同位素稀釋—超高效液相色譜—串聯質譜法測定雞蛋中金剛烷胺的不確定度評定

馬 凱 包 娜 黃永橋 吳新文

(1.貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550000；2.貴州省檢測技術研究應用中心，貴州 貴陽 550000)

金剛烷胺是金剛烷的衍生物，屬于三環胺類，是醫學界公認的對流感病毒有抑制作用的抗病毒藥物。為了降低畜禽的發病率，減少經濟損失，不少養殖戶將金剛烷胺類抗病毒藥物用于畜禽類流感的治療和預防[1]，因缺乏科學規范、安全有效的試驗數據，不合理給藥會導致畜禽類產品的藥物殘留，影響人類身體健康，不利國家動物疫病防控政策的實施。美國食品藥品管理局在2005年明確禁止將人類抗病毒藥物用于禽畜類的防治；在中國農業部第560號公告中，金剛烷胺等抗病毒類藥物，被明確禁止用于禽類的飼養過程[2-3]。

目前，金剛烷胺的檢測方法主要有氣相色譜法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]、液質聯用法[8-10]等，液相色譜法和氣相色譜法大多需要衍生，操作繁瑣，液相色譜—串聯質譜法有較高的靈敏度和高選擇性，抗干擾能力強，在金剛烷胺的檢測中應用最為廣泛，中國現行的關于動物源性食品中金剛烷胺的標準檢測方法SN/T 4253—2015和GB 31660.5—2019，均采用液相色譜—串聯質譜法?，F階段采用液質聯用法測定動物源性食品中金剛烷胺的不確定度評定報道較少，為衡量檢測結果的可信度，研究擬選取金剛烷胺殘留風險較高的雞蛋樣品，試驗依據SN/T 4253—2015標準方法，并參照現行化學分析中不確定度評定方法與要求[11-12]，通過對同位素稀釋—超高效液相色譜—串聯質譜法檢測雞蛋中金剛烷胺的不確定度進行評定，以期提高金剛烷胺殘留量測量結果的科學性，同時為其他類型的動物源性食品中金剛烷胺測定結果的不確定度評定提供參考。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

超高效液相色譜—串聯質譜儀：Agilent 1290/6460型，美國安捷倫公司；

實驗室超純水制備系統：Milli-Q Intergra 115型，美國Millipore公司；

多管旋渦混合器：UMV-2型，北京普立泰科儀器有限公司；

高速離心機：L-500型，長沙湘儀離心機儀器有限公司；

電子天平：TXB622L型，日本島津公司；

瓶口分液器：Organic型，5～50 mL，德國普蘭德公司；

固相萃取裝置：SPEMF12G型，深圳逗點生物技術有限公司；

旋渦混合器：XW-80A型，江蘇金壇區白塔金昌實驗儀器廠；

氮吹儀：N-EVAP 12型，美國Organomation公司。

1.2 耗材與試劑

甲醇、乙腈：色譜純，美國SUPELCO公司；

甲酸：色譜純，德國Merck公司；

乙酸銨：優級純，山東西亞化學股份有限公司；

氨水：優級純，國藥集團化學試劑有限公司；

三氯乙酸：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

MCX SPE小柱：60 mg/3 mL，深圳逗點生物技術有限公司；

金剛烷胺(CAS：768-94-5；相對擴展不確定度5%)、金剛烷胺-d6(CAS：1219805-53-4；相對擴展不確定度5%)：100.0 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司。

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 樣品提取液的配制 稱取20 g三氯乙酸，溶于1 L 水中，混勻，量取900 mL配制好的三氯乙酸溶液，加入100 mL乙腈，混勻備用。

1.3.2 試樣制備 雞蛋樣品去殼后，放入組織搗碎機均質，充分混勻，裝入樣品袋中，試樣于-18 ℃以下密封保存，備用。

1.3.3 提取 稱取5 g樣品(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入內標工作液，加入1粒陶瓷均質子，再加入15 mL三氯乙酸溶液，置于多管旋渦混合充分提取5 min，然后在4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，取出上清液，用10 mL三氯乙酸溶液重復提取一次，離心后合并上清液至25 mL容量瓶中，并定容至刻度。

1.3.4 凈化 固相萃取小柱依次用3 mL甲醇、水和2%甲酸活化，準確移取5 mL上清液，加入到已活化的小柱中，并依次用5 mL 2%甲酸溶液、3 mL 1%甲酸乙腈溶液淋洗，棄去全部流出液，抽干小柱，用4.0 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，45 ℃下氮吹至近干，準確加入1.0 mL甲醇—水(V甲醇∶V水=1∶9)，渦旋30 s后，過微孔濾膜，待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18柱(1.8 μm，50 mm×2.1 mm)；流動相：含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨水溶液(A)，乙腈(B)；梯度洗脫程序：0.0～0.5 min (10% B)，0.5～2.0 min (10%～30% B)，2.0～3.0 min (30%～90% B)，3.0～4.5 min (90% B)，4.5～5.0 min (90%～10% B)，5.0～6.0 min (10% B)；流速0.3 mL/min；進樣量2 μL；柱溫40 ℃。

1.4.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子；掃描模式：多反應監測模式(MRM)；毛細管電壓5.0 kV；霧化氣壓力275 kPa；噴嘴電壓500 V；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速12 L/min；干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速6 L/min；金剛烷胺和金剛烷胺-d6質譜參數見表1。

表1 目標物的質譜參數?Table 1 MS parameters for the analytes

1.5 重復測定與加標回收試驗

選取一陽性雞蛋樣品，按照1.3前處理方法對金剛烷胺含量重復測定6次，計算平均值并作為最終結果；用空白雞蛋樣品，分別以5.0，10.0，20.0 μg/kg 3個水平進行添加回收試驗，每個添加水平重復測定6次，并計算回收率。

2 結果與分析

2.1 數學模型的建立

根據雞蛋中金剛烷胺的前處理過程和測定原理，目標物的計算公式：

(1)

式中：

X——樣品中金剛烷胺含量，μg/kg；

C——儀器測定的金剛烷胺質量濃度，ng/mL；

V——樣品定容體積，mL；

D——稀釋倍數；

m——樣品稱樣量，g；

1/R——回收率校正因子。

2.2 不確定度來源分析

從測量過程和數學模型，對雞蛋中金剛烷胺含量測定的各種不確定度來源進行分析，具體如圖1所示。

圖1 不確定度來源Figure 1 Sources of uncertainty

2.3 各項相對標準不確定度的計算

2.3.1 標準溶液配制過程中引入的不確定度分量urel(S)

(1) 標準儲備液引入的相對標準不確定度urel(S1)：金剛烷胺標準溶液在標準物質證書上的相對擴展不確定度為5%，k=2，置信水平為95%，因此相對標準不確定度：

(2) 標準中間液配制過程中引入的相對標準不確定度urel(S2)：用單標線1 mL移液管吸取100.0 μg/mL金剛烷胺標準溶液1.00 mL于10 mL容量瓶(A級)中，用甲醇定容至刻度，配制的標準中間儲備液質量濃度為10.0 μg/mL；再用1 mL分度吸量管(A級)吸取標準中間儲備液0.50 mL于10 mL容量瓶(A級)中，用甲醇定容，稀釋成質量濃度為0.5 μg/mL的標準使用溶液，備用。金剛烷胺-d6標準中間液也按照相同的稀釋步驟進行配制，得到0.5 μg/mL的內標標準使用溶液，備用。

試驗采用的是同位素內標稀釋法定量分析，內標物濃度不參與最終測量結果的計算，因此，在內標物配制和稀釋過程中可不考慮引入的不確定度，只評估在標準工作曲線制備和樣品前處理過程中加入內標溶液引入的不確定度。

根據JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》，1 mL分度吸量管(A級)的容量允差為±0.08 mL，10 mL容量瓶(A級)的容量允差為±0.02 mL，1 mL單標線吸量管(A級)的容量允差為±0.07 mL。

表2 標準中間液配制過程引入的不確定度Table 2 Uncertainty resulting from the preparation of midst standard solution

因此，由標準中間液稀釋過程引入的相對標準不確定度為：

(3) 標準工作曲線制備過程引入的相對標準不確定度urel(S3)：用1 mL分度吸量管(A級)分別移取0.50 μg/mL 的標準工作液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL，置于10 mL容量瓶中，再使用1 mL分度吸量管(A級)向每個容量瓶中加入0.20 mL質量濃度為0.50 μg/mL 內標工作液，最終用甲醇—水(V甲醇∶V水=1∶1)定容至刻度，得到質量濃度分別為5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0 ng/mL以及內標質量濃度為10.0 ng/mL的標準系列溶液。查得20 ℃時甲醇和水的體積膨脹系數分別為1.2×10-3，2.1×10-4℃-1，試驗過程中用于定容的甲醇—水(V甲醇∶V水=1∶1)溶液的體積膨脹系數為7.0×10-4℃-1，按矩形分布處理，相關的玻璃量器、吸量管及溫度波動引入的不確定度見表3。

表3 標準曲線配制引入的不確定度Table 3 Uncertainty resulting from preparation of standard curve

由標準工作曲線配制過程中引入的相對標準不確定度為：

由各不確定度分量，計算標準溶液配制過程引入的相對標準不確定度：

2.3.2 標準曲線計算引入的相對標準不確定度urel(L)

(1) 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(L1)：配制的標準曲線經儀器重復測定2次，數據及擬合結果如表4所示。

表4 標準曲線數據及處理?Table 4 Standard curve data and processing

取一陽性樣品重復測定6次，根據標準曲線校正含量，其測定的金剛烷胺平均質量濃度為25.54 ng/mL，外標與內標濃度比值C0為2.554，用擬合直線計算的樣品測定濃度引入的標準不確定度按式(2)計算，相對標準不確定度按式(3)計算。

(2)

(3)

式中：

A1——標準工作曲線的斜率，A1=12.710 9；

A2——標準工作曲線的截距，A2=-0.904 3；

p——對c0的測定次數，重復測定6次，即p=6；

n——獲得標準工作曲線的每個標準溶液的測定次數，試驗中6個濃度各測定2次，即n=12；

經計算，樣品測定濃度引入的標準不確定度為0.018 643，相對標準不確定度為0.007 30。

則標準曲線計算引入的相對標準不確定度為：

2.3.3 樣品前處理過程引入的不確定度分量urel(P)

則樣品前處理過程引入的相對標準不確定度為：

2.3.4 測量重復性引入的相對標準不確定度urel(A)

按照1.5項中重復性的試驗要求進行6次測定，結果分別為25.7，25.5，24.9，24.8，25.3，25.1 μg/kg，平均值為25.2 μg/kg，根據JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》規定，采用極差法進行重復性不確定度的評定，按式(4)計算引入的相對標準不確定度。

(4)

式中：

R——極差；

C——極差系數；

n——測量次數；

代入數值求得urel(A)=0.005 76。

2.3.5 測定回收率產生的相對標準不確定度urel(R)

按照1.5項的要求進行回收率測定，回收率結果統計見表5，則回收率引入的相對標準不確定度為：

表5 回收率試驗結果Table 5 Results of recovery test

2.4 各個相對標準不確定度分量匯總

超高效液相色譜—串聯質譜法測定雞蛋中金剛烷胺含量的各相對標準不確定度來源、類型、數值如表6所示。

2.5 合成相對標準不確定度

將表6中相互獨立的各相對標準不確定度分量進行合成，得到相對合成標準不確定度：

表6 相對標準不確定度計算結果Table 6 Results of relative standard uncertainty

2.6 擴展不確定度

依據JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》，取包含因子k=2(置信水平95%)，試樣中金剛烷胺含量的平均值為25.2 μg/kg，則擴展不確定度為：

3 測量結果及其不確定度報告

用同位素稀釋—超高效液相色譜—串聯質譜法測定雞蛋中金剛烷胺含量，當稱樣量為5 g時，k=2(置信度為95%)，測定結果為(25.2±4.9) μg/kg。

4 結論

采用同位素稀釋—超高效液相色譜—串聯質譜法測定雞蛋中金剛烷胺含量，通過對試驗過程中引入的各不確定度分量進行綜合考量，結果表明，標準溶液配制和樣品前處理過程引入的不確定度較大，而測量回收率、重復性以及標準曲線擬合為貢獻較小的不確定度分量。其中，標準溶液配制中又以標準工作曲線制備引入的不確定度最大，樣品前處理過程中以樣品添加內標溶液引入的不確定度較大。因此，在實際的試驗過程中，要加強標準溶液配制的規范性和一致性，移取標準溶液要選用合適的器具，提升試驗人員的操作水平，減少人為因素的影響，從而保證檢測結果的準確性。