衣原體疫苗的研究策略與進展

余南燕，向文靜，周 洲

衣原體(Chlamydia)是一類專性胞內寄生的原核細胞型微生物，以二分裂的方式進行繁殖，具有獨特的雙相發育周期。其中，引起人類疾病的主要有沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis, Ct)、肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae, Cpn)和鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci, Cps)。Ct感染眼部可引起結膜炎、沙眼等疾病；感染男性泌尿道，引起尿道炎、前列腺炎和附睪炎；感染女性生殖道，容易發生子宮內膜炎、尿道炎并導致盆腔炎、輸卵管性不孕、異位妊娠等嚴重并發癥。目前有文獻報道，Ct感染既可增加人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染機會，也可與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)協同作用誘發宮頸癌變[1-2]。Cpn不僅造成呼吸系統感染，而且與冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病以及哮喘、多發性硬化癥、阿爾茲海默癥、反應性關節炎等多種慢性病相關。Cps是一種人獸共患病原體，傳染性極高，通常呈全身性感染，主要表現為非典型性肺炎。研究表明，Cps是引起全球1%社區獲得性肺炎的病原體[3]。總之，衣原體感染導致的疾病嚴重威脅著人類健康，給各國公共醫療衛生系統帶來了巨大的經濟負擔。此外，長期或重復使用抗生素易產生耐藥性[4]，增加衣原體反復感染后形成輸卵管性不孕等嚴重并發癥的風險。免疫接種不僅能預防個體感染，避免感染后引發嚴重的病理反應，而且能有效降低衣原體的傳播速度。因此，迫切需要開發一種針對不同宿主、不同菌株的有效疫苗來預防衣原體感染，控制衣原體的傳播、流行。

1 衣原體疫苗的研究策略

1956年，中國科學家湯飛凡等利用雞胚接種的方法培養了眼型Ct[5]，隨后Collier LH等將沙眼衣原體進行體外培養，模擬衣原體的自然感染，探索其免疫機制和致病機制[6-7]，開啟衣原體疫苗研究的新征程。目前人類在衣原體免疫機制的研究和疫苗開發方面已經取得了一定的突破，研究表明，衣原體疫苗免疫接種的免疫效果受多種因素影響，如抗原能否誘導適當的免疫保護性；不同類型菌株之間的遺傳差異；宿主的種類及狀態；疫苗的運輸和保存方式；免疫接種的最佳時機和免疫策略等[8]。但是目前仍然沒有成功研制出對人類有效的衣原體疫苗。

因此，合理選擇潛在的疫苗靶點，開發有效的衣原體疫苗，需要注意以下幾點：第一，選擇合適的疫苗類型，以確保疫苗在提供最佳保護的同時不含潛在的致病成分，比如流產衣原體1B菌株活疫苗可能存在導致羊胚胎流產的成分[9]。第二，疫苗應該具有有效的抗原表位和較強的免疫原性，以確保誘導一個良好的細胞因子和共刺激環境，促使疫苗誘導CD4+T細胞驅動足夠的Th1型細胞免疫應答和輔助性抗體反應。第三，有效的佐劑和適當的遞送系統促使抗原靶向結合相應的免疫位點，增強效應器的功能，誘導充分而持久的免疫保護，預防或解決感染導致的嚴重并發癥[10]。目前使用的衣原體疫苗遞送系統分很多種：①MF59佐劑，MF59已經在抗流感疫苗方面顯示出良好的耐受性，可用于不同菌株或同一菌株不同血清型的衣原體疫苗的開發[11-12]；②CpG佐劑，可提高疫苗的免疫原性，促進快速T細胞免疫應答和抗體免疫應答，但存在安全問題[13]；③病毒樣顆粒(virus-like particles, VLP)媒介佐劑系統，VLP通過樹突狀細胞(dendritic cells, DC)上的模式識別受體進行有效的先天免疫刺激，增強細胞免疫和體液免疫反應[14-15]；④病毒載體，通常為復制缺陷型病毒，如腺病毒載體、痘苗病毒載體、流感病毒載體等，不僅引起強烈的細胞免疫應答，而且能誘導抗原高水平表達。第四，誘導有效的粘膜免疫應答是衣原體疫苗免疫策略的重點。現有研究表明，鼻腔或舌下接種Ct粘膜疫苗，在生殖道誘導強大的黏膜免疫應答[16]。第五，選擇合適的感染模型檢測疫苗的免疫效果。雖然小鼠、豬的感染模型能夠模擬衣原體的自然感染，且成本低、易繁殖飼養，但其與人類基因存在重要差異，適合基礎研究[17-18]。人類非靈長類(Non-human primates, NHP)的免疫系統與人類高度相似，但其研究費用昂貴，目前僅用于6個Ct疫苗的研究[18-19]。

2 衣原體疫苗的研究現狀

2.1全菌疫苗 全菌疫苗分為減毒活疫苗和滅活疫苗。活疫苗因為能模擬自然感染、具有固有的佐劑特性，可通過口服或鼻腔注射，以及可誘導細胞免疫、體液免疫和粘膜免疫反應，而具有吸引力[20]。1978年，出現第一批Ct活疫苗[21]，隨后，Kari L等將Ct減毒質粒缺失株多次感染獼猴眼部，誘導了相應的免疫反應，顯著降低感染率和再感染率，而且沒有產生炎癥性眼部病理反應[22]，類似的研究表明，與野生型鼠衣原體(Chlamydiamuridarum，Cm)相比，小鼠接種Cm質粒缺失株，輸卵管積水發生率顯著降低[23]。有文獻報道，鼠衣原體減毒突變株(GIAM-1)感染小鼠胃腸道后可產生較強的體液免疫，預防生殖道感染[24]。滅活疫苗的出現解決了減毒活疫苗有效期短、不易保存、難以運輸等問題，但不能誘導其產生細胞免疫應答和粘膜免疫應答。雖然免疫接種之前，通過減毒或滅活的方式削弱活菌的致病性，但是減毒株有可能出現毒力返祖，而且使用重組菌株接種可能會導致菌株釋放到大自然中，引起生物安全隱患[20]。因此，疫苗的有效性和安全性等問題限制了衣原體全菌疫苗的發展。

2.2亞單位疫苗及重組亞單位疫苗 亞單位疫苗不含衣原體核酸，僅含衣原體部分蛋白或其表面抗原，接種后能誘發機體產生有效免疫應答。相對于全菌疫苗，亞單位疫苗安全性高，穩定性好。具有較強免疫原性的衣原體抗原，如主要外膜蛋白(major outer membrane protein, MOMP)、衣原體蛋白酶樣因子(chlamydial protease-like activity factor, CPAF)和熱休克蛋白60(heat shock protein 60, HSP60)已經廣泛用于衣原體亞單位疫苗的研究[25]。

MOMP是衣原體包膜含量最豐富的成分，具有廣泛的種屬特異性，包含多個T細胞和B細胞表位，是目前衣原體疫苗研究較多的候選抗原。MOMP不僅促進衣原體黏附宿主細胞，而且作為孔蛋白，促進小分子物質通過外膜，調節衣原體的發育周期，推測其可能與衣原體原體(elementary body, EB)和網狀體(reticulate body, RB)兩種形式的轉換有關。MOMP免疫小鼠后，可有效預防生殖系統和呼吸系統衣原體感染，預防輸卵管性不孕等長期后遺癥[26-27]。重組主要外膜蛋白(recombinant major outer membrane protein, rMOMP)免疫考拉或小鼠亦可誘導高水平的特異性中和抗體，增強粘膜和全身體液免疫反應[28-29]。Tifrea DF等用rMOMP首次實現預防不同血清型Ct感染，及其引起的陰道脫落、上生殖器病變和不孕。他們推測來自不同血清型的rMOMP配制的多價疫苗會引起廣泛的交叉免疫保護[30]。此外，MOMP或rMOMP與磷酸鹽佐劑、納米佐劑以及陽離子脂質體佐劑(cationic adjuvant formulation，CAF)01和CAF09等聯合免疫，可提高抗原特異性免疫，增強小鼠呼吸系統的保護作用[4,31-32]。

CPAF是一種衣原體絲氨酸蛋白酶，能抑制宿主細胞的信號通路，抑制感染細胞凋亡，依賴抗原特異性CD4+T細胞介導免疫應答，對清除衣原體感染很重要[33]。重組衣原體蛋白酶樣因子(recombinant chlamydial protease-like activity factor, rCPAF)與IL-12或CpG佐劑聯合免疫小鼠或豚鼠后，可觀察到衣原體脫落顯著減少，且有效預防Cm感染導致的輸卵管積水、輸卵管擴張和動脈粥樣硬化等免疫病理改變[34-35]。此外，有文獻報道稱，CPAF介導的中性粒細胞失活是無癥狀Ct感染的關鍵，因為CPAF是逃避宿主天然免疫防御第一道防線的中心效應因子。因此，深入了解CPAF介導的免疫機制，可能為衣原體疫苗的開發提供新思路。

HSP60既能維持蛋白質穩態，也可觸發和增強局部炎癥反應，增大女性輸卵管性不孕等風險[36]。實驗證明，小鼠免疫接種衣原體HSP60也可誘導保護性免疫反應[37]。目前的衣原體疫苗研究中，還有許多其他的可用于設計衣原體疫苗的抗原，如巨噬細胞感染增強蛋白(MIP蛋白)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、多形態膜蛋白(polymorphic membrane protein, Pmp)等。

傳統亞單位疫苗有效的避免了全菌疫苗的生物安全風險，但面臨抗原提取成本高、純化難、復性難的挑戰，重組亞單位疫苗的出現解決了抗原大規模生產的問題。將免疫原性較強的抗原或重組抗原接種到宿主時，極大地削弱了抗原的免疫原性，以致于不能誘導機體產生足夠的免疫反應，需通過適當的佐劑或免疫增強劑，提高免疫應答。而且，單組份、單表位亞單位疫苗不一定能提供最佳的免疫保護，小鼠衣原體感染模型研究顯示多抗原、多表位疫苗可顯著增強對跨血清型生殖道衣原體感染的交叉免疫保護作用[38-40]。因此，未來的衣原體亞單位疫苗研究應該進一步探索最佳抗原，深入研究衣原體蛋白表位的差異性，拓展多抗原或多表位聯合免疫的策略。

2.3核酸疫苗 核酸疫苗以DNA疫苗為主，通過在質粒中構建外源目的基因片段，將其導入宿主細胞，表達相應的目的蛋白，以誘發機體產生特異性免疫應答。DNA疫苗避免了活疫苗毒力返祖的隱患，可輔助T細胞極化，特別是Th1型免疫細胞，延長疫苗的穩定性、儲存和運輸能力，降低生產成本[41]。研究表明，編碼MOMP的DNA質粒疫苗可有效預防衣原體感染火雞、母鼠、豬等[42-44]，同樣，噬菌體介導的MOMP DNA疫苗可誘導豬產生特異性細胞免疫應答和體液免疫應答，預防流產衣原體感染[41]。小鼠接種由pcDNA質粒攜帶MOMP多表位和人乳頭瘤病毒16型L2基因組成的DNA疫苗可以調節抗體產生，通過細胞毒性T細胞的殺傷功能來抵抗衣原體感染，減少生殖道病理損傷[45]。總之，DNA疫苗不僅同時誘導細胞免疫應答和體液免疫應答，而且一種載體可以表達多種目的蛋白，這些優勢促使其成為目前疫苗研究的熱點，但是還有幾個問題尚待解決：①DNA可能整合到宿主染色體中；②DNA疫苗接種可能產生DNA抗體，發生自身免疫病；③人類接種DNA疫苗表達效率較低；④肌肉免疫接種DNA疫苗可能影響二次免疫效果[46]。

2.4DC疫苗 細胞疫苗作為一種過繼免疫療法，應用于治療性和預防性疫苗的研發，比如化療和基于抗原的疫苗[47-48]。有效的衣原體疫苗應該能夠誘導產生高水平的粘膜免疫反應、系統性Th1型免疫反應以及再次感染后增強的Th1型免疫反應。雖然過繼療法可能不適合衣原體等易廣泛傳播的病原體的研究，但DC是人體內功能最強大的抗原呈遞細胞(antigen-presenting cell, APC)，可產生IL-12，優先激活Th1型細胞反應，具有強大的共刺激能力，誘導激活多種免疫應答，有助于抗衣原體反應[49-50]。早在1998年，Su H等通過在小鼠模型中靜脈注射小鼠骨髓來源的體外脈沖DC，發現其能有效吞噬衣原體，分泌IL-12 p40，呈遞抗原，誘導小鼠產生傾向于Th1型特異性免疫反應，而且未引起明顯的病理反應[51]。同樣，感染Ct和Cm的小鼠的(骨髓源性)DC呈遞衣原體特異性CD4T細胞識別的衣原體蛋白表位，加速鼻腔和生殖道病原體的清除率[50,52]。然而，由于DC迅速降解內化的蛋白，以及DC表面的MHC-I類表位在外部負載基序適配肽后，具有暫時性，使得DC疫苗的應用受到限制[53]。因此，DC疫苗還需進一步探索防止抗原降解、延長抗原釋放、更有效提呈抗原的方法。

2.5菌影疫苗 菌影(bacterial ghost, BG)是無生命的細菌包膜復合物，具有良好的安全性，可攜帶多種蛋白質或DNA編碼的抗原，可通過腸外、口服、鼻內、陰道等多種途徑給藥，并可通過細菌發酵生產，具有固有的佐劑特性，其顆粒特性通過識別Toll樣受體或調理抗體促進DC等免疫細胞的提呈和攝取功能。由于BG的來源以及免疫接種方式不同，BG疫苗大致可分為6類(表1)。重組BG作為一種新的傳遞載體，將目的基因或抗原轉化到合適的細菌上，使其在細胞的特定部位高表達，通過控制細胞的裂解產生BG。近年，Zhou P等研究表明，與裸DNA疫苗相比，以BG為載體，Cps MOMP與MIP聯合DNA疫苗在小鼠體內誘導產生更高水平的免疫應答，抗感染能力更強[56]。因此，菌影系統作為一種新的平臺技術，可用于靶向先進藥物、新型微敏反應器以及各種疫苗的研發等。

表1 菌影疫苗的分類

3 展 望

衣原體疫苗經歷了全菌疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗、DC疫苗、BG疫苗等多種類型的疫苗，但是目前進入臨床實驗期的衣原體疫苗卻屈指可數。安全、穩定的亞單位疫苗與DNA疫苗、DC疫苗、BG疫苗的聯合免疫策略已經成為近年研究的熱點，推動衣原體疫苗的發展，但是目前衣原體疫苗研究還存在許多問題：①約85%的疫苗實驗在替代宿主上進行，不同宿主的安全性和免疫效果有所不同。②雖然目前常用的動物模型，如小鼠、豚鼠、豬、考拉、人類非靈長類的免疫反應與人類非常相似，但是動物實驗易存在倫理問題，如考拉的感染模型出現嚴重的生殖問題。③疫苗免疫接種和攻毒方式不同，免疫效果也不同。在目前的研究中，免疫接種和攻毒方式大致分為粘膜接種與攻毒、系統性接種與粘膜攻毒、粘膜接種與系統性攻毒、系統性接種與攻毒以及混合接種與粘膜攻毒5種[57]。④生殖器衣原體引起人類天然免疫防御的機制尚不清楚，因為女性生殖道缺乏高度組織化的淋巴組織[24]。總之，開發人類可用的有效衣原體疫苗對于人類健康，特別是高危人群，以及人類公共衛生事業的發展具有重要意義。隨著基因組學、蛋白質組學等相關新型技術的出現，大量潛在抗原和佐劑的進一步評估，DNA疫苗、DC疫苗和BG疫苗等新型疫苗的深入研究，以及多種疫苗的聯合應用，或許使最佳衣原體疫苗成為可能。

利益沖突：無