尿石素B對人神經膠質瘤U118 MG細胞生物學行為的影響及其機制

劉翠蘭,李建軍,姜 賀,劉 晶,王 丹,李 晨,趙 娣

（1.濱州醫學院附屬醫院代謝與神經精神疾病研究所，山東 濱州256603；2.山東省濟南市第一人民醫院急診科，山東 濟南250000）

神經膠質瘤（glioblastoma，GBM）是中樞神經系統最常見的原發性腫瘤，全世界每年約有10萬人被診斷為GBM［1］。GBM惡性程度較高，發病率高，占所有惡性腦瘤的80%。GBM患者生存率低，1年生存率為37.4%，5年生存率僅為4.9%［2］。外科手術和放化療是目前主要的治療方法，但是GBM患者預后較差，容易對化療藥物產生抗性，因此尋找和開發新的治療手段和藥物具有重大意義。尿石素B（urolithin B，UB）是鞣花單寧的腸道微生物代謝產物之一，在石榴、漿果和核桃等植物中廣泛存在［3］，具有抗炎和抗氧化的活性［4］，對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用［5］。研究［6-8］表明：UB具有抗癌活性，在體外可以抑制肝癌細胞、黑色素瘤細胞和前列腺癌細胞的增殖，但是其對GBM的作用尚未見報道。本研究以人GBM的U 118 MG細胞作為研究對象，觀察UB對人GBM細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人GBM的U 118 MG細胞購自中國科學院細胞庫。UB購自美國Sigma公司，DMEM培養基、胎牛血清、胰酶和1%青霉素-鏈霉素均購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒購自MCE公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質膠、FITC AnnexinⅤ凋亡檢測試劑盒和PI/RNase染色液均購自美國BD公司，RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司，蛋白酶抑制劑PMSF購自生工生物工程（上海）股份有限公司，磷酸酶抑制劑PhosSTOP購自德國Roche公司，BCA蛋白定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，蛋白Marker購自美國Thermo Fisher公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，鼠抗波形蛋白（Vimentin）抗體購自美國Immunoway公司，兔抗上皮型黏附蛋白（epithelial adhesive protein，E-cadherin）抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，兔抗B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）和兔抗Bcl-2相關X蛋白（Bax）抗體購自美國Santa Cruz公司，鼠抗β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，驢抗鼠二抗IR Dye800 CW和羊抗兔二抗IR Dye680 LT均購自美國Li-COR公司。SpectraMax M 5酶標儀（美國Molecular Devices公司），IX53光學顯微鏡（日本Olympus公司），流式細胞儀（美國BD公司），雙紅外激光成像系統（美國Li-COR公司）。

1.2 細胞培養U118 MG細胞采用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基培養，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。

1.3 CCK-8法檢測各組U 118 MG細胞增殖率取對數生長期U 118 MG細胞接種于96孔板中，每孔接種3 000個細胞，培養過夜，采用不同濃度（0、20、40、80、120、160和200μmol·L－1）UB分別處理24、48和72 h。每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃繼續培養2 h，采用酶標儀檢測450 nm處吸光度（A）值。光學顯微鏡下觀察各組U118 MG細胞增殖形態表現并計算細胞增殖率。細胞增殖率=（實驗組A值－空白組A值）/（對照組A值－空白組A值）×100%。

1.4 細胞克隆形成實驗檢測各組U118 MG細胞克隆形成率取對數生長期細胞接種于12孔板中，每孔接種500個細胞，培養24 h后，加入不同濃度（0、40、80和120μmol·L－1）UB，孵育細胞48 h后將培養基更換為不含UB含10%胎牛血清的DMEM培養基。繼續培養12 d后，吸出培養基，采用PBS洗滌2次，加入甲醇固定15 min，再加入PBS洗滌2次，加入0.1%結晶紫溶液染色15 min，清水漂洗浮色，拍照并計數，計算細胞克隆形成率。細胞克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。

1.5 劃痕愈合實驗檢測各組U 118 MG細胞劃痕愈合率取對數生長期細胞接種于6孔板中，每孔接種1×106個細胞，培養24 h后，采用200μL移液器吸頭做“井”字劃痕，PBS輕輕洗滌3次，加入無血清培養基和不同濃度（0、40、80和120μmol·L－1）UB培養，于0、24和48 h 3個時間點觀察，并在顯微鏡下拍照，采用Image J軟件計算劃痕面積和劃痕愈合率。劃痕愈合率=（0 h劃痕面積－培養后劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.6 Transwell小室法檢測各組U 118 MG細胞的侵襲細胞百分率Matrigel基質膠用PBS按照1∶8的比例稀釋，取80μL基質膠稀釋液加入Transwell上室中，37℃培養箱放置2 h。采用無血清DMEM培養基將細胞濃度調整至1×105mL－1，取150μL加入Transwell上室，同時加入不同濃度（0、40、80和120μmol·L－1）UB。Transwell下 室 加 入 含20%胎牛血清的DMEM培養基，培養24 h后，取出小室以甲醇固定20 min，PBS洗滌后，加入0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗滌后，置于顯微鏡下觀察拍照。每個小室隨機取3個視野統計侵襲細胞數。侵襲細胞百分率=實驗組侵襲細胞數/對照組侵襲細胞數×100%。

1.7 流式細胞術檢測各組U 118 MG細胞凋亡率和不同細胞周期細胞百分率細胞凋亡率檢測：取對數生長期細胞接種于6孔板中，培養24 h后，加入不同濃度（0、40、80和120μmol·L－1）UB處理24 h，以不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，然后采用冰預冷的PBS洗滌3次，根據FITC AnnexinⅤ細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，采用1×Binding Buffer重懸細胞，加入5μL AnnexinⅤ-FITC染色15 min，然后在檢測前5 min加入5μL PI染色。細胞充分重懸后，上機檢測細胞凋亡率。不同細胞周期細胞百分率檢測：取對數期細胞接種于6孔板中，培養24 h后，加入不同濃度（0、40、80和120μmol·L－1）UB處理24 h，胰酶消化并離心收集細胞，PBS洗滌3次，采用500μL PBS重懸細胞后，加入3.5 mL冰預冷的70%乙醇，4℃固定過夜，然后離心收集細胞，PBS洗滌細胞3次，最后加入500μL PI/RNase染色液，避光染色15 min。細胞充分重懸后，上機檢測，采用Modfit軟件分析不同細胞周期細胞百分率。

1.8 Western blotting法檢測各組U 118 MG細胞中Vimentin、E-cadherin、Bcl-2和Bax蛋白表達水平U 118 MG細胞經不同濃度（0、40、80和120μmol·L－1）UB處理24 h后，RIPA裂解液冰上裂解細胞，離心收集蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測U 118 MG細胞中各種蛋白表達水平，加入上樣緩沖液，100℃變性10 min。蛋白樣品采用12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，濕轉法將蛋白轉至PVDF膜，PVDF膜采用p H 7.4的TBST緩沖液配制的5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。再分別加入一 抗Anti-Vimentin（1∶1 000），anti-E-cadherin（1∶5 000），Anti-β-actin（1∶1 000），Anti-Bcl-2（1∶200），Anti-Bax（1∶200），4℃封閉過夜。TBST緩沖液洗滌4次，每次10 min，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜4次，采用雙紅外激光成像系統成像并識別灰度，分析蛋白條帶灰度值。目標蛋白表達水平=目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.9 統計學分析采用GraphPad Prism 7.0統計軟件進行統計學分析。各組細胞增殖率，克隆形成率，劃痕愈合率，侵襲細胞百分率，細胞凋亡率，不同細胞周期細胞百分率，細胞中Vimentin、E-cadherin、Bcl-2和Bax蛋白表達水平符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用χ2或SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組U 118 MG細胞增殖率和克隆形成率不同濃度UB分別處理U118 MG細胞24、48和72 h后，采用CCK-8法檢測細胞的增殖率結果顯示：細胞增殖率隨著UB濃度的增加而降低，相同劑量時，隨著時間的延長，藥物對細胞增殖率的抑制作用增強。作用24 h后，與對照組（100.00%±3.57%）比較，80、120、160和200μmol·L－1UB組U 118 MG細 胞 增 殖 率 （85.51%±1.96%、80.51%±1.44%、64.15%±0.41%和59.73%±2.07%）明顯降低（P＜0.01）（圖1A）。作用48 h后，與對照組（100.00%±2.75%）比較，80、120、160和200μmol·L－1UB處理組U118 MG細胞增殖率（80.77%±3.83%、70.41%±2.86%、60.66%±0.67%和57.53%±2.05%）明顯降低（P＜0.01）（圖1B）。作用72 h后，與對照組（100.00%±3.31%）比較，40、80、120、160和200μmol·L－1UB組U 118 MG細 胞 增 殖 率（86.36%±1.91%、62.36%±3.15%、53.06%±2.06%、42.76%±1.27%和37.42%±1.76%）明顯降低（P＜0.01）（圖1C）。隨著UB濃度的增加，細胞發生皺縮，細胞間連接減少（圖2）。40、80和120μmol·L－1UB組U 118 MG細胞克隆形成率（8.66%±0.27%、3.02%±0.17%和1.31%±0.10%）明顯低于對照組（13.60%±0.35%）（P＜0.01），且呈濃度依賴性。見圖3和4。

圖1 CCK-8法檢測各組U 118 MG細胞增殖率Fig.1 Proliferation rates of U 118 MG cells in various groups detected by CCK-8 method

圖2 光學顯微鏡下各組U 118 MG細胞增殖形態表現(×100)Fig.2 Proliferation morphology of U 118 MG cells in various groups under optical microscope(×100)

圖3 結晶紫染色觀察各組細胞克隆形成情況Fig.3 Clone formation of U 118 MG cells in various groups osberved by crystal violet

圖4 各組U 118 MG細胞克隆形成率Fig.4 Clone formation rates of U 118 MG cells in various groups

2.2 各組U 118 MG細胞劃痕愈合率和侵襲細胞百分率與對照組比較，不同濃度UB組U 118 MG細胞遷移能力降低，且呈濃度依賴性（圖5）。作用24 h后，40、80和120μmol·L－1UB組U118 MG細胞劃痕愈合率（27.28%±4.37%、18.40%±1.43%和6.94%±0.35%）低于對照組（47.51%±2.23%）（P＜0.01）；作用48 h后，40、80和120μmol·L－1UB組U 118 MG細胞劃痕愈合率 （39.18%±3.15%、 25.50%±4.17% 和12.13%±1.21%） 低 于 對 照 組 （54.51%±3.51%）（P＜0.05或P＜0.01）。

40、80和120μmol·L－1UB組侵襲U118 MG細胞百分率（81.67%±3.37%、61.67%±2.50%和46.94%±3.64%）低于對照組（100.00%±5.67%）（P＜0.05或P＜0.01），且呈濃度依賴性。見圖6。

2.3 各組U 118 MG細胞凋亡率和不同細胞周期U118 MG細胞百分率作用24 h后，80和120 μmol·L－1UB組U 118 MG細 胞 凋 亡 率（14.70%±1.45%和19.35%±1.58%）高于對照組（8.51%±0.31%）（P＜0.05或P＜0.01）；40 μmol·L－1UB組 細 胞 凋 亡 率 （10.89%±0.54%）與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖7。

與對照組（12.15%±0.46%）比較，80和120μmol·L－1UB組S期 細 胞 百 分 率（5.63%±0.28%和6.42%±0.26%）明顯降低（P＜0.01）；40μmol·L－1UB組S期 細 胞 百 分 率（11.57%±0.84%）差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組（7.11%±0.68%）比較，80和120μmol·L－1UB組G2/M期細胞百分率（13.27%±1.23%和11.69%±1.43%） 明 顯 升 高 （P＜0.01）；40μmol·L－1UB組G2/M期細胞百分率（8.15%±0.38%）差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組比較，40、80和120μmol·L－1UB組G1期細胞百分率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖8。

圖5 劃痕愈合實驗檢測各組U 118 MG細胞劃痕愈合情況（×40）Fig.5 Scratch healing of U118 MG cells in various groups detected by scratch healing test（×40）

圖6 Transwell小室實驗檢測各組U 118 MG細胞侵襲情況（結晶紫，×40）Fig.6 Invasion of U118 MG cells in various groups detected by Transwell chamber assay（Crystal violet,×40）

圖7 流式細胞術檢測各組U118 MG細胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of U 118 MG cells in various groups detected by flow cytometry

2.4 各組U 118 MG細胞中Vimentin、E-cadherin、Bcl-2和Bax蛋白表達水平與對照組（1.00±0.02）比較，80和120μmol·L－1UB組U118 MG細胞中Vimentin蛋白表達水平（0.87±0.03和0.77±0.02）降低（P＜0.05或P＜0.01）；與對照組（1.00±0.04）比較，40、80和120μmol·L－1UB組U 118 MG細胞中E-cadherin蛋白表達水平（1.55±0.05、1.72±0.02和1.89±0.06）明顯升高（P＜0.01）。見圖9和10。

圖8 流式細胞術測各組不同細胞周期U 118 MG細胞百分率Fig.8 Percentages of U 118 MG cells at different cell cycles in various groups detected by flow cytometry

圖9 Western blotting法檢測各組U 118 MG細胞中Vimentin、E-cadherin、Bcl-2和Bax蛋白表達電泳圖Fig.9 Electrophoregram of expressions of Vimentin,E-cadherin,Bcl-2,and Bax proteins in U 118 MG cells in various groups detected by Western blotting method

與對照組（1.00±0.13）比較，80和120μmol·L－1UB組U 118 MG細胞中Bcl-2蛋白表達水平（0.59±0.04和0.44±0.03）降低（P＜0.05或P＜0.01）；與對照組（1.00±0.08）比較，80和120μmol·L－1UB組U 118 MG細胞中Bax蛋白表達水平（1.35±0.04和1.53±0.03）明顯升高（P＜0.01）。見圖9和10。

3 討 論

GBM是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤，具有高度浸潤性、易復發、死亡率高和預后差等特征［9］。外科手術和放化療是主要的治療方法［10］，但隨著耐藥性的出現，初次治療后容易復發，近年來免疫療法和基因療法等新的治療方法雖然給GBM的治療帶來了新的希望，但是尚未在臨床中廣泛應用［11-13］。天然化合物可以作用于多種信號通路，如生存、代謝和細胞凋亡等，一些天然制劑可以穿過血腦屏障，這些優點使之成為治療膠質瘤的潛在藥物。

圖10 各組U 118 MG細胞中Vimentin、E-cadherin、Bcl-2和Bax蛋白表達水平Fig.10 Expression levels of Vimentin,E-cadherin,Bcl-2,and Bax proteins in U 118 MG cells in various groups

鞣花單寧在腸道內被水解，其水解產物包括尿石素A（urolithin A，UA）、UB、尿石素C（urolithin C，UC）和 尿 石 素D（urolithin D，UD）［14-15］。尿石素在治療多種腫瘤時均有抗癌潛能，如抑制細胞增殖、促進凋亡、阻滯細胞周期和抑制細胞遷移［6-8，16］，同時尿石素能通過血腦屏障到達腦部病灶［17-18］，這是治療腦部腫瘤藥物的必要條件。本研究結果表明：UB能夠明顯抑制GBM細胞增殖，且呈時間和濃度依賴性，表明UB具有良好的抗GBM活性。GBM細胞上皮間質轉化與細胞侵襲和遷移能力密切相關［19］，UB能明顯抑制U118 MG細胞的遷移和侵襲能力，同時抑制細胞中Vimentin表達，并上調細胞中E-cadherin蛋白表達，說明UB通過調控上皮間質轉化相關蛋白抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲能力。對于前列腺癌細胞，UA能誘導caspase依賴性細胞凋亡［20］。本研究結果顯示：UB可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，提高促凋亡蛋白Bax的表達水平，未檢測到經典凋亡標記物caspase-3的激活；流式細胞術結果顯示：UB處理后膠質瘤細胞凋亡率明顯升高，表明UB可促進細胞凋亡從而抑制膠質瘤細胞增殖。研究［6］顯示：UB可誘導肝癌HepG2細胞發生G0/G1期阻滯，Bel7402細胞在S期明顯阻滯，本研究結果顯示：UB可誘導膠質瘤細胞G2/M期阻滯，可見UB可通過誘導細胞在G2/M期阻滯，從而抑制膠質瘤細胞增殖。研究［6，21-22］顯示：UA可通過P53信號通路誘導前列腺癌的細胞死亡，UA可通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制胰腺癌細胞增殖，UB可通過Wnt/β?catenin信號通路抑制肝細胞癌的生長。本研究結果顯示：UB對GBM具有明顯的抑制作用，但是其抗癌作用的具體信號通路仍需進一步研究。

綜上所述，UB能夠抑制人GBM的U 118 MG細胞增殖，改變細胞形態，抑制遷移和侵襲能力，同時誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯，從而發揮抗癌潛能。本研究為天然化合物UB作為治療GBM的潛在藥物提供了實驗依據。