，檸檬ELNs能夠通過促進TRAIL介導的細胞凋亡和抑制VEGF-A、IL-6和IL-8的分泌來抑制癌細胞的增殖。

4.2 載體功能

甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）、阿霉素（doxorubicin，DOX）、紫杉醇等藥物和姜黃素等食品營養(yǎng)因子往往存在水溶性差、易被人體快速清除和生物相容性差等缺點，這在一定程度上限制了它們的應用。為此，科學家嘗試將這些難溶性小分子化合物包封于脂質體或高分子納米載體中，從而提高其溶解度和分散性，但這些納米顆粒穿透生物屏障的能力依然較弱，其穩(wěn)定性、生物相容性和毒性問題也未能有效解決[47-48]。外泌體作為一種天然的納米級囊泡結構，具有良好的生物相容性和口服安全性，并可以跨越生物學屏障[49]， 是一種潛在的高效載體材料。目前，動物來源的外泌體用作藥物載體的研究報道較多，如利用巨噬細胞或牛乳來源的外泌體裝載紫杉醇可顯著提高紫杉醇的利用度，增強其對腫瘤細胞的抑制作用，顯著抑制腫瘤的 生長[50-51]。果蔬來源的ELNs已被嘗試用作藥物的遞送系統(tǒng)，如利用從葡萄柚中制備的ELNs作為載體包封MTX后，可以將MTX靶向遞送至腸道細胞，并通過減少細胞因子TNF-α、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6的產生而緩解由DSS誘導的結腸炎[36]；利用從生姜中分離的ELNs為載體，采用超聲的方法裝載DOX，其裝載效率可達（95.90±0.28）%，通過葉酸配體進行靶向修飾后，可以高效靶向并顯著抑制異種移植的Colon-26腫瘤細胞的生長[21]。除用于裝載小分子藥物外，果蔬來源的ELNs還被嘗試用于裝載miRNA，如利用從番茄中制備的ELNs，采用電穿孔法包裹模型藥物細胞膜紅色熒光探針DiI和5-羧基熒光素標記的反義EBV-miR-BART7-3p， 結果發(fā)現兩者均可以高效進入細胞的胞漿，且以ELNs為載體的基因沉默效果優(yōu)于陽離子脂質體[52]。因此，果蔬來源的ELNs作為小分子藥物和miRNA的載體，具有廣闊的應用前景。

5 結 語

隨著不同果蔬來源ELNs結構特征、化學組成以及生理活性研究的相繼展開，人們對于這種囊泡結構的認識也不斷提升，對于ELNs的功能、干預疾病潛力的研究日益增多。ELNs以某種特定成分在疾病的發(fā)生和治療中發(fā)揮著重要作用，同時在遞送不同生物活性的藥物方面存在巨大潛力，作為藥物載體，ELNs具有獨特的結構和理化活性，被細胞高效內化，低毒性以及內在的靶向能力等一系列優(yōu)勢。但是，相較于動物中的外泌體，果蔬中ELNs的相關研究尚處于初始階段，既缺乏從果蔬中快速、高效、規(guī)模化提取制備ELNs的技術體系，也缺乏對不同果蔬中ELNs化學成分的系統(tǒng)組學分析，更缺乏對特征組分生理活性的挖掘和作用機制的探究。可以預見，果蔬中ELNs的研究將很快成為一個新的研究熱點，而隨著這些研究的不斷深入，ELNs以其來源廣泛、生物安全性高的優(yōu)點必將在食品、保健食品和醫(yī)學等領域得到更為廣泛的應用。