美味牛肝菌礦質元素富集能力及產地鑒別

陳鳳霞，楊天偉，李杰慶，劉鴻高，范茂攀,*，王元忠

（1.云南農業大學資源與環境學院，云南 昆明 650201；2.云南省農業科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650200；3.云南省熱帶作物科學研究所，云南 景洪 666100；4.云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201）

云南地處云貴高原，地形地貌復雜多樣，山區面積比例大且高溫高濕的氣候孕育了豐富的野生菌資源[1]。美味牛肝菌是一種可食用的大型真菌，其肉質鮮美、芳香四溢，具有較高的食用藥用價值，廣受消費者喜愛[2-3]。菌類中富含多種礦質元素，其富集能力與土壤中礦質元素含量具有相關性[4-6]。礦質元素是維持人體健康的必需營養元素[7]，如Ca是人體所需的基本營養素，99%存在于牙齒和骨骼中[8]；Fe主要用于氧運輸，是多種人體代謝的重要物質[9-10]；K和Na協調細胞內外液量平衡，是人體中非常重要的電解質[11]。野生食用菌對礦質元素的富集能力通常高于其他微生物和植物類群，研究美味牛肝菌礦質元素的富集能力，可為消費者合理膳食與野生菌資源開發提供理論依據。

數據融合是將多個不同來源、不同種類的數據信息進行優化重組，分為低、中、高3 種融合方式，主要用于藥用植物研究及食品質量評價[12-13]。光譜分析技術作為一種低成本、易操作、簡單快捷的新興技術，常用于野生食用菌品質研究[14-16]。光譜分析結合數據融合策略可以實現不同信息間的優勢互補，對多種光譜數據進行整合優化，提高數據的有效性和整體性，在食品種類鑒別、質量評價、產地溯源、摻假等研究中較為廣泛。裴藝菲等[17]在重樓產地鑒別研究中采用多光譜數據融合與化學計量學。Wang Ye等[18]融合了近紅外和紫外-可見光譜數據鑒定石斛屬植物。李秀萍等[19-20]在野生牛肝菌鑒別中使用光譜信息數據融合。Li Yang等[21]利用近紅外、中紅外光譜結合化學計量學與數據融合對橄欖油摻假問題進行研究。張鈺等[22]結合礦質元素與紅外光譜對美味牛肝菌進行產地鑒別，結果表明中級融合是一種有效方法。Qi Luming等[2]對美味牛肝菌產地溯源研究中使用了元素數據、多光譜信息進行數據融合。Yao Sen等[23]對牛肝菌進行產地鑒別中使用了傅里葉變換紅外光譜學、紫外-可見光譜數據融合與多元統計分析，結果表明，數據融合鑒別效果比單一光譜更佳。

本實驗測定了云南6 個產地美味牛肝菌及土壤中的9 種礦質元素含量，結合傅里葉變換近紅外光譜與紫外-可見光譜，根據礦質元素富集系數（bioaccumulation factor，BCF）與偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）對美味牛肝菌進行礦質元素、富集能力研究，建立準確快速的產地鑒別模型，以期為促進云南高原特色農業產業及合理開發持續利用資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

79 份美味牛肝菌樣品采自云南6 個不同產地，每個產地均收集子實體附近的土壤樣品。詳細情況見表1。將采集的土壤樣品放置于室內通風處進行風干并去除植物殘體及石塊，粉碎過100 目篩，使用磨口塞廣口瓶保存備用。美味牛肝菌樣品采集后，用陶瓷刀刮去表面泥土、雜草、枯葉等雜物并清洗干凈，50 ℃至12 h烘干，粉碎過100 目篩至粒度為1 mm后置于自封袋。

表1 不同產地美味牛肝菌樣品信息Table 1 Information about B. edulis samples tested in this study

茶葉標準物質（GBW07605） 地礦部物化探研究所；土壤成分分析標準物質（GBW07406）、菠菜標準（GBW10015） 地球物理地球化學勘查研究所；65%硝酸（優級純）、30%過氧化氫（分析純）、氯仿（分析純）、48%氫氟酸（分析純）、高氯酸（分析純）、鹽酸（優級純）、9 種礦質元素標準溶液 濟南眾標科技有限公司。

1.2 儀器與設備

傅里葉變換近紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司；ICPE-9000電感耦合等離子體原子發射光譜儀、TU-1901紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Mars6微波消解儀 美國CEM公司；AR1140型萬分之一分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 美味牛肝菌子實體礦質元素含量測定

用萬分之一天平準確稱取已烘干打粉后的美味牛肝菌樣品（300±0.10）mg，置于消解罐中，加入5 mL硝酸和2 mL過氧化氫，常溫消解1 h后放入微波消解儀，消解分為4 步驟，調至升溫時間均為5 min、溫度在20～110、110～140、140～160、160～180 ℃，維持時間5 min，功率為1 800 kW。消解后冷卻定容至25 mL，待測。相同方法制備空白溶液，每個樣品重復3 次，取平均值。

1.3.2 土壤礦質元素含量測定

稱取（100±0.10）mg土壤樣品置于燒杯，加入5 mL硝酸和1 mL高氯酸并進行加熱，待出現大量白煙時開始冷卻。冷卻后加入8 mL氫氟酸和0.5 mL高氯酸繼續加熱直至白煙消失，加入10 mL鹽酸，待完全溶解后定容至25 mL，待測。每個樣品重復3 次，取平均值。

1.3.3 標準曲線繪制

用10%硝酸溶液配制成0.00、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的Mn、Cu、Fe、Zn、Mg、K、Na、P、Ca元素標準曲線溶液，建立茶葉標準物元素曲線和土壤標準物元素曲線。

1.3.4 近紅外光譜采集

稱取（20.00±0.50）g樣品混合均勻，置于玻璃器皿進行壓縮，用傅里葉變換近紅外光譜儀進行掃描，采集范圍10 000～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，信號累計掃描64 次，重復3 遍取平均值。

1.3.5 紫外光譜采集

稱取（100.00±0.20）mg樣品與10 mL氯仿溶劑，搖勻后超聲40 min，使用3 層濾紙過濾，提取清液待測。TU-1901紫外-可見分光光度計自檢預熱1 h后通過空白對照扣除背景值，并采集200～400 cm-1范圍的光譜。每個樣品掃描3 遍并取平均值。

1.4 數據處理

使用OMNIC8.0光譜處理軟件對近紅外光譜進行自動基線校正和吸光度轉換，UVProbe 2.34紫外光譜處理軟件對紫外光譜進行處理，SIMCA13.0對近紅外光譜數據進行平滑（Savitzky-Golay，SG）+二階導數（second derivatives，2D）、SG+標準正態變換（standard normal variables，SNV）；對紫外光譜數據進行多元散射校正（multiple scattering correction，MSC）+2D、SG+2D、SG+MSC、SNV+2D等預處理，將最佳預處理后的數據用Matlab2018a進行Kennard-Stone算法篩選2/3訓練集和1/3預測集。通過SIMCA13.0建立PLS-DA單光譜分類模型和數據融合分類模型。

2 結果與分析

2.1 礦質元素的測定

采用茶葉標準物（GBW07605）、菠菜標準物（GBW10015）和土壤成分分析標準物（GBW07406）對方法準確性進行驗證。由表2可知，茶葉標準物和土壤標準物與茶葉測定值和土壤測定值接近，其中茶葉中元素回收率在94%～101%之間，部分菠菜中元素回收率在96%～99%之間，土壤中元素回收率在94%～107%之間，表明測定的礦質元素在國家標準范圍之內，此方法具有可靠性。

表2 茶葉標準物（GBW07605）、菠菜標準物（GBW10015）和土壤成分分析標準物（GBW07406）的元素測定結果Table 2 Measured mineral element contents of tea standard GBW07605 and spinach standard GBW10015 and soil component analysis standard GBW07406

2.2 礦質元素分析

BCF也稱生物富集因子，是植物與土壤中礦質元素含量的比值，用于評價植物對礦質元素的富集能力[24]。表3為6 個產地土壤和美味牛肝菌的9 種元素含量平均值以及美味牛肝菌對土壤中元素的BCF。美味牛肝菌中礦質元素的BCF為子實體中元素含量的平均值除以土壤中同一元素的含量，BCF＞1表明子實體中元素的富集能力較強。表3中，6 個產地土壤中Fe含量最高，來自文山市東山鄉的土壤中Fe含量已達到48 323.75 mg/kg，可能與云南富含Fe金屬離子的酸性土壤有關。美味牛肝菌中K和P含量最高，范圍在10 204.71～13 734.32 mg/kg和4 773.35～6 240.71 mg/kg，表中除了云南省昆明市安寧八街鎮Zn的BCF小于1外，5 個產地K、P、Zn的BCF值均大于1，文山市東山鄉美味牛肝菌P的BCF值最高，為4.63，結果顯示美味K、P、Zn比其他元素更易富集在美味牛肝菌中。如表所示，6 個產地Cu和Na的BCF值基本小于1，來自云南省大理市彌渡和云南省文山市東山鄉的美味牛肝菌對土壤中Cu或Na的富集能力較強，BCF＞1。說明不同產地美味牛肝菌對土壤中礦質元素的富集能力有所差異。美味牛肝菌中富含多種人體所需的常量元素與微量元素，K、P、Fe含量最為豐富，在10 204.71～13 734.32、4 773.35～6 240.71、411.93～1 536.50 mg/kg范圍之間，其中來自昆明市安寧八街鎮與保山市隆陽區的美味牛肝菌樣品中P、Fe和K含量最高。其次是Mg、Na、Ca、Zn、Cu、Mn。含量較少的元素為Mn和Cu，范圍在23.14～37.24、33.54～43.43 mg/kg之間。云南省文山市東山鄉的美味牛肝菌中Na含量是來自云南省昆明市安寧八街鎮的美味牛肝菌Na含量的20.70 倍，不同產地美味牛肝菌樣品相同元素之間具有差異顯著性，可能與不同產地的土壤與生長環境有關。

2.3 光譜分析

圖1為6 個產地美味牛肝菌的近紅外和紫外平均光譜圖，圖1a是近紅外光譜圖，波數范圍在4 005～5 388 cm-1和5 780～8 461 cm-1之間有吸收峰，在強吸收峰范圍內，4 358 cm-1附近可能為—CH2多糖伸縮振動，4 628～4 981 cm-1范圍附近可能與N之間H、C＝O、O之間H有關[22]。6 個產地的美味牛肝菌近紅外光譜峰形大致相似，但吸收強度明顯且可進行產地區分。圖1b為紫外光譜圖，根據光譜吸收峰特征，截取200～450 nm范圍內的波長，提高紫外數據對產地鑒別的準確性。紫外光譜范圍在300～450 nm之間無光譜明顯吸收峰，表明樣品大致成分相同。強吸收峰范圍在255～300 nm之間，具有指紋及化學成分差異，能有效進行產地分類鑒別。

表3 不同產地美味牛肝菌和土壤礦質元素含量及BCFTable 3 Contents and enrichment coefficients of mineral elements in B. edulis and soil from different producing areas

圖1 6個產地美味牛肝菌的近紅外平均光譜（a）和紫外平均光譜（b）圖Fig.1 Near infrared (a) and UV-visible (b) spectra of B. edulis from six producing areas

2.4 光譜預處理結果

表4 近紅外光譜與紫外光譜預處理結果Table 4 Pretreatment of near infrared and UV-visible spectra

校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）、交叉驗證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）為模型參數，參數值越接近0說明模型效果越好。表4為近紅外和紫外光譜的數據預處理PLS-DA結果。選取特征值＞1的主成分個數，表中顯示近紅外最佳預處理方法為SG+2D，RMSEC與RMSECV分別為0.074 07和0.261 92，訓練集正確率為100.00%，預測集正確率為88.46%。紫外最佳預處理方法為SG+MSC，提取5 個主成分，RMSEC與RMSECV為0.261 70和0.275 83。訓練集正確率為84.91%，預測集正確率為96.15%。將最佳近紅外、紫外光譜預處理結果進行保留，作為建立單一光譜產地分類3D模型的數據。

2.5 美味牛肝菌PLS-DA光譜產地分類

PLS-DA是一種高維數據分析方法。此方法對不同處理樣本的特性進行訓練，對照其訓練集與預測集檢驗可信度，常結合光譜分析技術用于食品安全檢測[25-26]。Yulia等[27]在咖啡摻假研究中使用了紫外光譜與PLS-DA方法，結果顯示，此方法能準確、有效的鑒別摻假咖啡。Wang Ye等[28]采用傅里葉紅外光譜、礦質元素結合PLS-DA對牛肝菌進行種類與產地分析。李運等[29]在三七產地鑒別溯源研究中使用紅外光譜信息結合PLS-DA，為三七質量控制提供方法。圖2為6 個產地PLS-DA產地分類3D模型圖，由圖2a可知，來自云南省保山市隆陽區的美味牛肝菌樣品可以很好地聚在一起，其他產地美味牛肝菌樣品大致可以進行區分，來自云南省玉溪市易門銅廠的樣品聚為兩類，云南省昆明市安寧八街鎮與云南省文山市東山鄉的樣品聚成一團，無法進行產地區分。云南省大理市彌渡采集的9 個樣品基本聚為一類，云南省迪慶藏族自治州采集的17 個樣品基本聚為一類，但個別樣品比較零散。由圖2b可知，相同產地美味牛肝菌樣品不能很好的聚在一起，云南省玉溪市易門銅廠一部分樣品聚類在云南省保山市隆陽區，云南省昆明市安寧八街鎮樣品聚類在其他幾個產地，云南省迪慶藏族自治州采集的樣品較為分散，部分樣品分類錯誤，云南省大理市彌渡采集的樣品基本可以聚在一起，但存在個別聚團分散。表明紫外光譜不能作為理想的產地鑒別數據。圖2c為近紅外光譜和紫外光譜的低級數據融合，其中提取主成分12 個，RMSEE和RMSECV分別為0.054 621和0.233 757，模型訓練集正確率為100.00%，預測集正確率為88.46%，與單一光譜中近紅外分類效果相同，由圖2c可知，云南省保山市隆陽區的美味牛肝菌樣品聚類效果最好，但其他產地聚類效果不佳，其中云南省玉溪市易門銅廠、云南省昆明市安寧八街鎮、云南省文山市東山鄉分類聚為一團，產地區分不明顯。來自云南省迪慶藏族自治州部分樣品分類錯誤。圖2d為近紅外光譜和紫外光譜的中級數據融合，提取5 個主成分，RMSEE和RMSECV分別為0.199 75和0.291 536，模型訓練集正確率100.00%，預測集正確率為92.31%，模型經過HottellingT2檢測法進行準確性檢驗，其中為13.046 1，模型均未超過置信區間，表明模型準確可靠。圖2d中6 個產地的不同樣品聚類明顯，其中3 個產地的樣品聚為一類，并與其他產地樣品聚團隔離。云南省玉溪市易門銅廠的樣品中有少數樣品聚類在云南省昆明市安寧八街鎮，云南省文山市東山鄉和云南省昆明市安寧八街鎮樣品聚團靠近，但相同產地樣品形成聚團。根據圖2分析表明，中級數據融合是進行美味牛肝菌產地溯源研究的最佳方法。

圖2 PLS-DA的單一光譜與數據融合后的產地分類3D圖Fig.2 3D map showing geographical origin classification using monospectral data fusion combined with PLS-DA

3 結 論

本實驗采用6 個產地美味牛肝菌及土壤樣品，對美味牛肝菌中礦質元素與土壤中礦質元素進行富集規律研究及礦質元素分析，結合近紅外光譜和紫外光譜建立PLS-DA的3D模型產地分類圖。結果表明，文山市東山鄉土壤Fe含量最高，可能與云南高溫高濕環境導致的酸性土壤有關；美味牛肝菌中含有大量K和P；6 個產地的Zn、K、P平均BCF為1.05、2.14、3.70，顯示土壤中的Zn、K、P元素更易富集在美味牛肝菌內，不同產地美味牛肝菌對土壤中相同元素的富集能力不同；單一光譜中，近紅外光譜的產地分類效果比紫外光譜更佳；中級數據融合中模型訓練集正確率100%，預測集正確率92.31%，分類效果明顯，可以作為美味牛肝菌產地分類的最佳方法。