紅景天苷對哮喘模型小鼠氣道炎癥的抑制作用及其機制

欒 雪,延光海,李海波,張 波,張 巍,黃園園

（1.吉林大學第一醫院兒科，吉林 長春130021；2.吉林省過敏性常見疾病免疫與靶向重點實驗室，

吉林 延吉133002；3.吉林省長春市兒童醫院健康管理中心，吉林 長春130051）

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，以氣流的可逆性受限為特征，肥大細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和氣道上皮細胞等細胞及其組分參與其中，哮喘發病機制極為復雜［1-2］。目前，炎癥反應被認為在哮喘的發生發展過程中起重要作用，抑制炎癥反應是治療哮喘的主要手段［3］。炎癥小體是一類分布于細胞漿中的蛋白復合體，其參與細胞多種功能的調控［4］。由凋亡相關微粒蛋白（apoptosis associated speck like protein containing a CARD，ASC）、Caspase-1和NOD樣受體家族蛋白3（Nodlike receptor family pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）受體組成［5］，其通過剪切半胱氨酸蛋白酶1前體蛋白（pro-Caspase-1）激活白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）家族細胞因子分泌，參與機體的炎癥反應［6］。生理條件下，NLRP3處于自身抑制狀態，當受到刺激時，其主要通過溶酶體破壞模式、半通道模式和活性氧模式激活［7］。NLRP3的激活與促炎細胞因子的表達升高有關［8］。研究［9-10］顯示：在動物實驗中，敲除NLRP3基因的哮喘小鼠氣道炎癥明顯減輕，并且Th2相關細胞因子的產生明顯減少。CHEN等［11］研究顯示：抑制NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白等炎癥因子水平可以減少腎臟中促炎細胞因子的產生，從而起到保護腎臟的作用。因此，NLRP3可能是調控哮喘炎癥機制的重要靶標。

紅景天苷（salidroside，SAL）是植物紅景天的提取物，具有廣泛的藥用價值，對包括肺在內的多種組織和器官具有抗炎和抗氧化等生物學特性［12-13］。研究［14］顯示：在體外實驗中，SAL能夠降低Th2相關細胞因子表達水平，并且通過下調核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）降低卵清蛋白（ovalbumin，OVA）所致哮喘小鼠氣道的炎癥反應。CAI等［15］發現：SAL可以通過靶向調節IL-33/ST 2抑制2型固有淋巴樣細胞（type 2 innate lymphoid cell，ILC2）介導的氣道炎癥治療過敏性哮喘。目前尚無關于SAL在哮喘小鼠模型中對NLRP3炎性小體影響的相關報道。本研究建立OVA誘導的小鼠哮喘模型，探討SAL對NLRP3炎性小體的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器6～8周齡清潔級BALB/c雌性小鼠50只，體質量（21.0±2.5）g，購于延邊大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（吉）2017-0003。SAL購自中國源葉生物科技有限公司，OVA、PMSF和PIRA裂解液購于美國Sigma公司，白細胞介素1β

（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）、白細胞介素13（interleukin-13，IL-13）、白細胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）、白細胞介素18（interleukin-18，IL-18）和白細胞介素33（interleukin-33，IL-33）ELISA檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司，NLRP3抗體、ASC抗體、Caspaes-1抗體和IL-1β抗體購自美國Cell Signaling公司，β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Scientific公司。蛋白印跡電泳儀和轉膜儀購自美國Bio-Rad公司，酶標分析儀購自南京德鐵實驗設備有限公司，TXD3臺式離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，光學顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 實驗動物分組和模型制備將50只BALB/c雌性小鼠于延邊大學解剖學教研室動物室內適應性飼養7 d后，隨機分為對照組、OVA組、低劑量SAL組、高劑量SAL組和地塞米松組。參照LEE等［16］方法并加以改良制備哮喘模型，即正常小鼠于第1、7和14天腹腔注射混合液200μL（由生理鹽水、10 mg OVA和1 mg氫氧化鋁組成），第21天時將致敏小鼠置于實驗玻璃箱內，采用0.1 g OVA＋10 mL生理鹽水霧化的形式激發30 min，共7 d，每日1次。低和高劑量SAL組小鼠在每次激發免疫前1 h分別腹腔注射30和60 mg·kg－1SAL治療液，地塞米松組小鼠腹腔注射2 mg·kg－1地塞米松治療液，而對照組小鼠以同等劑量生理鹽水代替。

1.3 各組小鼠氣道高反應性檢測最后1次OVA強化免疫48 h后，將清醒的小鼠置于氣壓體積描記室，記錄3 min內平均基線讀數，采用乙酰甲膽堿（2.5～50.0 g·L－1）霧化3 min，記錄平均值。根據氣道高反應檢測儀器的說明書［17］計算增強呼氣間歇（enhanced pause，Penh），作為氣道縮窄指數反映氣道反應性增高的程度。

1.4 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）收集和細胞計數完成氣道反應性的檢測后麻醉小鼠，采用1 mL冷PBS液行支氣管肺泡灌洗，收集BALF，再將BALF置于4℃、15 000·min－1條 件 下，離 心5 min，上 清 液 于－80℃低溫保存，待測細胞因子。沉淀物加入雙蒸水200μL定容，采用涂片離心機涂片后，行Diff-quick染色，鏡下進行細胞分類計數。BALF中的細胞數由2名獨立研究者采用單盲研究確定，并且在顯微鏡下從3個隨機位置分析至少200個細胞。

1.5 各組小鼠BALF中IL-1β、IL-18、IL-33、IL-4、IL-13和IL-17A水平測定按照ELISA檢測試劑盒說明書要求，檢測各組小鼠BALF中IL-1β、IL-18、IL-33、IL-4、IL-13和IL-17A水平。

1.6 各組小鼠肺組織形態表現和炎癥評分各組小鼠麻醉后取左肺組織，采用甲醛溶液固定后，進行脫水、浸蠟和包埋，將蠟塊切成厚度為5μm的切片行HE染色，鏡下觀察各組小鼠肺組織形態表現以及氣道炎癥改變。確定炎癥評分：無炎癥為0分，偶見炎性細胞的浸潤為1分，多數支氣管或血管表層見1～2個炎性細胞為2分，中層見3～5個炎性細胞為3分，厚層見＞5個炎性細胞為4分。

1.7 各組小鼠肺組織中NLPR3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表達水平各組小鼠右側肺組織進行裂解獲取蛋白，BCA方法測定蛋白濃度后，每個泳道加入20μg總蛋白，置于12%SDSPAGE膠上90V電壓進行電泳，以250 mA電流進行轉膜90 min，再采用50 g·L－1脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗，4℃過夜。第2天洗膜后加入相應二抗于室溫下孵育1 h。洗膜3次后，加入ECL發光劑顯影，在圖像分析系統Amersham Imager 600中掃描，進行灰度值檢測。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.8 統計學分析采用SPSS 21.0統計軟件進行統計學分析。各組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數以及IL-1β、IL-18、IL-33、IL-4、IL-13和IL-17A水平，肺組織中NLPR3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表達水平均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠氣道高反應性水平檢測當乙酰甲膽堿劑量增至10.0 g·L－1后，OVA組小鼠氣道反應性開始明顯增加，當乙酰甲膽堿劑量為50.0 g·L－1時，OVA組小鼠的Penh值明顯高于對照組（P＜0.05）。與OVA組比較，高劑量SAL組小鼠Penh值明顯降低（P＜0.05），低劑量SAL組小鼠Penh值有下降趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 各組小鼠肺組織病理形態表現與對照組比較，OVA組小鼠可見氣道平滑肌增厚，支氣管周圍和血管周圍大量炎癥細胞浸潤。與OVA組比較，治療后各劑量SAL組小鼠肺組織炎癥細胞浸潤明顯減少，上述表現得到明顯改善。炎癥評分結果顯示：OVA組小鼠肺組織炎癥評分明顯高于對照組（P＜0.05）。與OVA組比較，高劑量SAL組小鼠肺組織炎癥評分明顯降低（P＜0.05）；低劑量SAL組小鼠肺組織炎癥評分降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2和3。

2.3 各組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數與對照組比較，OVA組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數均明顯增加（P＜0.05）。與OVA組比較，高劑量SAL組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數明顯減少（P＜0.05）；低劑量SAL組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數有下降趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

2.4 各組小鼠BALF中IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A、IL-18和IL-33水平與對照組比較，OVA組小鼠BALF中IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A、IL-18和IL-33水平明顯升高（P＜0.05）。與OVA組比較，高劑量SAL組小鼠BALF中IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A、IL-18和IL-33水平降低（P＜0.05）；低劑量SAL組小鼠BALF中IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A、IL-18和IL-33水平有下降趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 各組小鼠氣道高反應性的變化趨勢圖Fig.1 Trend charts of changes in airway hyperresponsiveness of mice in various groups

圖2 各組小鼠肺組織形態表現（HE，×100）Fig.2 Morphology of lung tissue of mice in various groups(HE,×100)

圖3 各組小鼠肺組織炎癥評分Fig.3 Inflammation scores of lung tissue of mice in various groups

2.5 各組小鼠肺組織中NLPR3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表達水平與對照組比較，OVA組小鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。與OVA組比較，高劑量SAL組小鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表達水平降低（P＜0.05）。與OVA組比較，低劑量SAL組小鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖4 各組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數Fig.4 Numbers of eosinophils, neutrophils and lymphocytes in BALF of mice in various groups

3 討 論

哮喘是一種與氣道高反應性相關的慢性炎癥性疾病，其特征是反復發作的喘息、胸悶和咳嗽。據估計，到2025年時全球將有4億人患有哮喘［17-18］。炎癥反應在哮喘的發生發展過程中發揮重要作用，是哮喘的可能發生機制之一，即使哮喘臨床癥狀完全消失，氣道炎癥和氣道高反應性依然存在，從而引起臨床癥狀反復發作，導致氣道重塑和不可逆的肺功能損害［19-20］。本研究結果顯示：SAL能明顯降低哮喘小鼠氣道阻力，并且對肺內炎癥細胞具有抑制作用。同時SAL可以明顯降低哮喘小鼠BALF中中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞數，以及IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A、IL-18和IL-33等促炎細胞因子的表達，表明SAL可以抑制哮喘小鼠氣道的炎癥反應。

表1 各組小鼠BALF中IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A、IL-18和IL-33水平Tab.1 Levels of IL-1β,IL-4,IL-13,IL-17A,IL-18,and IL-33 in BALF of mice in various groups[n=10,±s,ρB/(ng·L?1)]

表1 各組小鼠BALF中IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A、IL-18和IL-33水平Tab.1 Levels of IL-1β,IL-4,IL-13,IL-17A,IL-18,and IL-33 in BALF of mice in various groups[n=10,±s,ρB/(ng·L?1)]

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with OVA group.

Group Control OVA SAL Low dose High dose Dexamethasone IL-1β 36.38±3.80 73.90±13.85*69.21±14.73 48.24±10.97△41.41±8.78△IL-4 75.44±5.35 255.05±24.16*219.43±21.38 160.46±7.10△110.84±10.65△IL-13 87.57±5.04 295.17±20.64*247.21±12.05 187.02±18.14△142.80±8.41△IL-17A 55.64±8.46 120.36±16.63*103.03±10.16 72.14±11.34△69.28±9.98△IL-18 110.51±7.99 194.92±19.81*161.87±14.95 130.60±13.85△118.66±12.86△IL-33 130.35±7.83 257.40±12.75*222.89±11.01 179.79±11.95△153.34±9.62△

圖5 各組小鼠肺組織中NLPR3、ASC、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of NLPR3,ASC,Caspase-1,pro-IL-1β,and IL-1βproteins in lung tissue of mice in various groups

NLRP3是炎癥小體受體家族成員之一，其主要在中性粒細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞和上皮細胞中表達，能夠識別各種危險信號，釋放細胞因子，誘導炎性細胞的活化。研究［21-23］顯示：NLRP3炎性小體的活化能夠促進pro-caspase-1轉變為caspase-1，促進炎癥因子IL-18和IL-1β的釋放，引發炎癥反應，促進中性粒細胞的募集。NLRP3炎性小體的激活與氣道中變應原驅動的炎癥反應發生有關。肺部NLRP3炎性小體的激活可通過感染、過敏原和香煙煙霧等空氣中的污染物刺激而觸發［24］。研究［25］顯示：在OVA誘導的急性氣道炎癥模型中，與對照組比較，缺乏NLRP3炎性小體的小鼠氣道中嗜酸性粒細胞數減少、氣道高反應性減少、氣道炎癥程度減輕、杯狀細胞聚集減少以及IL-1β表達降低。研究［8，26-27］顯示：抑制NLRP3炎性小體的表達，可以抑制氣道黏液分泌，減少Th2細胞因子和趨化因子的產生，降低IgE水平。

SAL是草本植物紅景天分離提純后的有效成分之一，具有良好的抗炎和抗氧化特性。研究［28］表明：SAL能阻止遷移-衍生生長因子誘導氣道平滑肌細胞中NF-κB信號通路的激活。研究［29-30］顯示：SAL通過調節Th1/Th2平衡，從而減輕哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應性，具有潛在的臨床應用前景。本研究結果顯示：SAL能抑制哮喘小鼠氣道炎癥，并且抑制小鼠肺組織中NLRP3炎性小體的表達水平。上述實驗結果表明：SAL能抑制抑制哮喘小鼠的氣道炎癥反應，并且可能下調NLRP3炎性小體的表達，但具體發生機制仍需今后進一步研究。

綜上所述，SAL能明顯降低哮喘小鼠氣道阻力，并且減輕肺內炎癥細胞浸潤。SAL可以抑制哮喘小鼠BALF中的炎癥細胞和促炎細胞因子的表達，并下調NLRP3炎性小體的表達，從而緩解哮喘小鼠肺組織炎癥反應。因此，下調NLRP3炎性小體的表達可能是SAL抑制哮喘小鼠氣道炎癥的作用機制之一。