miR-146b對急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺組織中ICAM-1表達的調控作用

龍光文,張 謙,楊秀林,吉春玲,董裕康

（貴州省人民醫院急診內科，貴州 貴陽550002）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是重癥監護病房患者常見的急性肺損傷并發癥，可引起嚴重的全身炎癥并導致多器官功能障礙和高死亡率［1］。目前，開發新的治療方法加強肺修復仍是治療該病的關鍵。微小RNA（microRNAs，miRNAs）作為非編碼微小單鏈RNA分子，參與呼吸系統的疾病進展過程［2］。miR-146b通過抑制MyD88/NF-κB信號通路減輕肺炎患兒肺組織的炎癥損傷［3］。miR-146b過度表達可有效改善脂多糖誘導的急性肺損傷［4］，說明miR-146b對不同病因引起的肺組織損傷具有一定的治療作用。此外，細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）作為一種細胞表面黏附受體，可促進受炎癥過程影響的組織中多個效應器/靶細胞相互作用，參與ARDS疾病進程，并在ARDS患者血清中高表達［5］。在ARDS小鼠模型中，抑制ICAM-1表達有助于改善肺部炎 癥［6］。研究［7］顯示：miR-146抑制 劑對白細 胞 介 素1β（interleukin-1β，IL-1β） 誘 導 的ICAM-1表達具有明顯促進作用，說明miR-146對炎癥條件下ICAM-1表達具有一定的調控能力，但miR-146b是否通過調控ICAM-1表達緩解ARDS患者肺組織損傷尚未明確。本研究通過過表達miR-146b干預ARDS大鼠，檢測其對肺組織中ICAM-1表達水平的影響，探討miR-146b對ARDS大鼠肺組織損傷的作用，為ARDS的治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、主要試劑和儀器健康雄性8周齡SD大鼠60只，體質量220～250 g，購自貴州醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證：SCXK（黔）2018-0001。HEK-293T細胞（美國保藏中心ATCC）。agomir-NC、miR-146b agomir、miR-146b mimic和mimic-NC（廣州銳博生物科技有限公司），油酸（湖南長沙恒昌化工有限公司），轉染試劑Lipofectamine 3000（美國Invitrogen公司），TRIzol試劑（上海晶抗生物工程有限公司），BCA蛋白質定量檢測試劑盒和蛋白裂解液（上海碧云天生物技術有限公司），IL-1β、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司），逆轉錄試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega公司），實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（日本TaKaRa公司），兔抗鼠ICAM-1抗體和GAPDH抗體（英國Abcam公司）。血氣分析儀（美國雅培公司），LightCycler480 RT-qPCR儀（瑞士Roche公司），電泳儀（美國Bio-Red公司），低溫離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 動物模型構建參考文獻［8］的方法，采用尾靜脈注射油酸構建ARDS大鼠模型。所有大鼠術前禁食12 h，腹腔注射40 mg·kg－1戊巴比妥麻醉，尾靜脈注射0.15 mL·kg－1油酸。6 h后大鼠呼吸頻次增加，若動脈血液氧合指數（oxygenation index，OI）＜200 mmHg，則表明造模成功。造模成功24 h后取材，進行各項指標檢測。

1.3 實驗分組和處理將大鼠分為假手術組、模型組、agomir陰性對照組和miR-146b agomir組。假手術組：大鼠麻醉后，尾靜脈注射0.15 mL·kg－1生理鹽水；模型組：大鼠麻醉后，尾靜脈注射0.15 mL·kg－1油酸；agomir陰性對照組：大鼠麻醉后，在術前1 h，采用微量注射器經頸部氣管注射50μL轉染復合物agomir-NC，并將大鼠直立旋轉，然后進行ARDS造模；miR-146b agomir組：與agomir陰性對照組相似，采用微量注射器經頸部氣管注射50μL miR-146b agomir轉染復合物，再進行ARDS造模。每組大鼠15只。

1.4 各組大鼠動脈血氣指標檢測取1 mL大鼠股動脈血，采用血氣分析儀檢測各組大鼠血氧分壓（PaO2）和吸入氧濃度（FiO2），并計算OI，OI=PaO2/FiO2。

1.5 各組大鼠肺組織濕/干重（W/D）比值檢測處死大鼠，開胸切除右肺中葉，稱濕重。將切除的組織置于恒溫干燥箱中48 h，待組織恒重后，稱干重。肺組織W/D比值=濕重/干重。

1.6 ELISA法檢測各組大鼠肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中IL-1β、IL-6和TNF-α水平處死大鼠，開胸結扎肺。取預冷的等滲生理鹽水分3次灌洗左肺支氣管肺泡，依次為2、2和1 mL，直到回收率達到85%以上。采用IL-1β、IL-6和TNF-α水平檢測ELISA試劑盒檢測各組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.7 HE染色觀察各組大鼠肺組織病理形態表現處死大鼠，開胸切除右肺后葉，置于4%多聚甲醛中固定后，常規制成肺組織石蠟切片。將石蠟切片干燥、脫蠟后，進行HE染色。滴加適量蘇木素染色5 min，蒸餾水沖洗，采用1%乙醇-鹽酸分色30 s，加入伊紅染色2 min，蒸餾水沖洗后，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明后，采用中性樹膠封固，最后采用光學顯微鏡觀察各組大鼠肺組織病理形態表現。

1.8 RT-qPCR法檢測各組大鼠肺組織中miR-146b和ICAM-1 mRNA表達水平取各組大鼠肺左葉部分，采用TRIzol法提取組織中總RNA。根據逆轉錄試劑盒操作說明將提取的RNA逆轉錄成cDNA。根據熒光定量試劑盒操作說明，取1μL cDNA為模板進行熒光定量擴增。miR-146b上游引物 為 5′-ATGCGCGCTGAGAACTGAATT-3′，miR-146b下游引物為5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；ICAM-1上游引物為5′-GTGATGCTCAGGTATCCATCCA-3′，下 游 引 物 為5′-CACAGTTCTCAAAGCACAGCG-3′；GAPDH上 游引 物 為5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游 引 物 為5′-GGAAGATGGTGATGGG ATT-3′。反應條件：95℃、5 min，95℃、15 s，60℃、40 s，共40個循環，72℃、1 min。采用2－ΔΔCt法計算大鼠肺組織中miR-146b和ICAM-1 mRNA表達水平。

1.9 Western blotting法檢測各組大鼠肺組織中ICAM-1蛋白表達水平取各組大鼠肺左葉部分提取總蛋白。加入1 mL預冷的裂解液，快速勻漿后，4℃、12 000 r·min－1離心3 min。取少量上清液，BCA檢測蛋白濃度。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，待完成電泳后，濕轉法將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene difluoride，PVDF）上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，采用含Tween20的Tris-HCl緩沖鹽溶液洗滌3次，再加入一抗ICAM-1（1∶5 000）和GAPDH（1∶2 500），4℃孵育過夜，采用TBST溶液沖洗PVDF膜3次，室溫下用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，TBST溶液洗滌3次。加入ECL化學發光液進行蛋白條帶顯像，以GAPDH作內參蛋白，采用Image J軟件對蛋白灰度值進行分析，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.10 雙熒光素酶報告系統檢測miR-146b和ICAM-1的靶向關系采用Targetscan（http：//www.targetscan.org）網站預測miR-146b和ICAM-1的靶向關系和堿基互補序列（3′-UTR）。合成含miR-146b結合位點的ICAM-1 3′-UTR序列，構建野生型ICAM-1 3′-UTR熒光素酶報告基因質粒（WT-ICAM-1）。同時，根據ICAM-1 3′UTR構建突變型ICAM-1 3′UTR熒光素酶報告基因質粒（MUT-ICAM-1）。將人HEK-293T細胞以1×104個/孔接種于96孔板上，達到60%匯合。將WT-ICAM-1和MUT-ICAM-1熒光素酶報告基因質粒分別與miR-146b mimic或mimic NC共轉染至HEK-293T細胞中，作為miR-146b mimic組和mimic NC組。轉染48 h后收集2組細胞，檢測2組HEK-293T細胞中相對熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/腎素熒光素酶活性。1.11 統計學分析 采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析。各組大鼠動脈PaO2和OI、肺組織W/D比值、肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平、肺組織中miR-146b和ICAM-1 mRNA及蛋白表達水平以及HEK-293T細胞中相對熒光素酶活性均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠動脈血氣指標和肺組織W/D比值與假手術組比較，模型組和agomir陰性對照組大鼠動脈血氣PaO2和OI值均明顯降低（P＜0.01），肺組織W/D比值明顯升高（P＜0.01）；與模型組和agomir陰性對照組比較，miR-146b agomir組大鼠動脈血氣PaO2和OI均明顯升高（P＜0.01），肺組織W/D比值明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠PaO2、OI和肺組織W/D比值Tab.1 PaO2 and OI and ratios of W/D in lung tissue of rats in various groups （n=15，±s）

表1 各組大鼠PaO2、OI和肺組織W/D比值Tab.1 PaO2 and OI and ratios of W/D in lung tissue of rats in various groups （n=15，±s）

*P＜0.01 compared with sham operation group；△P＜0.01 compared with model group；#P＜0.01 compared with agomir negative control group.

Group Sham operation Model Agomir negative control MiR-146b agomir PaO 2（P/mmHg）102.00±10.00 58.00±7.00*61.00±6.00*75.00±9.00△#OI（P/mmHg）533.00±39.00 312.00±25.00*337.00±41.00*465.00±27.00△#Ratio of W/D 3.82±0.41 6.35±0.28*6.47±0.52*4.56±0.65△#

2.2 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平與假手術組比較，模型組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組和agomir陰性對照組比較，miR-146b agomir組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

2.3 各組大鼠肺組織病理形態表現假手術組大鼠肺組織無明顯損傷。模型組和agomir陰性對照組大鼠肺組織結構損壞，肺泡腔出血，肺泡壁增厚，嗜中性粒細胞聚集，紅細胞滲出。與模型組和agomir陰性對照組比較，miR-146b agomir組大鼠的肺損傷情況得到明顯緩解。見圖1。

2.4 各組大鼠肺組織中miR-146b和ICAM-1 mRNA和蛋白表達水平與假手術組比較，模型組大鼠肺組織中miR-146b表達水平明顯降低（P＜0.01），ICAM-1 mRNA和蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組和agomir陰性對照組比較，miR-146b agomir組大鼠肺組織中miR-146b表達水平明顯升高（P＜0.05），ICAM-1 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.01）。見圖2～4。

表2 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平Tab.2 IL-1β,IL-6,and T NF-αlevels in BALF of rats in various groups [n=5，±s,ρB/(ng·L?1）]

表2 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平Tab.2 IL-1β,IL-6,and T NF-αlevels in BALF of rats in various groups [n=5，±s,ρB/(ng·L?1）]

*P＜0.01 compared with sham operation group；△P＜0.01 compared with model group；#P＜0.05，##P＜0.01 compared with agomir negative control group.

Group Sham operation Model Agomir negative control MiR-146b agomir IL-1β 35.06±7.54 71.32±8.43*71.60±6.11*50.08±5.29△##IL-6 41.28±4.92 63.07±5.88*62.84±6.01*53.93±5.14△#TNF-α 60.12±6.83 113.58±10.20*109.64±11.36*81.05±7.55△##

圖1 各組大鼠肺組織病理形態表現（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of lung tissue of rats in various groups（HE，×200）

圖2 各組大鼠肺組織中miR-146b和ICAM-1 mRNA表達水平Fig.2 Expression levels of miR-146b and ICAM-1 mRNA in lung tissue of rats in various groups

2.5 miR-146b和ICAM-1的靶向關系根據Targetscan預測的miR-146b-3p與ICAM-1基因3′-UTR區的靶向結合位點，采用雙熒光素酶基因報告系統驗證。在轉染了WT-ICAM-1的HEK-293T細胞中，與mimic NC組比較，miR-146b mimic組HEK-293T細胞中的相對熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01）；而在轉染了MUT-ICAM-1的HEK-293T細胞中，與mimic NC組比較，miR-146b mimic組HEK-293T細胞中的相對熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05）。見圖5和6。

3 討 論

ARDS是一種多因素疾病，能引起危重患者呼吸衰竭，是急性肺損傷的嚴重表現［9-10］。ARDS可由肺直接或間接損傷引起，包括敗血癥、肺炎、胃內容物吸入和嚴重創傷［1］。肺損傷主要由中性粒細胞依賴性損傷肺內皮和上皮細胞屏障引起，以肺水腫、嚴重通氣障礙和肺部炎癥為特征［11］。研究［12］顯示：在脂多糖誘導的ARDS大鼠中，脂多糖誘發的炎癥反應能破壞肺泡腔的上皮細胞和內皮細胞，引起血管內液體滲漏至肺泡腔，誘發肺水腫，導致肺泡與血管之間的氣體交換障礙，最終導致呼吸衰竭。本研究結果表明：與假手術組大鼠比較，尾靜脈注射油酸誘導的ARDS大鼠動脈血PaO2和OI均明顯降低，肺組織W/D比值、BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高，并且肺組織結構損壞，肺泡壁增厚，大量紅細胞滲漏，說明ARDS大鼠模型構建成功。

圖3 各組大鼠肺組織中ICAM-1蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of ICAM-1 protein in lung tissue of rats in various groups

圖4 各組大鼠肺組織中ICAM-1蛋白表達水平Fig.4 Expression levels of ICAM-1 protein in lung tissue of rats in various groups

圖5 miR-146b-3p與ICAM-1基因3′-UTR區的靶向結合位點Fig.5 Targeted binding sites of miR-146b-3p and 3′-UTR region of ICAM-1 gene

圖6 轉染WT-ICAM-1和MUT-ICAM-1的HEK-293T細胞中相對熒光素酶活性Fig.6 Relative luciferase activities of HEK-293T cells after transfected with WT-ICAM-1 and MUTICAM-1

miR-146b是miR-146家族的一員，位于人類染色體10q24.32上。研究［13-15］顯示：miR-146b高度參與炎癥調節。miR-146b在膿毒癥ARDS患者中異常低表達，且是獨立預測ARDS的危險性的關鍵因子，可作為膿毒癥ARDS預防和預后判斷的潛在生物標志物［16］。miR-146b-3p過表達通過抑制PI3K/AKT信號通路降低ARDS小鼠炎癥反應，改善膿毒癥小鼠ARDS［17］。本研究結果顯示：在油酸誘導的ARDS大鼠中，miR-146b異常低表達，miR-146b過表達后，ARDS大鼠的肺損傷情況減輕，BALF中炎癥因子水平均明顯降低，說明miR-146b對油酸誘導的ARDS大鼠也具有肺保護作用，提示miR-146b可能通過抑制炎癥反應緩解油酸誘導的ARDS肺損傷，但其分子機制尚不清楚。

ICAM-1是一種細胞表面糖蛋白，在中性粒細胞流入肺組織的過程中起重要調控作用。在TNF-α的刺激下，ICAM-1基因敲除小鼠肺血管通透性和中性粒細胞計數均降低70%以上［18］。此外，阻斷肺組織中ICAM-1的表達可以通過減少中性粒細胞、降低微血管通透性，進而減輕飲食低膽堿/乙硫氨酸誘導的胰腺炎肺損傷［19］。ICAM-1在肝切除術后的肝再生過程中可誘導促炎因子IL-6和TNF-α的產生［20］，上述研究表明：ICAM-1高度參與機體炎癥因子的調控，并與炎癥因子誘導的肺損傷有關。另外，抑制ICAM-1有助于保護肺微血管內皮屏障對抗LPS誘導的ARDS［21］，表明ICAM-1也是一種用于評估ARDS嚴重程度和預后的生物標志物。本研究結果顯示：ARDS大鼠肺組織中ICAM-1 mRNA和蛋白表達水平明顯升高，經miR-146b過表達干預后，ARDS大鼠肺組織中ICAM-1表達水平明顯降低。關于miR-146b和ICAM-1的研究［7］顯示：抑制miR-146表達能明顯促進炎癥因子誘導的人臍靜脈內皮細胞ICAM-1蛋白表達，說明在炎癥條件下，miR-146與ICAM-1的表達呈負相關關系。為了驗證兩者的作用關系，本研究采用雙熒光素酶基因報告系統驗證了miR-146b能靶向負調控ICAM-1基因，說明miR-146b可能通過靶向負調控ICAM-1的表達，進而有效緩解ARDS大鼠肺損傷。

綜上所述，miR-146b過表達可通過靶向下調ICAM-1的表達抑制炎癥因子的表達水平，減輕ARDS大鼠肺損傷，本研究結果初步闡明miR-146b/ICAM-1信號轉導可能是ARDS肺損傷進展過程中的重要途徑之一。后續將進一步研究miR-146b/ICAM-1與上下游關鍵因子之間的相互作用，以充分闡明miR-146b/ICAM-1在ARDS中的具體作用機制。