異鉤藤堿上調miR-192-5p對TNF-α誘導的人支氣管上皮細胞凋亡和炎癥因子釋放的作用及其機制

侯從嶺,蘆曉帆,雷小婷,李 彬,趙潤楊

（河南省中醫院肺病科，河南 鄭州450002）

慢性阻塞性肺疾病 （chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是由肺實質變性和炎癥引發的氣道阻塞引起的，其發病時常伴有趨化因子、細胞因子和生長因子等炎癥介質的釋放［1-2］。近年來，研究［3-5］顯示：微小RNAs（microRNAs，miRNAs）在多種與炎癥相關疾病中發揮重要作用，其中miR-192-5p在類風濕性關節炎、骨關節炎和哮喘等疾病中異常表達。異鉤藤堿（isorhynchophylline，IRN）是從茜草科植物鉤藤中提取的一種四環羥吲哚生物堿，具有抗氧化和抗炎活性［6-8］，用于治療心血管系統和中樞神經系統方面的疾病，如高血壓、頭痛、腦卒中和血管性癡呆等［9］。研究［10］顯示：IRN通過抑制氣道平滑肌細胞的增殖和促炎細胞因子的產生發揮抗哮喘作用。但IRN對COPD中人支氣管上皮細胞的作用及其具體機制尚不清楚。本研究探討IRN對腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導的人支氣管上皮細胞的凋亡和炎性反應的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人支氣管上皮16HBE細胞和HEK-293T細胞購于上海拜力生物。IRN購于上海純優生物，TNF-α購于美國阿拉丁公司，miR-192-5p模 擬 物（miR-192-5p mimic）、miR-192-5p抑制物（miR-192-5p inhibitor）及各自陰性對照（NC mimic和NC inhibitor）以及CXCR5過表達載體（pcDNA 3.1-CXCR5）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DMEM高糖培養基和胎牛血清購于美國Sigma公司，Lipofectamine?2000和TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司，TaqMan MicroRNA反轉錄試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific公司，SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購于美國Applied Biosystems公司，CCK-8試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司，ELISA試劑盒購于英國Abcam公司，TaKaRa反轉錄試劑盒、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、Cleaved-Caspase3、p38、p-p38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、核 因 子κB p65（nuclear factor kappa-B p65，NF-κB p65）、p-NF-κB p65、C-X-C趨化因子受體5（C-X-C motif chemokine receptor 5，CXCR5）以及β-actin抗體購于大連TaKaRa生物科技公司，二抗購于上海生工生物，AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡試劑盒購于上海凱基生物。細胞培養箱購于美國Thermo Forma公司，多功能酶標儀購于德國PerkinElmer公司，低溫高速離心機購于德國Sigma公司，流式細胞儀購于美國Beckman公司，實時熒光定量PCR（Real-time，fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀購于美國Applied Biosystem公司。

1.2 16HBE細胞培養和分組將16HBE細胞置于含10%胎牛血清DMEM高糖完全培養基中，并在條件為37℃、5%CO2的培養箱中培養。當細胞達到75%融合時，將細胞隨機分組。在探討IRN對細胞毒性實驗中，采用0（對照組）、2.5、5.0、10.0、20.0、30.0或40.0μmol·L－1IRN處 理16HBE細胞24 h，采用20μmol·L－1IRN分別處理6、12、24、48和72 h。在確定IRN的最佳濃度實驗中，采用0（對照組）、2.5、5.0、10.0、20.0和30.0μmol·L－1IRN處理16HBE細胞24 h，然后從中選擇對細胞活性影響較小的濃度處理16HBE細胞用于探討IRN對細胞凋亡和炎性因子釋放的實驗，該實驗分為對照組、TNF-α組（20 mg·L－1，18 h）、IRN組（20μmol·L－1IRN，24 h）、TNF-α+IRN組（20 mg·L－1TNF-α和20μmol·L－1IRN）、TNF-α+IRN+miR-192-5p inhibitor組（20 mg·L－1TNF-α、20μmol·L－1IRN和50 nmol·L－1miR-192-5p inhibitor）和TNF-α+IRN+pcDNA 3.1 CXCR5組［20 mg·L－1TNF-α、20μmol·L－1IRN和2μmol·L－1pcDNA 3.1-C-X-C趨化因子受體5（CXCR5）］，其中TNF-α+IRN+miR-192-5p inhibitor組和TNF-α+IRN+pcDNA 3.1 CXCR5組中16HBE細胞先用miR-192-5p inhibitor或pcDNA 3.1 CXCR5轉染24 h后，再以TNF-α和IRN處理。

1.3 細胞轉染轉染前將16HBE細胞以5×105/孔的密度接種至6孔板中。當細胞生長至70%融合時，按照說明書的要求利用Lipofectamine?2000分別將miR-192-5p mimic（50 nmol·L－1）、miR-192-5p inhibitor（50 nmol·L－1）、pcDNA 3.1-CXCR5（2μmol·L－1）以及各自的陰性對照轉染至細胞。轉染24 h后收集細胞用于后續實驗。

1.4 RT-qPCR法檢測16HBE細胞中miR-192-5p和CXCR5 mRNA水平實驗分為對照組、NC inhibitor組、miR-192-5p inhibitor組、TNF-α組、TNF-α+IRN+NC inhibitor組、TNF-α+INR組和TNF-α+IRN+miR-192-5p inhibitor組。采用TRIzol試劑提取各組16HBE細胞中總RNA。為了檢測miR-192-5p表達，采用TaqMan MicroRNA反轉錄試劑盒合成cDNA，并用SYBR Green PCR Master Mix進行PCR擴增。為了檢測CXCR5 mRNA表達水平，采用TaKaRa反轉錄試劑盒進行反轉錄，并采用SYBR Green PCR Master Mix擴增反轉錄后的產物。采用PCR儀按照以下參數進行擴增：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40個循環，70℃延伸30 s。U6和GAPDH分別作為miRNA和mRNA的內參基因，采用2－ΔΔCt法計算miR-192-5p和CXCR5 mRNA表達水平。ΔΔCt=（實驗樣品Ct－內參基因Ct）－（基準樣品Ct－內參基因Ct）。

1.5 CCK-8法檢測各組16HBE細胞活性采用CCK-8法檢測各組細胞活性。將處理后的16HBE細胞（1×104個細胞/孔）接種于96孔板中，將終濃度為20μmol·L－1、10%的CCK-8試劑添加到每孔中，在37℃下孵育4 h后，棄去培養液。最后于酶標儀450 nm處檢測各孔吸光度（A）值，計算細胞活性。細胞活性=［實驗組A值－空白組A值］/［對照組A值－空白組A值］×100%。

1.6 Western blotting法檢測各組16HBE細胞中CXCR5、Bcl-2、Caspase3、Cleaved-C aspase3、p-p38、p-JNK、p-c-Jun和p-NF-κB p65蛋白表達水平收集各組16HBE細胞，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，在冰上裂解30 min后，離心并收集上清液，提取細胞總蛋白，然后使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取25μg/孔蛋白通過10%的SDS-PAGE凝膠電泳進行分離，然后轉移至PVDF膜上（電壓100 V，電流230 mA，時間2 h）。隨后將膜與5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h后，與一抗［IL-1β（1︰800）、MCP-1（1︰1 000）、Bcl-2（1︰1 000）、Cleaved-Caspase3（1︰1 000）、p-38（1︰1 000）、p-p38（1：1 000）、p-JNK（1︰1 000）、p-p-JNK（1︰1 000）、c-Jun（1︰1 000）、p-c-Jun（1︰1 000）、NF-κB p65（1︰1 000）、p-NF-κB p65（1︰1 000）、CXCR5（1︰1 000）以及GAPDH（1︰1 000）］4℃下孵育過夜；采用TBST洗膜3次后，在室溫下與二抗孵育2 h。最后，采用ECL化學發光劑盒進行染色，并用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目標蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比值表示目標蛋白表達水平。

1.7 酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測各組細胞上清液中IL-1β和MCP-1水平 收集處理后的各組16HBE細胞上清液，并根據IL-1β和MCP-1 ELISA試劑盒的說明書檢測各組細胞上清液中IL-1β及MCP-1水平。

1.8 流式細胞術檢測16HBE細胞凋亡率將處理后繼續培養48 h的16HBE細胞懸浮于300μL 1×Binding buffer緩沖液中，同時加入5μL AnnexinⅤ-FITC和5μL PI溶液混合均勻，并在室溫下避光靜置15 min后，采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡率。細胞凋亡率=（早期凋亡細胞數+晚期凋亡細胞數）/細胞總數×100%。

1.9 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-192-5p和CXCR5間的靶向調控關系利用在線生物信息學工具（http：//www.targetscan.org/）獲得miR-192-5p與CXCR5的結合位點。將含有miR-192-5p結合位點的野生型（wild type，WT）和突變型（mutant，MUT）CXCR5 3′-UTR克隆至pGL3載體中，獲得WT-CXCR5和MUT-CXCR5熒光素酶報告質粒。隨后，采用Lipofectamine?2000將上述質粒與miR-192-5p mimic（miR-192-5p mimic組）或NC mimic（NC mimic組）共轉染至HEK-293T細胞。轉染48 h后檢測HEK-293T細胞中熒光素酶活性。將上述質粒轉染至16HBE細胞中，檢測各組細胞中miR-192-5p和CXCR5 mRNA表達水平（參考“1.4”步驟）和CXCR5蛋白表達水平（參考“1.6”步驟）。

1.10 統計學分析采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析。細胞中熒光素酶活性，各組細胞活性，細胞凋亡率，細胞中miR-192-5p、CXCR5、Bcl-2、Cleaved-Caspase3、p-NF-κB p65、p-p38、p-JNK和p-c-Jun蛋白表達水平，細胞上清液中IL-1β和MCP-1水平均以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組16HBE細胞活性與對照組比較，隨著IRN處理濃度和處理時間的增加，IRN對16HBE細胞無明顯的時間或劑量依賴性毒性作用，見圖1A和B。與對照組比較，TNF-α組16HBE細胞活性明顯降低（P＜0.05）；與TNF-α組比較，隨著IRN濃度增加，不同濃度IRN組細胞活性以劑量依賴性方式增加（P＜0.05），見圖1C。

圖1 各組16HBE細胞活性Fig.1 Viabilities of 16HEB cells in various groups

2.2各組16HBE細胞中miR-192-5p表達水平與NC inhibitor組比較，miR-192-5p inhibitor組16HBE細胞中miR-192-5p表達水平明顯降低（P＜0.05），見圖2。分別用TNF-α和IRN處理16HBE細胞。與對照組比較，TNF-α組16HBE細胞中miR-192-5p表達水平明顯降低（P＜0.05）；與TNF-α組比較，TNF-α+IRN組16HBE細胞中miR-192-5p表 達水平升高（P＜0.05）；與TNF-α+IRN+NC inhibitor組比較，TNF-α+IRN+miR-192-5p inhibitor組16HBE細胞中miR-192-5p表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

圖2 RT-qPCR法檢測各組16HBE細胞中miR-192-5p表達水平Fig.2 Expression levels of miR-192-5p in 16HBE cells in various groups detected by RT-qPCR method

圖3 TNF-α和IRN處理后各組16HBE細胞中miR-192-5p表達水平Fig.3 Expression levels of miR-192-5p in 16HBE cells in various groups after treated with TNF-αand IRN

2.3 TNF-α和IRN處理后各組16HBE細胞活性與對照組比較，TNF-α組16HBE細胞活力明顯降低（P＜0.05）；與TNF-α組比較，TNF-α+IRN組16HBE細胞活性明顯升高（P＜0.05）；與TNF-α+IRN+NC inhibitor組比較，TNF-α+IRN+miR-192-5p inhibitor組16HBE細胞活性降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 TNF-α和IRN處理后各組16HBE細胞活性Fig.4 Viabilities of 16HBE cells in various groups after treated with TNF-αand IRN

2.4 各組16HBE細胞中IL-1β和MCP-1蛋白表達水平及細胞上清液中IL-1β和MCP-1水平與對照組比較，TNF-α組16HBE細胞中IL-1β和MCP-1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），細胞上清液中IL-1β和MCP-1水平明顯升高（P＜0.05）；與TNF-α組比較，TNF-α+IRN組16HBE細胞中IL-1β和MCP-1蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），細胞上清液中IL-1β和MCP-1水平明顯降低（P＜0.05）；與TNF-α+IRN+NC inhibitor組比較，TNF-α+IRN+miR-192-5p inhibitor組16HBE細胞中IL-1β和MCP-1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），細胞上清液中IL-1β和MCP-1水平升高（P＜0.05）。見圖5、圖6和表1。

圖5 Western blotting法檢測各組16HBE細胞中IL-1β和MCP-1蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of IL-1βand MCP-1 proteins in 16HBE cells in various groups detected by Western blotting method

2.5 各組16HBE細胞中Bcl-2、Caspase-3和Cleaved-C aspase-3蛋白表達水平與對照組比較，TNF-α組16HBE細胞中Bcl-2蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）、Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與TNF-α組比較，TNF-α+IRN組16HBE細胞中Bcl-2蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與TNF-α+IRN+NC inhibitor組比較，TNF-α+IRN+miR-192-5p inhibitor組16HBE細胞中Bcl-2蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。見圖7和8。

圖6 各組16HBE細胞中IL-1β和MCP-1蛋白表達水平Fig.6 Expression levels of IL-1βand MCP-1 proteins in 16HBE cells in various groups

表1 ELISA法檢測各組16HBE細胞上清液中IL-1β和MCP-1水平Tab.1 Levels of IL-1βand MCP-1 in supernatant of 16HBE cells in various groups detected by ELISA method[n=3，±s，ρB/（ng·L-1）］

表1 ELISA法檢測各組16HBE細胞上清液中IL-1β和MCP-1水平Tab.1 Levels of IL-1βand MCP-1 in supernatant of 16HBE cells in various groups detected by ELISA method[n=3，±s，ρB/（ng·L-1）］

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs TNF-αgroup；#P＜0.05 vs TNF-α+IRN+NC inhibitor group.

Group Control TNF-α TNF-α+IRN TNF-α+IRN+NC inhibitor TNF-α+IRN+miR-192-5p inhibitor IL-1β 48.21±3.24 510.40±19.32*173.20±13.90△171.91±10.81 365.62±18.53#MCP-1 65.34±5.11 482.80±24.87*125.60±15.32△127.35±12.20 299.58±24.21#

圖7 Western blotting法檢測各組16HBE細胞中Bcl-2和Cleaved-Caspase-3蛋白表達電泳圖Fig.7 Electrophoregram of expressions of Bcl-2 and Cleaved-Caspase-3 proteins in 16HBE cells in various groups detected by Western blotting method

圖8 各組16HBE細胞中Bcl-2和Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平Fig.8 Expression levelsof Bcl-2and Cleaved-Caspase-3 proteins in 16HBE cells in various groups

2.6 各組16HBE細胞中p38、p-p38、JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達水平與對照組比較，TNF-α組16HBE細胞中p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-c-Jun/Jun和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高（P＜0.05）；與TNF-α組比較，TNF-α+IRN組16HBE細胞中p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-c-Jun/Jun和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值降低（P＜0.05）。與TNF-α+IRN+NC inhibitor組比較，TNF-α+IRN+miR-192-5p inhibitor組16HBE細胞中p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-c-Jun/Jun和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高（P＜0.05）。見圖9和表2。

圖9 Western blotting法檢測各組16HBE細胞中p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-c-Jun和c-Jun、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表達電泳圖Fig.9 Electrophoregram of expressions of p-p38,p38,p-JNK,JNK,p-c-Jun,c-Jun,p-NF-κB p65,and NF-κB p65 proteins in 16HBE cells in various groups detected by Western blotting method

2.7 各組16HBE細胞凋亡率與對照組比較，TNF-α組16HBE細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與TNF-α組比較，TNF-α+IRN組16HBE細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）；與TNF-α+IRN+NC inhibitor組比較，TNF-α+IRN+miR-192-5p inhibitor組16HBE細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖10和11。

2.8 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-192-5p和CXCR5間的靶向調控作用利用生物信息學預測工具預測CXCR5與miR-192-5p的結合位點見圖12。與NC mimic組比較，miR-192-5p mimic組中含有野生型CXCR5結合位點（WT-CXCR5）的熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而突變型CXCR5（MUT-CXCR5）的熒光素酶活性則無明顯差異（P＞0.05），見 圖13。與NC mimic組 比 較，miR-192-5p mimic組16HBE細胞中miR-192-5p mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05），見圖14。與NC mimic組比較，miR-192-5p mimic組16HBE細胞中CXCR5 mRNA和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與NC inhibitor組比較，miR-192-5p inhibitor組16HBE細胞中CXCR5 mRNA和蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。見圖15～17。

2.9 各組16HBE細胞活性、細胞凋亡率、細胞中CXCR5蛋白表達水平以及細胞上清液中IL-1β和MCP-1水平與pcDNA 3.1組（0.99±0.09）比較，pcDNA 3.1 CXCR5組16HBE細胞中CXCR5蛋白表達水平（2.10±0.11）明顯升高（P＜0.05），見圖18。轉染pcDNA 3.1 CXCR5后，分別采用TNF-α和IRN處理16HBE細胞：與對照組比較，TNF-α組16HBE細胞中CXCR5蛋白表達水平（1.00±0.03 vs 2.70±0.10）明顯升高（P＜0.05）（圖19），細胞活性（100.0%±50.0%vs 52.0%±4.0%）明顯降低（P＜0.05），細胞凋亡率（6.1%±0.3%vs19.0%±0.3%）明顯升高（P＜0.05）（圖20），細胞上清液中IL-1β和MCP-1水平明顯升高（P＜0.05）（表3）。與TNF-α組比較，TNF-α+IRN組16HBE細胞中CXCR5蛋白表達水平（2.70±0.01 vs 1.60±0.11）明顯降低（P＜0.05）（圖19），細 胞 活 性（52.0%±4.0%vs 85.0%±3.0%）明顯升高（P＜0.05），細胞凋亡率（19.0%±0.3%vs 11.5%±0.5%）明顯降低（P＜0.05）（圖20）；細胞上清液中IL-1β和MCP-1水平明顯降低（P＜0.05）（表3）。與TNF-α+IRN+pcDNA 3.1組比較，TNF-α+IRN+pcDNA 3.1 CXCR5組16HBE細胞中CXCR5蛋白表達水平（1.10±0.10 vs2.20±0.03）明顯升高（P＜0.05）（圖19），細胞活性（87.0%±4.0%vs 68.0%±3.0%）明顯降低（P＜0.05），細胞凋亡率（11.0%±0.5%vs 16.0%±0.7%）明 顯 升 高（P＜0.05）（圖20），細胞上清液中IL-1β和MCP-1水平明顯升高（P＜0.05）（表3）。

表2 各組16HBE細胞中p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值Tab.2 Ratios of p-p38/-p38,p-JNK/JNK,p-c-Jun/c-Jun,and p-NF-κB p65/NF-κB p65 in 16HBE cells in various groups（n=3，±s）

表2 各組16HBE細胞中p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值Tab.2 Ratios of p-p38/-p38,p-JNK/JNK,p-c-Jun/c-Jun,and p-NF-κB p65/NF-κB p65 in 16HBE cells in various groups（n=3，±s）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs TNF-αgroup；#P＜0.05 vs TNF-α+IRN+NC inhibitor group.

Group Control TNF-α TNF-α+IRN TNF-α+IRN+NC inhibitor TNF-α+IRN+miR-192-5p inhibitor p-p38/p38 1.00±0.09 3.51±0.15*2.38±0.12△2.35±0.07 3.14±0.07#p-JNK/JNK 1.00±0.05 2.64±0.10*1.59±0.16△1.65±0.11 2.29±0.06#p-c-Jun/c-Jun 1.00±0.06 2.23±0.08*1.24±0.03△1.21±0.06 1.56±0.09#p?NF?κB p65/NF?κB p65 1.00±0.06 2.41±0.18*1.54±0.14△1.49±0.09 1.97±0.02#

圖10 流式細胞術檢測各組16HBE細胞凋亡率Fig.10 Apoptotic rates of 16HBE cells in various groups detected by flow cytometry

圖11 各組16HBE細胞凋亡率Fig.11 Apoptotic rates of 16HBE cells in various groups

圖12 miR-192-5p與CXCR5結合位點和靶向結合Fig.12 Binding sites and targeted binding of miR-192-5p and CXCR5

圖13 雙熒光素酶報告基因實驗檢測2組HEK-293T細胞中熒光素酶活性Fig.13 Luciferase activities in HEK-293T cells in two groups detected by dual luciferase reporter gene assay

3 討 論

COPD是一種慢性氣道炎癥性疾病，近年來針對COPD疾病的中醫藥治療手段也在不斷發展。LI等［1］研究表明：熊果酸可通過抑制炎性細胞因子的釋放和氧化應激反應減弱PM 2.5誘導的COPD，天麻素對LPS誘導的MCR-5細胞炎性損傷具有保護作用［11］。IRN作為中藥鉤藤的主要有效成分之一，是一種生物堿，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用。本研究采用體外實驗證實了IRN對TNF-α誘導的16HBE細胞炎癥因子釋放和細胞凋亡有一定的抑制作用。IRN不僅可以有效抑制TNF-α處理后16HBE細胞中IL-1β和MCP-1促炎因子的釋放，提高其細胞活性，而且可降低細胞凋亡率。IRN還可通過抑制氣道平滑肌細胞的增殖和促炎細胞因子的產生而發揮其抗哮喘作用［12-13］，以及通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎性小體發揮其抗炎和抗氧化作用，從而減緩小鼠急性肺損傷［14］。此外，IRN可通過抑制氧化應激和凋亡保護大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞免受β-淀粉樣蛋白神經毒性的影響［15］。

圖14 RT-qPCR法檢測各組16HBE細胞中miR-192-5p表達水平Fig.14 Expression levels of miR-192-5p in 16 HBE cells in various groups detected by RT-qPCR method

圖15 RT-qPCR法檢測各組16HBE細胞中CXCR5 mRNA水平Fig.15 Expression levels of CXCR5 mRNA in 16HBE cells in various groups detected by RT-qPCR method

圖16 Western blotting法檢測各組16HBE細胞中CXCR5蛋白表達電泳圖Fig.16 Electrophoregram of expressions of CXCR5 protein in 16HBE cells in various groups detected by Western blotting method

圖17 各組16HBE細胞中CXCR5蛋白表達水平Fig.17 Expression levels of CXCR5 protein in 16HBE cells in various groups

圖18 Western blotting法檢測各組16HBE細胞中CXCR5蛋白表達電泳圖Fig.18 Electrophoregram of expressions of CXCR5 protein in 16HBE cells in various groups detected by Western blotting method

有研究［3］顯示：miR-192-5p通過發揮其抗炎作用緩解疾病的發展。YAMAMOTO等［16］報道miR-192-5p在哮喘組患者中的表達明顯較健康對照組低；LOU等［17］發現：在哮喘小鼠中miR-192-5p表達明顯下調，并通過降低IL-4、IL-5和IL-13等炎癥因子的分泌減輕哮喘小鼠的炎癥。本實驗結果顯示：TNF-α組16HBE細胞中miR-192-5p水平較對照組降低，同時細胞中IL-1β和MCP-1水平明顯升高。在16HBE細胞中轉染miR-192-5p inhibitor可明顯降低IRN對IL-1β和MCP-1釋放的抑制作用，進一步表明miR-192-5p的下調可能通過調節炎癥反應參與呼吸道相關疾病的發生。miRNAs可作為中藥活性成分治療疾病的靶點。天麻素通過上調miR-103降低LPS誘導MRC-5細胞凋亡及MCP-1、IL-6和TNF-α的釋放［11］。IRN可提高miR-200a的水平，降低哮喘模型小鼠減少肺組織膠原沉積，抑制IgE和促炎細胞因子的產生［12］。有研究［18-19］顯示：IRN可提高神經系統中miR-192表達水平。本研究結果顯示：IRN可明顯增加TNF-α誘導的16HBE細胞中miR-192-5p表達，并減少炎癥因子的分泌同時抑制細胞凋亡。

圖19 Western blotting法檢測各組16HBE細胞中CXCR5蛋白表達電泳圖Fig.19 Electrophoregram of expressions of CXCR5 protein in 16HBE cells in various groups detected by Western blotting method

表3 ELISA法檢測各組16HBE細胞上清液中IL-1β和MCP-1水平Tab.3 Levels of IL-1βand MCP-1 in supernatant of 16HBE cells in various groups detected by ELISA method[n=3，±s，ρB/（ng·L－1）］

表3 ELISA法檢測各組16HBE細胞上清液中IL-1β和MCP-1水平Tab.3 Levels of IL-1βand MCP-1 in supernatant of 16HBE cells in various groups detected by ELISA method[n=3，±s，ρB/（ng·L－1）］

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs TNF-αgroup；#P＜0.05 vs pcDNA 3.1 group.

Group Control TNF-α TNF-α+IRN TNF-α+IRN+pcDNA 3.1 TNF-α+IRN+pcDNA 3.1 CXCR5 IL-1β 52.17±3.53 497.15±14.89*154.32±13.24△150.62±11.35 267.35±16.55#MCP-1 70.68±5.08 511.57±27.24*182.11±15.68△179.00±12.28 290.85±24.49#

miRNAs通過對靶基因的調控參與氣道炎癥發生，ZHANG等［19］研究表明：在哮喘患者中miR-221-3p表達下調，并通過靶向CXCL 17降低氣道嗜酸性粒細胞炎癥；microRNA Let-7f-1-3p通過靶向FOXO1減輕煙氣誘導的支氣管和肺泡上皮細胞凋亡［20］。本研究結果顯示：miR-192-5p通過靶向抑制CXCR5的表達減少16HBE細胞凋亡和炎癥因子的釋放，與ZHANG等［21］報道的上調miR-192-5p可調節CXCR5改善兒童哮喘的結果相符。

COPD發生發展的機制與多種信號轉導通路有關，其中MAPK中p38和JNK通路與細胞凋亡有關，另外NF-κB通路與細胞炎癥反應密切相關。研究［22］表明：IRN通過阻斷LPS誘導的小膠質細胞中JNK、p38 MAPKs和NF-κB信號通路激活發揮抗炎作用。此外，有研究［23-24］顯示：CXCR5參與調節MAPK和NF-κB通路的激活。本實驗結果顯示：IRN可明顯抑制TNF-α誘導的16HBE細胞中p-p38、p-JNK和p-NF-κB p65蛋白表達水平升高，提示IRN在COPD的氣道炎癥中發揮的抗炎和抗凋亡作用可能與MAPK和NF-κB通路相關蛋白表達的改變有關，但這一機制需要通過實驗進一步驗證。

圖20 流式細胞術檢測各組16HBE細胞凋亡率Fig.20 Apoptotic rates of 16HBE cells in various groups detected by flow cytometry

綜上所述，IRN能促進呼吸道上皮細胞中miR-192-5p表達，減輕氣道炎癥中炎癥因子的釋放，抑制呼吸道上皮細胞的凋亡，從而緩解COPD患者的氣道炎癥。