miR-5189-3p在下腔深靜脈血栓形成的調控機制的研究

馮濤 李晶 潘金強 鄭殿宇 魯靜 耿中利 馬震

深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis DVT)是血管外科的常見周圍血管疾病之一[1]。近年來，其發病率有逐年上升的趨勢,20%～50%的深靜脈血栓病人又在此基礎上，發展成血栓后綜合征(post-thrombotic syndrome，PTS)[2-4]。新疆地區的下肢深靜脈血栓患病率在31.0%左右，遠遠高于其他國家和地區[5]。根據當地的生活習慣、飲食習慣、遺傳因素等進行研究發現，吸煙、年齡、新鮮蔬菜攝入量是當地人群遺傳性易栓癥的主要影響因素。本次通過研究miR-5189-3p在大鼠體內過表達的干預實驗，驗證靶基因JAG1所在信號通路Notch中Notch1、Hes1、JAG1的表達情況，進一步驗證miR-5189-3p在下肢深靜脈血栓形成中的表達調控機制。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物：SPF級SD大鼠48只，體重180～200 g，于無特殊病原體(specific pathogen free,SPF)條件下飼養。飼養環境為溫度 22～26 ℃，相對濕度 50%～60%，人工光照明暗各12 h。動物來源于三峽大學實驗動物中心，使用許可證號：SYXK(鄂)2018-0104，動物合格證號：42010200002507。

2.實驗試劑：HE染色試劑盒(Solarbio公司，中國)，SYBR Green PCR 試劑盒(Biosystems公司，美國)，逆轉錄試劑盒(TAKARA公司，日本)，Trizol(Ambion公司，美國)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(bioswamp公司，中國)，BAX Polyclonal Antibody(Bioswamp公司，中國)，Bcl-2 Polyclonal Antibody(Bioswamp公司，中國)。

二、方法

1.動物建模：本次建模以白云城等[6]建立的大鼠下腔靜脈狹窄法建立大鼠下腔靜脈血栓(DVT)模型。將48只SD大鼠隨機分組，分為4組，分別為正常對照組(A組)、下腔靜脈血栓模型組(B組)、hsa-miR-5189-3p 模擬物組(C組)和hsa-miR-5189-3p模擬物陰性對照組(D組)，每組12只。hsa-miR-5189-3p 模擬物組SD大鼠尾靜脈注射hsa-miR-5189-3p mimics、hsa-miR-5189-3p模擬物陰性對照組SD大鼠尾靜脈注射hsa-miR-5189-3p mimics NC，按5 μg/kg劑量，溶于1 ml生理鹽水中，正常組和下腔靜脈血栓模型組SD大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水，注射后24 h造模。大鼠用2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后用剃毛器剃除腹部毛發。大鼠仰臥位，用 75%的酒精消毒腹部皮膚，在腹部正中切開 3～4 cm大小縱行切口，逐層分離肌肉，打開腹腔。打開腹腔后，把腸道推向術野左側，打開后腹膜，暴露下腔靜脈，5-0絲線結扎下腔靜脈分支至髂靜脈，小心分離伴行之腹主動脈，于左腎靜脈下2 mm處穿過一根5-0絲線備用，沿靜脈走向放置一根3-0絲線，然后結扎下腔靜脈后小心抽出3-0絲線，造成下腔靜脈狹窄模型，逐層縫合腹腔肌肉組織及皮膚，大鼠完全蘇醒后放回飼養籠繼續飼養。造模后24 h，分批處死動物。

2.靜脈血栓組織病理學檢查：靜脈血栓組織用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定組織標本，常規石蠟包埋、切片，經蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)染色后在光鏡下觀察組織病理變化。

3.RT-qPCR：通過DNAMAN軟件設計JAG1、Notch1、Hes1、GAPDH熒光實時定量PCR引物，并由上海生工有限公司合成。分別加入2 μl 5×PrimeScript Buffer，0.5 μl PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 μl Oligo(dT)15(15 μM)，0.5 μl Random 6 mers(100 μM)，Total RNA 500 ng，RNase Free dH2O達到10 μl，混勻后短暫離心，在PCR儀上37 ℃溫浴15 min，85 ℃加熱5 s，稀釋至35 μl，得到反轉錄的cDNA。qPCR反應：Forward primer 10 μM 0.8 μl，0.8 μl Reverse primer 10 μM，2XSYBR Select Master Mix(2×)10 μl，RNase-free water 6.4 μl，cDNA template 2 μl，配制成20 μl體系混合均勻，在儀器上保持95 ℃，1 min，95 ℃，10 s，60 ℃ 34 s，40個循環，94 ℃ 1 min 30 s，60 ℃ 1 min，60 ℃→94 ℃，1.1 ℃/s升溫，從而獲得qPCR反應結果。

三、統計學方法

結果

1.靜脈血栓組織病理變化：將收集在10%中性福爾馬林的正常對照、下腔深靜脈血栓模型組、hsa-miR-5189-3p模擬物組和hsa-miR-5189-3p模擬物陰性對照組組織進行HE染色，觀察組織變化。

靜脈血栓組織HE實驗結果，見圖1(A～D)。A組大鼠下腔靜脈內皮細胞的尺寸和形狀保持統一、內皮細胞緊湊而齊整、表面光滑，內皮細胞層無病理變化，未觀察到染色組織內出現炎性細胞和血栓物質的存在，同時未觀察到血液內的血細胞和相關因子存在。B組，術后24 h，血栓充滿靜脈管腔，血栓內存在大量的紅細及少量白細胞，血栓機化不明顯，下腔靜脈管壁未見明顯的粘連，血管內皮細胞無脫落現象，靜脈周圍看見炎細胞浸潤，瓣膜周圍可見少量炎性細胞浸潤。C組，靜脈血栓機化，主要從血栓周邊處開始。有核細胞開始大量出現在血栓周邊處，致使內皮細胞數量增多、單核細胞數量增多、中性粒細胞數量增多、巨噬細胞數量增多，與下肢深靜脈血栓組對比，進行血栓組織中的有核細胞較多，機化程度增加，血栓外周區域有大量的裂隙產生和形成，從而形成管腔樣結構，有血流再通的征象，可見少許紅細胞的存在。D組，靜脈血栓機化，主要從血栓周邊處開始。有核細胞開始出現在血栓周邊處，致使單核細胞數量增多、中性粒細胞數量增多、巨噬細胞數量增多，與下肢深靜脈血栓組對比，進行血栓組織中的有核細胞較多，機化程度增加，血栓外周區域有部分小裂隙產生和形成，從而形成管腔樣結構，有血流再通的征象，可見少許紅細胞的存在。

A：A組，下腔靜脈內皮細胞的尺寸和形狀保持統一、緊湊而齊整、表面光滑，內皮細胞層無病理變化；B:B組，血栓充滿靜脈管腔；C：C組，靜脈血栓機化，血栓外周區域有大量的裂隙產生和形成，從而形成管腔樣結構，有血流再通的征象；D：D組，靜脈血栓機化，血栓外周區域有部分小裂隙產生和形成，從而形成管腔樣結構，有血流再通的征象

2.qRT-PCR技術檢測SD大鼠下腔靜脈組織中基因表達情況：通過miRNA預測靶基因，檢測組織樣品中JAG1、Hes1、Notch1 四個指標在不同分組組織中的表達差異性，具體結果見表1、圖2(A～C)。對A組，B組，C組和D組，分別進行JAG1、Hes1、Nothch1 四個基因表達分析。實驗結果顯示，JAG1在 C組與B組、C組與D組之間表達有統計學意義(P<0.05)。Hes1在A組和其他各組、C組與B組、C組與D組之間表達差異有統計學意義(P<0.05)。Notch1在C組與B組、C組與D組之間表達差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 JAG1、Notch1、Hes1在A組、B組、C組和D組之間的基因表達差異性

圖2 JAG1、Hes 1、Notch1在不同分組之間的基因表達差異性

討論

近年來，在心血管疾病方面，miRNA對血管生成的作用成為研究重點，已知的miRNA包括miR-126、miR-21、miR-221、miR-222等[7-10]。深靜脈血栓的引起因素之一為血管損傷，血管損傷早期表征為血管內皮功能降低或發生障礙。研究發現，miRNA在血管損傷后和修復過程中，主要對血管內皮細胞的增殖、遷移和分化起到作用。例如miR-126可以起到抑制血管內膜細胞病變，促進血管損傷的修復，保證血管內皮的整體完整性，防止血管損傷加重，通過miR-126抑制劑檢測，EPCs的遷移增殖能力下降。miR-221可以和靶向基因PAK 1相互作用，從而影響MEK/ERK信號通路，抑制EPCs的增殖[11-12]。

JAG1，又被叫做Jagged1，是Notch受體的四大配體之一，主要在血管內皮細胞中表達，在新生血管的形成發展中起到很重要的作用[13]。有研究表明，JAG1基因敲除后，動物的胚胎血管重塑以及卵黃囊的血管重塑都會出現不同程度的障礙問題，會導致血管內皮細胞無法形成功能性作用的網狀環樣結構，致使細胞的遷移能力和細胞間的傳遞功能大幅度下降、新生血管無法正常發育、胚胎較容易出現死胎癥狀。因此，hsa-miR-5189-3p的靶基因JAG1在下肢深靜脈血栓中也應該起到對靜脈內皮細胞損傷的修復、新生血管的形成、細胞間的功能性因子傳遞等作用，避免下肢深靜脈血栓的形成。

本次實驗通過對hsa-miR-5189-3p的目標基因JAG1的研究發現，JAG1是信號通路Notch里面的一個重要調控因子。Notch信號通路是一條高度保守的信號傳導途徑，可以控制相關傳導因子的表達高低來起到調控的功能。其中Notch 1受體分布較廣，其普遍的表達于多種組織，包括心臟組織和血管內皮細胞等。Notch的四個配體Dll 1, Dll 4, Jaggde l和Jagged 2在血管內皮細胞中都有表達，并在血管發育中起重要的作用。相關研究結果顯示Notch 1的缺失會造成實驗動物的無法形成完整功能的血管，而無法生存。Krebs等[14]實驗結果闡明，Notch1受體和Notch4受體之間的相互作用在血管形成過程中起到極大的影響作用。Takeshita等[15]通過建立缺血動物模型實驗發現，缺血組織的Notch信號通路基因和蛋白表達量較對照組明顯升高，內皮細胞增殖速度明顯增加，又通過實驗發現病理組織區域內，有大量的新生血管在形成，對病灶區進行修復。說明了該通路信號因子對血管的發生、發展和形成過程起到積極的調控作用。

綜上所述，JAG 1、Hes 1、Notch 1基因表達與miR-5190-3p的基因表達呈正相關。Hes 1是Notch信號轉導途徑中一個重要的下游靶基因，轉錄的Hes 1 mRNA又可以進一步調控下游分子的蛋白表達。因此，miR-5190-3p基因的過表達，可以作用于JAG 1及Notch 1和Hes 1的基因表達，使得JAG 1、Hes 1、Notch 1基因表達得到增強，Notch信號通路的激活，促進靜脈內皮細胞增殖分化，抑制凋亡，進而抑制深靜脈血栓形成。