敲低著絲粒蛋白U對順鉑耐藥卵巢癌細胞自我更新、順鉑耐藥和Wnt/β-catenin信號活性的抑制作用

任英俊,張 慧,周 穎

（鄭州大學附屬鄭州中心醫院婦產科，河南 鄭州450007）

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是最常見的女性生殖系統惡性腫瘤中的最致命的惡性腫瘤，其死亡率位于女性生殖系統腫瘤的首位［1］。OC的治療一般采用腫瘤切除術后輔以鉑類/紫杉醇雙聯體進行劑量密集的化療［2］，盡管這種治療方式使得OC的部分緩解率超過80%和完全緩解率高達60%［3］；但約有70%的OC患者會在治療2～3年內復發且90%的復發患者會對鉑類藥物產生化療耐藥［4］。目前，關于OC患者化療獲得性耐藥的機制尚未完全闡明，而尋找并干預OC細胞獲得性耐藥的關鍵驅動分子，可能會為制訂逆轉OC化療耐藥的策略提供參考。本課題組前期研究［5］顯示：著絲粒蛋白U（centromere protein U，CENPU）在OC組織中高表達，其高表達不僅能促進OC進展還與OC的不良預后呈正相關關系。既往研究［6-8］顯示：CENPU在肺癌、乳腺癌和膀胱癌等多種惡性腫瘤組織中高表達，其能促進腫瘤的進展。另外，CENPU可在紡錘體損傷的修復中發揮重要作用［9-10］?；熕幬飳δ[瘤細胞的有絲分裂阻滯缺陷/失敗是導致化療失敗和化療耐藥的重要原因之一，提示CENPU可能在腫瘤細胞化療耐藥中發揮重要作用。目前關于CENPU在腫瘤的化療耐藥中作用的研究較少。本研究探討CENPU表達對順鉑耐藥OC細胞的順鉑敏感性的影響并分析其作用機制，以期為逆轉OC化療耐藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人OC OVCAR3和

SKOV 3細胞（中國科學院細胞庫），順鉑耐藥OC OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞（上海傳秋生物科技有限公司）。胎牛血清和青霉素/鏈霉素雙抗溶液（美國Gibco公司），DMEM培養基（美國Hycolone公司），順鉑（美國Sigma公司），CENPU短發夾RNA質粒（CENPU short hairpin RNA plasmid，shCENPU）、對照短發夾RNA質粒（control short hairpin RNA plasmid-A，shControl）、

CENPU抗體、β-連環素（β-catenin）抗體、無翅型MMTV整合位點家族成員1（wingless type MMTV integration site family member 1，Wnt1）抗體和β-肌動蛋白（β-actin）抗體（美國Santa Cruz公司），細胞計數試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8） 和 辣 根 過 氧 化 物 酶 （horseradish peroxidase，HRP）標記的抗兔或抗小鼠二抗（上海碧云天生物科技有限公司），膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素（AnnexinⅤ-fluorescein isothiocyanate，AnnexinⅤ-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術有限公司），Lipofectamine?2000試劑、TRIzol試劑和L-谷氨酰胺（美國Invitrogen公司），PrimeScript RT試劑盒（北京天根生化科技有限公司），iQTMSYBR?Green Supermix預混液（美國Bio-Rad公司），增強電化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（美國Pierce公司），細胞周期素D1（cyclinD1）抗體和c-Myc抗體（美國CST公司）。Synergy?HT多功能酶標儀（美國Bio-Tek公司），ABI 7500實時熒光定量 PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）系 統（美國Applied Biosystems公司），蛋白電泳-電轉儀（美國Bio-Rad公司），BX53顯微鏡（日本Olympus公司），CytoFLEX LX流式細胞儀（美國Beckman公司）。

1.2 細胞培養、轉染和分組OVCAR3和SKOV 3細胞以及順鉑耐藥的OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞接種于含有10%胎牛血清和100 U·mL－1青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM培養基中，并保持在37℃、5%CO2濕潤條件的細胞培養箱中培養。收集處于對數生長期的OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞，每種細胞均分為shControl組和shCENPU組，并重新接種于6孔板中，當細胞處于約80%融合時，采用Lipofectamine?2000試劑將shControl和shCENPU分別轉染至上述細胞中。

1.3 CCK-8實驗檢測2組細胞活性分別取shControl組和shCENPU組的OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞接種于96孔板（5 000個/孔），并分別采用終濃度為0（只給予等體積生理鹽水，對照組）、4、8、16、32、64和100μmol·L－1順鉑處理24 h后，每個待測孔加入10μL CCK-8試劑，繼續孵育2 h，采用多功能酶標儀檢測各孔于490 nm處的吸光度（A）值。細胞活性=不同濃度順 鉑 作 用 后 各 組A值/0μmol·L－1順鉑作用后shControl組A值×100%。

1.4 Annexin-FITC/PI染色流式細胞術檢測2組細胞凋亡率分別取shControl組和shCENPU組的OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞接種于6孔板（1×106個/孔），采用終濃度為20μmol·L－1順鉑處理24 h后收集細胞。按照Annexin-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟，分別采用Annexin-FITC和PI染液在避光條件下對細胞進行染色25 min后，采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡率。

1.5 腫瘤球形成實驗檢測2組細胞球形成率（sphere formation efficiency，SFE）分別取shControl組和shCENPU組的OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞接種于超低附著6孔板（4 000個/孔），并采用含有2%B27、20μg·L－1EGF、20μg·L－1bFGF和4 mg·L－1肝素鈉的無血清DMEM/F12培養基培養1周后，收集細胞消化后再次接種，并按上述培養基繼續培養1周。在顯微鏡下，對形成的腫瘤細胞球進行計數。SFE=形成的細胞球數/接種細胞數×100%。

1.6 RT-qPCR法檢測2組細胞中性別決定區Y框蛋白2［sex determining region Y（SRY）-related high-mobility-group（HMG）-box protein-2，Sox2］、Nanog和八聚體結合轉錄因子4（octamer-binding transcription factor-4，Oct4）mRNA表達水平采用TRIzol試劑從shControl組和shCENPU組的OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞中提取總RNA，并按照PrimeScript RT試劑盒步驟進行反轉錄合成cDNA。采用目的基因引物和cDNA按照iQTMSYBR?Green Supermix預混物說明書步驟在ABI 7500實時熒光定量PCR系統進行RT-qPCR反應。程序設定：95℃、15 min，35個循環（94℃、10 s，55℃、20 s，72℃、20 s）。引物序列：Sox2正 向 引 物 為5′-ATCACCCACAGCAAATGACA-3′，Sox2反 向 引 物 為5′-GTGCAAAGCTCCTACCGTACCACTA-3′；Nanog正 向 引 物 為5′-TTGTGGGCCTGAAGAAAACTATCC-3′，Nanog反向 引 物 為5′-CTGCGTCACACCATTGCTATTCTT-3′；Oct4正向引物為5′-GACAACAATGAGAACCTTCAGGAGA-3′，Oct4反 向 引 物 為5′-CTGGCGCCGGTTACAGAACCA-3′；GAPDH正 向 引 物 為5′-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′，GAPDH反 向 引 物 為5′-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAG-3′。以GAPDH為內部參照，采用2???Ct法計算目的基因mRNA表達水平。

1.7 Western blotting法檢測2組細胞中CENPU、Wnt1、β-catenin、cyclin D1和c-Myc蛋白表達水平采用RIPA緩沖液從shControl組和shCENPU組OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞中提取總蛋白，再采用BCA法對蛋白定量后，將等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，并在電泳結束后將蛋白經電轉移至PVDF膜。采用5%脫脂乳封閉，并在室溫下孵育1∶2 000比例的一抗（β-actin、CENPU、Wnt1、β-catenin、cyclin D1和c-Myc）2 h，洗膜后，孵育HRP標記的抗小鼠或抗兔二抗1 h。再次洗膜后，采用ECL發光檢測試劑使條帶顯像。采用Image J軟件檢測各條帶A值，然后以β-actin的A值歸一化定量。目的蛋白的表達水平=目的蛋白條帶A值/β-actin條帶A值。

1.8 統計學分析采用GraphPad Prism 6統計軟件進行統計學分析。不同細胞中CENPU蛋白表達水平，細胞活性，細胞凋亡率，SFE和細胞中Sox2、Nanog和Oct4 mRNA以及CENPU、cyclinD1、c-Myc、Wnt1和β-catenin蛋白表達水平均符合正態分布，以±s表示，組間樣本均數比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同細胞中CENPU蛋白表達水平與OVCAR3細胞（1.00±0.00）比較，OVCAR3/DDP細胞中CENPU蛋白表達水平（2.06±0.15）明顯升高（t=8.523，P＜0.05）；與SKOV 3細胞（1.00±0.00）比較，SKOV 3/DDP細胞中CENPU蛋白表達水平（3.42±0.28）明顯升高（t=12.765，P＜0.05）。見圖1。

2.2 2組細胞中CENPU蛋白表達水平與shControl組OVCAR3/DDP細 胞（1.00±0.00）比較，shCENPU組OVCAR3/DDP細胞中CENPU蛋白表達水平（0.21±0.03）明顯降低（t=10.634，P＜0.05）；與shControl組SKOV 3/DDP細胞（1.00±0.00）比較，shCENPU組SKOV 3/DDP細胞中CENPU蛋白表達水平（0.16±0.05）明顯降低（t=13.324，P＜0.05）。見圖2。

圖1 Western blotting法檢測不同細胞中CENPU蛋白表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of CENPU protein in different kinds of cells detected by Western blotting method

圖2 Western blotting法檢測2組細胞中CENPU蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of CENPU protein in cells in two groups detected by Western blotting method

2.3 2組細胞活性和細胞凋亡率經8～100μmol·L－1順鉑作用后，與shControl組比較，shCENPU組OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞活性均明顯降低（P＜0.05），見表1和2。20μmol·L－1順鉑作用后，與shControl組比較，shCENPU組OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05），見表3和圖3。

表1 2組OVCAR3/DDP細胞活性Tab.1 Cell viabilities of OVCAR3/DDP cells in two groups (n=4,±s,η/%)

表1 2組OVCAR3/DDP細胞活性Tab.1 Cell viabilities of OVCAR3/DDP cells in two groups (n=4,±s,η/%)

*P＜0.05 vs shControl group.

Group shControl shCENPU Cell viability after treated with DDP[c B/(μmol·L－1)]0 100.00±5.67 95.02±9.64 4 96.04±12.38 90.58±9.89 8 94.15±13.42 65.07±8.64*16 91.23±11.25 52.48±7.65*32 85.54±9.86 41.65±5.38*64 68.26±5.45 25.24±3.25*100 45.37±6.53 15.13±3.59*

2.4 2組細胞的SFE和細胞中Sox2、Nanog及Oct4 mRNA表達水平與shControl組比較，shCENPU組OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞的SFE和細胞中自我更新相關基因Sox2、Nanog和Oct4 mRNA表達水平均明顯降低（P＜0.05）。見表4。

2.5 2組 細 胞 中cyclinD1、c-Myc、Wnt1和β-catenin蛋白表達水平與shControl組比較，shCENPU組OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞中cyclinD1、c-Myc、Wnt1和β-catenin蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）。見圖4和表5。

表2 2組SKOV 3/DDP細胞活性Tab.2 Cell viabilities of SKOV 3/DDP cells in two groups (n=4,±s,η/%)

表2 2組SKOV 3/DDP細胞活性Tab.2 Cell viabilities of SKOV 3/DDP cells in two groups (n=4,±s,η/%)

*P＜0.05 vs shControl group.

Group shControl shCENPU Cell viability after treated with DDP[c B/(μmol·L－1)]0 100.00±7.89 93.38±14.56 4 99.13±11.04 93.13±8.02 8 95.26±9.83 73.26±7.02*16 92.67±10.12 51.35±11.26*32 88.54±11.04 32.73±4.54*64 62.15±8.32 18.76±3.84*100 41.21±7.02 6.89±1.23*

表3 2組OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞凋亡率Tab.3 Apoptotic rates of OVCAR3/DDP and SKOV 3/DDP cells in two groups (n=4,-±s,η/%)

表3 2組OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞凋亡率Tab.3 Apoptotic rates of OVCAR3/DDP and SKOV 3/DDP cells in two groups (n=4,-±s,η/%)

Group shControl shCENPU t P Apoptotic rate OVCAR3/DDP cells 11.25±2.38 48.56±5.31 12.454＜0.05 SKOV 3/DDP cells 8.26±2.13 53.27±6.31 16.783＜0.05

3 討論

化療獲得性耐藥不僅能制約OC化療效果，還能導致患者的預后不良［4］。干預OC獲得性耐藥的關鍵驅動分子可在很大程度上減緩甚至逆轉化療耐藥。因此，尋找影響OC獲得性耐藥的關鍵分子具有重要意義。研究［9-10］顯示：CENPU可修復外界信號（如化療藥物和紫外線等）導致的有絲分裂期的紡錘體損傷，提示CENPU可能在腫瘤化療耐藥中發揮作用。本研究結果顯示：與OC的母本細胞比較，在順鉑耐藥OC細胞中CENPU呈高表達；且敲低CENPU能提高順鉑耐藥OC細胞對順鉑的敏感性，提示敲低CENPU表達可能是潛在的逆轉順鉑耐藥OC的新策略。

圖3 流式細胞術檢測2組細胞凋亡率Fig.3 Apoptotic rates of cells in two groups detected by flow cytometry

表4 2組OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞SFE及細胞中Sox2、Nanog和Oct4 mRNA表達水平Tab.4 SFE of OVCAR3/DDP and SKOV 3/DDP cells and expression levels of Sox2,Nanog,and Oct4 mRNA in cells in two groups (n=3，-±s）

表4 2組OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞SFE及細胞中Sox2、Nanog和Oct4 mRNA表達水平Tab.4 SFE of OVCAR3/DDP and SKOV 3/DDP cells and expression levels of Sox2,Nanog,and Oct4 mRNA in cells in two groups (n=3，-±s）

Group shControl shCENPU t P OVCAR3/DDP cells SFE(η/%)12.21±2.12 4.25±0.94 8.726＜0.05 Sox2 mRNA 1.00±0.00 0.15±0.06 19.804＜0.05 Nanog mRNA 1.00±0.00 0.45±0.08 7.435＜0.05 Oct4 mRNA 1.00±0.00 0.53±0.05 6.986＜0.05 SKOV 3/DDP cells SFE(η/%)10.39±1.68 2.96±0.73 10.315＜0.05 Sox2 mRNA 1.00±0.00 0.31±0.03 9.824＜0.05 Nanog mRNA 1.00±0.00 0.21±0.05 13.265＜0.05 Oct4 mRNA 1.00±0.00 0.36±0.04 9.063＜0.05

研究［11-12］顯示：腫瘤細胞中具有一類異質性且具有自我更新能力的腫瘤細胞亞群，即腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）。CSCs是腫瘤獲得性化療耐藥產生的重要原因之一［13-14］。本研究結果顯示：敲低CENPU能抑制OC順鉑耐藥細胞的自我更新能力。因此推測敲低CENPU增強順鉑耐藥OC細胞對順鉑的敏感性可能與其抑制順鉑耐藥OC細胞中CSCs亞群中自我更新相關基因的表達有關，但具體機制仍有待進一步探索。

圖4 Western blotting法檢測2組細胞中cyclinD1、c-Myc、Wnt1和β-catenin蛋白表達電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of cyclin D1,c-Myc,Wnt1，andβ-catenin proteins in cells in two groups detected by Western blotting method

表5 2組OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞中cyclin D1、c-Myc、Wnt1和β-catenin蛋白表達水平Tab.5 Expression levels of cyclinD1,c-Myc,Wnt1，andβ-catenin proteins in OVCAR3/DDP and SKOV 3/DDP cells in two groups (n=3，-±s）

表5 2組OVCAR3/DDP和SKOV 3/DDP細胞中cyclin D1、c-Myc、Wnt1和β-catenin蛋白表達水平Tab.5 Expression levels of cyclinD1,c-Myc,Wnt1，andβ-catenin proteins in OVCAR3/DDP and SKOV 3/DDP cells in two groups (n=3，-±s）

Group shControl shCENPU t P OVCAR3/DDP cells CyclinD1 1.00±0.00 0.56±0.06 8.024＜0.05 c-Myc 1.00±0.00 0.78±0.05 5.876＜0.05 Wnt1 1.00±0.00 0.39±0.07 11.206＜0.05 β-catenin 1.00±0.00 0.36±0.04 13.425＜0.05 SKOV 3/DDP cells CyclinD1 1.00±0.00 0.45±0.02 10.115＜0.05 c-Myc 1.00±0.00 0.32±0.03 15.316＜0.05 Wnt1 1.00±0.00 0.58±0.03 9.403＜0.05 β-catenin 1.00±0.00 0.24±0.07 18.432＜0.05

異常激活的Wnt/β-catenin信號已被證明有助于腫瘤的發生、轉移、化療耐藥和復發［15］。有關OC的研究［16］顯示：在OC組織中Wnt配體上調；已有研究［17］顯示：Wnt/β-catenin信號活性增強也有助于OC細胞的化療耐藥和自我更新。上述研究提示Wnt/β-catenin信號通路在OC中發揮重要作用。外界不同刺激引起的活性Wnt配體轉運增加、cyclinD1上調和c-Myc的卷曲等均可激活Wnt/βcatenin信號［18］。本研究結果顯示：敲低CENPU能降低Wnt/β-catenin信號活性。已有研究［19］顯示：抑制Wnt/β-catenin信號活性能逆轉OC順鉑耐藥細胞的順鉑耐藥性和自我更新能力。因此，敲低CENPU對順鉑耐藥OC細胞的順鉑敏感性的增加以及自我更新能力減低的作用可能在一定程度上歸因于其可抑制Wnt/β-catenin信號活性。

綜上所述，CENPU在順鉑耐藥OC細胞中呈高表達，抑制其表達能恢復其對順鉑的敏感性并降低其自我更新能力，且這一作用可能與抑制Wnt/β-catenin信號相關。靶向抑制CENPU表達可能是逆轉OC化療耐藥患者的一種有前景的治療策略。