通過式SPE-UPLC-MS/MS測定植物油中的9 種酚類抗氧化劑

張艷俠，趙慧男，孫珊珊，徐向軍，鄭文靜，薛 霞，王明棟，劉艷明,*，祝建華,*

（1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東省特殊醫學用途配方食品質量控制工程技術研究中心，山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心，山東 濟南 250101；2.中國石化天然氣分公司榆濟管道公司，山東 濟南 250101）

富含不飽和雙鍵的植物油易發生氧化變質，為防止植物油酸敗，產生對人體有害的物質，添加抗氧化劑防止或減慢油脂氧化作用，達到油脂原有的性質和營養價值[1-2]。沒食子酸丙酯（propyl gallate，PG）、2,4,5-三羥基苯丁酮（2,4,5-trihydroxybutyrophenone，THBP）、叔丁基對苯二酚（tert-butylhydroquinone，TBHQ）、去甲二氫愈創木酸（nordihydroguaiaretic acid，NDGA）、叔丁基對羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）、2,6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚（Ionox-100）、沒食子酸辛酯（octyl gallate，OG）、2,6-二叔丁基對甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）及沒食子酸十二酯（dodecyl gallate，DG）等常用人工合成抗氧化劑因抗氧化效果好、價格低廉被廣泛應用于植物油的防腐敗變質，存在過量或違規使用的食品安全問題。毒理學研究表明，抗氧化劑具有一定的毒性和致癌作用，如TBHQ能導致DNA損傷[3-4]。許多國家對該類抗氧化劑的使用及限量作了明確規定，日本及歐盟等國家禁止任何食品中添加TBHQ等抗氧化劑。我國的GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》對部分抗氧化劑的最大使用限量做出了嚴格規定[5]。食品中人工抗氧化劑的控制成為食品安全問題的焦點。

食品中抗氧化劑常用的檢測方法有薄層色譜法、比色法[6]、毛細管電泳法[7]、電化學法[8]、氣相色譜法[9-11]、氣相色譜-串聯質譜法[12-13]、高相液相色譜法[14-17]和液相色譜-串聯質譜法[18-19]。其中，薄層色譜法和比色法在定性、定量方面存在不準確問題。氣相色譜法和氣相色譜-串聯質譜法對前處理要求高，方法相對復雜且抗干擾能力差。高效液相色譜法存在靈敏度差，定性不足等問題。液相色譜-串聯質譜法因其高靈敏度、高選擇性及定量定性準確等特性，已廣泛應用于各種農獸藥殘留及添加劑的檢測中[20-21]。植物油的化學成分復雜，基質干擾嚴重，常用的前處理方法有液液萃取法[22-23]、固相萃取柱法[24]、凝膠色譜凈化技術[25-26]、基質固相分散法等[27-28]，這些方法存在前處理過程復雜、耗時，需要大量有毒有機溶劑，回收率低及不能兼顧多種抗氧化劑等問題。Oasis?PRiME HLB為通過型固相萃取柱，其特點是出色的除磷脂、蛋白及油脂等雜質的作用，已有報道將其用于肉及肉制品、水產品、禽副產品等基質中獸藥殘留的檢測[29-30]。現行GB 5009.32—2016《食品中9 種抗氧化劑的測定》中第二法為液相色譜-串聯質譜法，方法只包括PG、THBP、NDGA、OG及DG共5 種抗氧化劑，9 種抗氧化劑只能用高效液相色譜法檢測，極大限制了標準方法的使用[31]。將通過式固相萃取與液相色譜-串聯質譜法結合，分析植物油中酚類抗氧化劑的研究尚鮮見報道。

本研究對植物油樣品經酸化乙腈提取，通過式Oasis PRiME HLB凈化，超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜檢測，建立同時檢測植物油中9 種酚類抗氧化劑的快速檢測方法。采用的通過式Oasis PRiME HLB固相萃取柱無需活化和洗脫步驟，操作簡單、效率高，可以有效去除磷脂、脂肪和蛋白等干擾，降低基體效應，提高回收率。該方法簡便快捷、靈敏度高、通量性好、檢測效率高，特別適合植物油中酚類抗氧化劑的定性、定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用油樣品均為市售。

THBP、TBHQ、NDGA、BHA、Ionox-100、OG、BHT及DG標準品（純度≥98%） 北京曼哈格生物科技有限公司；PG（純度≥95%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；L-抗壞血酸棕櫚酸酯（L-ascorbgyl palmitate，AP）（純度＞97%） 美國TCI公司；甲醇、乙腈、正己烷（均為色譜純） 德國默克公司；甲酸（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；超純水為Milli-Q超純水機制備；氮氣（＞99.999%） 美國Millipore公司；標準品均于4 ℃保存。

1.2 儀器與設備

ACQUITYTMUPLC I-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S質譜儀（配有電噴霧電離源和MasslynxTM色譜工作站）、HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）美國Waters公司；3-18K高速冷凍離心機 德國Sigma公司；SB-800DTD型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技有限公司；MS3渦旋混合器 德國IKA公司；N-EVAP-45位氮吹儀 美國Organomation公司；SQP-電子天平 美國塞多利斯科學儀器有限公司；Oasis?PRiME HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL）、0.22 μm有機微孔濾膜 上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取10 mg（精確至0.01 mg）各抗氧化劑標準物質，用甲醇溶于10 mL棕色容量瓶中，定容至刻度，分別配制成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液，于-18 ℃避光保存。移取各標準儲備液用甲醇（含50 μg/mL AP）稀釋到適當的質量濃度得到抗氧化劑混合標準工作液，冷凍避光保存。

1.3.2 樣品前處理

提取：稱取均勻油樣品1 g（精確至0.000 1 g）于50 mL聚丙烯具塞離心管中，加入10 mL含50 μg/mL AP的0.5%甲酸-乙腈溶液，渦旋5 min，超聲10 min，8 000 r/min離心5 min，將上層提取液移出，殘留油樣再加入8 mL含50 μg/mL AP 的0.5%甲酸-乙腈溶液重復提取一次，合并2 次提取液。加入10 mL乙腈飽和正己烷，渦旋除脂后棄去正己烷層，取乙腈層定容至20 mL，待凈化。

凈化：準確取5 mL提取液上Oasis PRiME HLB固相萃取柱，再加3 mL乙腈進一步淋洗，合并所用流出液，流出液于40 ℃氮吹濃縮至近干，用1 mL甲醇復溶后，加1 mL水稀釋，渦旋混勻離心，過0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.3.3 基質效應

取空白基質樣品，按1.3.2節前處理步驟制備空白基質溶液。分別用空白基質溶液和定容溶劑稀釋標準儲備液，得到同質量濃度水平的測定液。通過分別測定樣品空白基質溶液與純溶劑中添加同水平目標成分的響應值，計算二者的相對比值評價基質效應，按下式計算：

基質效應為負值表示存在基質抑制效應；基質效應為正值表示存在基質增強效應，0為無基質效應，絕對值越大基質效應越強。

1.3.4 色譜條件

HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈（A）和水（B）；梯度洗脫程序：0～3 min，10%～30% A，90%～70% B；3.0～5.0 min，30% A，70% B；5.0～10.0 min，30%～95% A，70%～5% B；10.0～12.0 min，95% A，5% B；12.0～12.1 min，95%～10% A，5%～90% B；12.1～14.0 min，10% A，90% B。流速：0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣體積2 μL。

1.3.5 質譜條件

電噴霧離子源，負離子模式；毛細管電壓2.4 KV；錐孔電壓40 V；脫溶劑氣溫度500 ℃；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣流速850 L/h；錐孔氣流速150 L/h；碰撞氣流速0.12 mL/min；掃描方式為多反應監測；抗氧化劑的定性定量離子對、裂解電壓、駐留時間及碰撞能量見表1。

表1 9種抗氧化劑的質譜參數Table 1 Optimal MS parameters for nine antioxidants

1.4 數據處理

通過與儀器配套的MasslynxTM色譜數據處理系統完成數據采集與處理，以及Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優化

2.1.1 質譜條件優化

9 種抗氧化劑均為含有不同酚羥基的化合物，在電噴霧離子源下易電離形成負離子。將1 μg/mL的9 種抗氧化劑標準溶液通過蠕動泵注入質譜儀，通過一級質譜掃描獲得相應的母離子，優化噴霧電壓、噴霧器溫度等質譜參數獲得最優離子源參數；隨后通過子離子掃描選擇信號強且穩定的碎片離子，分別確定定性離子及定量離子，進一步優化裂解電壓、碰撞能量等參數，得到目標化合物的MRM質譜參數，具體見表1。

分析抗氧化劑結構式及質譜圖發現，9 種酚類抗氧化劑均易失去H+形成[M-H]-的準分子離子峰，以THBP為例，見圖1。因結構式中有多個酚羥基，使準分子離子峰成簇狀（與同位素分布有所不同），這種簇狀碎片離子峰有助于對酚類抗氧化劑的輔助定性。實驗發現目標化合物丟1 個H+的[M-H]-碎片離子更穩定，推測原因應該是丟失1 個H+的帶電碎片若進一步丟失離子或碎片在能量需求上會提高。二級碎裂方面，二級碎片均為丟掉其支鏈結構，產生信號較強的碎片離子、其他幾種抗氧化劑雖母體骨架不同，主要裂解規律均是丟失不同的支鏈結構得到信號強且穩定的碎片離子。此外BHT只有1 個酚羥基，結構穩定，不易電離，[M-H]-碎片響應最高、最穩定碎片，確定為定量離子，[M-OH]-為其定性離子。總之，通過對不同抗氧化劑裂解規律分析發現，化合物的質譜裂解表現同其結構特征密切相關，對于化合物準確定性具有較好確證作用。

圖1 THBP二級全掃描質譜圖Fig.1 MS2 spectra of THBP

2.1.2 色譜條件優化

9 種抗氧化劑極性差異大，在色譜柱上保留行為有較大區別。常規C18色譜柱即對所有化合物保留，但不同色譜柱在分離度和峰形上有較大的差別。分別對BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH C18（75 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）進行考察。在相同色譜條件下，BEH C18短柱對9 種抗氧化劑不能很好的分離，且峰拖尾嚴重，BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）雖然分離上達到了要求，對于含酚羥基較多的PG、THBP、OG及DG等化合物仍存在較嚴重的拖尾。HSS T3色譜柱具有消除酚類化合物或有機酸等化合物拖尾嚴重的作用。流動相方面，分別考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-10 mmol/L醋酸銨溶液、乙腈-0.05%甲酸溶液幾種流動相對目標物的影響，結果發現乙腈較甲醇有更好的洗脫效果和峰形。加入醋酸銨后峰形拖尾嚴重，響應降低，加入適當甲酸在修飾峰形上效果較好，但加入酸后部分抗氧化劑響應降低，特別是BHT響應下降明顯，最終選擇乙腈-水為流動相。通過優化梯度洗脫程序，使目標物與雜質組分有效地分離，峰形良好，滿足要求，結果見圖2。

圖2 9種抗氧化劑標準溶液多反應監測色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of nine antioxidant standard solutions

2.2 提取條件優化

2.2.1 提取劑的優化

食用油脂肪含量高，基質復雜，且9 種酚類抗氧化劑性質差異較大，如何高效率、低雜質的提取是實驗的關鍵第一步。分別考察甲醇、乙腈、0.1%酸化乙腈、0.2%酸化乙腈、0.5%酸化乙腈、1%酸化乙腈作為提取劑的提取效果。結果發現，純甲醇提取效率明顯高于乙腈，但對提取液進行全掃描發現，甲醇提取的總離子響應為乙腈的2 倍以上，且干擾峰更多，這應該是質子性溶劑甲醇對酚類抗氧化劑提取效果提升的同時對植物油中的雜質共提取率也提高。

如何將提取效率與降低共萃物同時兼顧，實驗考察在乙腈中加入不同濃度的甲酸，以期達到改變目標物化學行為的目的。由圖3A可以看出，加入甲酸后，抗氧化劑提取效率有明顯的提高，應該是對于弱酸性抗氧化劑，酸度的提高提高其分子狀態所占比，表現為在非質子溶劑乙腈中溶解度提高。為較直觀比較幾種提取溶劑提取效率，設定乙腈提取效率為1，其他提取溶劑的提取效率與其比值為比較因子f，見圖3B。通過分析比較因子發現，隨著甲酸含量的提高，提取效率提升，不同酸度提取溶劑提取效率趨勢一致，其中DNGA變化最為明顯，結構分析可能是含有4 個酚羥基受酸的影響大。當酸體積分數達到1%后，部分化合物回收率反而有所降低，可能是酸含量過高對質譜響應有一定的抑制作用。綜合考慮，選擇0.5%甲酸-乙腈為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑對抗氧化劑提取效率的比較Fig.3 Recoveries of nine antioxidants with different extraction solvents

2.2.2 提取次數的優化

以0.5%甲酸-乙腈為提取劑，考察提取次數對不同抗氧化劑提取效率的影響。分別對提取1、2、3 次進行考察，發現提取2 次回收率明顯高于1次，進一步增加提取次數，回收率無明顯提高，因此以0.5%甲酸-乙腈提取2 次對植物油中抗氧化劑進行處理。

2.2.3 穩定劑的確定

抗氧化劑標準溶液及前處理檢測過程中，部分抗氧化劑存在含量下降的現象，參考文獻[32]在抗氧化劑的標準溶液及提取溶液中加入AP改善標準溶液的存儲及前處理過程中抗氧化劑的不穩定性。實驗發現質量濃度為50 μg/mL的AP即可保證9 種抗氧化劑含量穩定。因此本研究在標準溶液和提取溶劑中加入50 μg/mL的AP作為穩定劑。

2.2.4 除脂方式的選擇

正己烷為一種常用除脂溶劑，并被用于現行國家標準。然而本實驗發現，當乙腈作為提取溶劑時，正己烷除脂后部分氧化劑會產生一定的損失。將正己烷萃取液氮吹，復溶后檢測，如圖4所示，折線為正己烷中溶解的抗氧化劑所占比例，發現BHT損失20%以上，其他抗氧化劑也有不同程度的損失。分析發現損失明顯的BHA、Ionox-100、BHT、DG幾種抗氧化劑，在結構上因苯環上有不同數量的叔丁基或烷基長鏈而極性相對較低，更易溶于低極性的正己烷。當提取溶劑中加入酸后，除脂步驟沒有引起回收率降低，部分回收率反而有所提高，推測原因應該是酸度的提高使酚羥基以更高比例成分子狀態而參與自身的電荷傳遞，提高了極性，減少了目標物的損失。因此，本實驗選擇酸性乙腈提取后，正己烷進行除脂凈化。

圖4 不同除脂方式對抗氧化劑回收率的影響Fig.4 Effect of defatting solvents on recoveries of nine antioxidants

2.2.5 固相萃取柱的選擇

本實驗對直接提取、C18、HLB固相萃取柱、中性氧化鋁柱、氨基柱及PRiME HLB固相萃取柱幾種前處理凈化手段進行比較。選擇空白花生油基質分別在加標回收、凈化液全掃描及基質效應等方面進行比較。直接提取不經凈化容易污染儀器，堵塞色譜柱，帶來嚴重基質效應，影響定量結果的準確性。GB 5009.32—2016中所用的C18固相萃取柱對9 種抗氧化劑的保留不強，超過50%含量的目標物在上樣過程中損失，在洗脫步驟僅有6.95%～53%含量的目標物。同樣，實驗發現氨基柱和中性氧化鋁柱對不同抗氧化劑保留上表現出了不同的選擇性，分別對BHA、Ionox-100、BHT和BHA、Ionox-100、BHT、TBHQ有一定的回收率，其他抗氧化劑幾乎無回收率，分析原因是2 種正相模式固相萃取柱對極性稍強抗氧化劑作用力太強，不容易洗脫下來。

圖5 不同凈化方式對抗氧化劑回收率的影響Fig.5 Effect of cleanup solvents on recoveries of nine antioxidants

由圖5可以看出，HLB固相萃取柱對所有抗氧化劑都有一定的保留，但回收率有一定的差別，TBHQ、BHA、BHT、Ionox-100四種抗氧化劑回收率小于40%，PG、THBP、NDGA、BHA、OG、DG回收率在60%～80%，分析原因可能是HLB為親水親脂平衡共聚合填料，含有特定比例的親水基和疏水基，HLB的保留強弱與抗氧化劑的極性有關。PRiME HLB填料是在HLB基礎上開發的反相固相萃取凈化材料，無需活化和平衡步驟，凈化過程只吸附雜質，目標成分不保留。PRiME HLB對所有抗氧化劑回收率滿意，體現了其較好的通量性。此外，基質效應考察發現PRiME HLB凈化效果較C18和HLB好。對PRiME HLB凈化過程優化，直接上樣收集后幾種抗氧化劑有小于10%的損失，需要進一步的乙腈洗脫，因此本凈化過程合并兩次洗脫液后回收率和凈化效果均滿意。因此本研究選擇用酸化乙腈提取后PRiME HLB固相萃取柱凈化。

2.2.6 樣品定容液的選擇

分別對乙腈、甲醇、甲醇-水（80∶20，V/V）、甲醇-水（50∶50，V/V）、甲醇-水（20∶80，V/V）幾種定容溶劑進行考察。結果發現不同的溶劑定容液，色譜峰形和質譜信號有一定差異。質譜響應上，甲醇與乙腈相比目標物響應高，不同比例甲醇-水響應變化不大。峰形方面，以色譜峰的不對稱因子對色譜峰進行評價，不對稱因子為同高度處后半峰的寬度與10%峰高處前半峰的寬度之比，當不對稱因子大于1時為拖尾峰，當不對稱因子小于1時前延峰。從表2可以看出，以PG、THBP、TBHQ、NDGA幾種保留弱的抗氧化劑受溶劑效應影響大，在高比例有機相中有明顯前延峰，降低有機相比例，前延峰得到較好改善。綜合考慮，選擇甲醇-水（50∶50，V/V）溶液作為樣品定容液。

表2 9種抗氧化劑不同定容溶液中色譜峰不對稱因子Table 2 Asymmetry factors (As) of different solvents to nine antioxidants

2.3 線性范圍、相關系數及定量限

將標準儲備液用空白樣品溶液稀釋質量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50、100、250、500、1 000 ng/mL的系列標準工作溶液（含50 μg/mL AP）。按質量濃度由低到高依次測定，以各物質定量離子對的峰面積（Y）對其質量濃度（X）作標準曲線，其線性相關系數均大于0.994。采用空白基質加標的方法，以信噪比為10得到目標物的定量限，以信噪比為3得到目標物的檢出限。結果見表3，9 種抗氧化劑檢出限在0.003～0.02 mg/kg之間，定量限在0.01～0.05 mg/kg之間，與現行方法比較具有較高靈敏度（表4）。

表3 9種抗氧化劑的回歸方程、線性相關系數、線性范圍、檢出限及定量限Table 3 Calibration equations, correlation coefficients, linear ranges, and limits of detection and quantitation of nine antioxidants

表4 9種抗氧化劑在現有標準及文獻中的定量限Table 4 LOQs specified in the national standard and reported in the literature for nine antioxidants mg/kg

2.4 回收率和精密度結果

表5 不同食用油中9種抗氧化劑加標回收率及精密度（n=6）Table 5 Average recoveries and RSDs of nine antioxidants in spiked vegetable oil samples (n= 6)

分別在花生油、玉米油、大豆油中添加0.05、0.5、5.0 mg/kg三個水平的9 種抗氧化劑標準溶液，每個水平重復測定6 次，按照1.3.2節前處理方法進行提取凈化，經超高效液相色譜-串聯質譜測定，結果如表5所示。加標回收率在82.2%～115.2%范圍內，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于9.3%。

2.5 基質效應

圖6 植物油中9 種抗氧化劑基質效應評價圖Fig.6 Matrix effects in HPLC-MS analysis of nine antioxidants in vegetable oil

液相色譜-串聯質譜法具有較高的靈敏度，但基于其檢測原理，存在一定的基質效應，通過正己烷除脂結合PRiME HLB對樣品提取液凈化，可以較好去除鹽、蛋白、脂肪及磷脂等干擾成分，降低樣品的基質效應。按1.3.3節方法對花生油、玉米油、橄欖油、大豆油及調和油5 種植物油中9 種抗氧化劑的基質效應進行評價。如圖6所示，不同抗氧化劑在不同植物油中基質效應存在一定的差異，基質效應較小的為花生油和玉米油，基質效應稍嚴重的為橄欖油和調和油，分析原因可能與不同植物油中化學成分差異有關。不同抗氧化劑在不同植物油中受影響程度不同，色譜上出峰晚的抗氧化劑基質效應更明顯，應該是植物油中主要干擾物為低極性化合物，隨著洗脫強度的提高，更多共流出物被洗脫下來。綜合考慮，本實驗采用空白基質匹配校正曲線定量，以減少基質干擾對結果的影響。

2.6 實際樣品測定

采用本實驗建立的分析方法對市場上購買的玉米油、調和油、花生油等20 批次樣品進行分析，有6 批次植物油檢出抗氧化劑，1 批次花生油中PG 、Ionox-100、DG含量分別為0.05、0.12、0.15 mg/kg；2 批次胡麻油中Ionox-100含量分別為3.15 mg/kg和27.6 mg/kg；1 批次牡丹籽油中BHT含量為36.0 mg/kg；2 批次紫蘇油中NDGA含量分別為6.03 mg/kg和14.8 mg/kg。

3 結 論

本實驗建立采用新型通過式固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯質譜法分析植物油中9 種抗氧化劑的通量檢測方法。該方法通過保留雜質的通過式凈化手段，結合高靈敏度的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，實現不同植物油基質中9 種抗氧化劑的同時檢測。該方法樣品前處理簡便快速，定性、定量準確，可滿足植物油中9 種抗氧化劑的快速檢測，大幅提高了檢測效率，降低了檢測成本。