miR-106b靶向調(diào)控TGF-β/Smad通路對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的促進作用

馬 博,李建剛,王 俊,候軍麗,李 亮

（新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科，新疆 烏魯木齊830063）

結(jié)腸癌是人類常見惡性腫瘤，發(fā)現(xiàn)時已到晚期，預(yù)后不良，探討其發(fā)生發(fā)展機制對其診治及改善其預(yù)后具有重要價值。研究［1］顯示：表觀遺傳學(xué)在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近年來，結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及其分子機制方面的研究取得了巨大進步，微小RNA（microRNAs，miRNAs）是長度為22 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，與靶基因相互作用后調(diào)控轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后基因表達［2］。有研究［3］顯示：miR-106b可促進食管癌細(xì)胞增殖和侵襲，抑制其凋亡。有研究［4］顯示：miR-106b在乳腺癌組織中高表達，與患者臨床病理參數(shù)相關(guān)。腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移在腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中起重要作用，然而miR-106b如何調(diào)控結(jié)腸癌惡性侵襲和轉(zhuǎn)移，涉及哪些重要信號通路的機制尚未闡明。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad在惡性腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移和增殖過程中發(fā)揮重要作用，TGF-β可與Smad蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，導(dǎo)致Smad發(fā)生磷酸化，結(jié)合體進人細(xì)胞核，引起下游基因轉(zhuǎn)錄，進而產(chǎn)生一系列的生物學(xué)行為。王爽等［5］研究顯示：miR-101-3p可通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β受體1（TGF-βR1）/Smad抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲和遷移過程。研究［6］顯示：樺木酸可調(diào)控TGF-β/Smad信號通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究主要探討miR-106b對結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其與TGF-β/Smad信號通路的關(guān)系，為結(jié)腸癌的機制和靶向干預(yù)研究提供重要參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本收集選擇2018年1月—2019年4月于本院接受手術(shù)治療的30例結(jié)腸癌組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)病理明確診斷；術(shù)前3～5個月內(nèi)均未進行任何抗腫瘤治療，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不全，并發(fā)其他部位腫瘤。術(shù)中切除的癌組織和正常結(jié)直腸組織（30例，距離癌灶邊緣5 cm以上）用于后續(xù)研究。本研究征得患者或家屬同意并簽署知情同意書，并上報本院倫理委員會備案執(zhí)行。

1.2 細(xì)胞、主要試劑和儀器結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞和正常結(jié)腸上皮NCM 460細(xì)胞（美國ATCC公司）。胎牛血清和雙抗和胰蛋白酶（美國Biosciences公司），miR-106b和U 6引物、miR-106b mimics、 p GL 3、 p GL 3-TGF-βR1、 miR-NC、MUT-TGF-βR1、WT-TGF-βR1和pGL 3載體（北京博爾邁生物技術(shù)有限公司），TGF-βR1、磷酸化Smad同 源 物 2（phosphorylated Smad family member 2，p-Smad2）、磷 酸 化Smad同 源 物3（phosphorylated Smad family member 3，p-Smad3）、β-actin一抗和二抗、DMEM培養(yǎng)液及TRIzol試劑（美國Sigma公司），RNA提取試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑盒和PCR試劑盒（武漢博士德生物公司），熒光素酶檢測試劑盒（美國BioVision公司）。酶標(biāo)儀（上海儀電分析儀器有限公司），ABI 7900PCR擴增儀（上海儀電分析儀器有限公司），SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)移裝置（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司），LAS400凝膠成像系統(tǒng)（美國GE公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清、10萬U·L－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素），培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2飽和濕度，每24 h更換1次培養(yǎng)基，消化后繼續(xù)傳代，選取傳代3代的SW-480細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染。根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染物質(zhì)的不同，分為空質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染miRNC空質(zhì)粒）、miR-106b組（轉(zhuǎn)染miR-106bmimics），p GL 3-TGF-βR1組（轉(zhuǎn) 染p GL 3-TGFβR1）和miR-106b-mimics+pGL 3-TGF-βR1組（同時 轉(zhuǎn) 染miR-106b-mimics和p GL 3-TGF-βR1）。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實驗。

1.4 實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測組織和細(xì)胞中miR-106b及TGF-βR1 mRNA表達水平取結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織研磨，胰酶消化組織，離心，取上清。取對數(shù)生長期的結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞和正常結(jié)腸上皮NCM 460細(xì)胞，胰酶消化，離心。采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度，將合格的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行PCR擴增。根據(jù)反應(yīng)要求配置反應(yīng)體系：包括SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL+上下游引物10 μmol·L－1各1 μL，加水至反應(yīng)總體積為25 μL，引物序列見表1。反應(yīng)參數(shù)：94℃、20 s，95℃、2 s，60℃、20 s，72℃、6 s，共40個循環(huán)，結(jié)束后構(gòu)建熔解曲線。采用2－△△Ct法計算miR-106b和TGF-βR1 mRNA表達水平，內(nèi)參為U 6。TGF-βR1上游引物：5′?GAGGAAAGTGGCGGGGAG?3′，TGF-βR1下游引物：5′?CCAACCAGAGCTGAGTCCAAGTA?3′；miR-106b上游引物：5′?TGCGGCAACACCAGTCGATGG?3′，miR-106b下 游 引 物：5′?CCAGTGCAGGGTCCGAGG T?3′；U 6上游引物：5′-GGCTACAGCAACAGGGTG-3′，U6下游引物：5′-TTTGGTTGAGCACAGGGT-3′。

1.5 熒光素酶報告實驗將構(gòu)建好的TGF-βR1野生型或突變型序列插入至pmiR質(zhì)粒載體中，隨后重組的MUT-TGF-βR1和WT-TGF-βR1載體與miR-106b-mimic共同轉(zhuǎn)入SW-480細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后去除培養(yǎng)液。PBS洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液。4℃振蕩10 min，40℃、1 000 r·min－1離心3 min，取上清，采用GLO-MAX20/20熒光檢測儀檢測各組SW-480細(xì)胞中熒光素酶活性。

1.6 Transwell小室實驗檢測各組SW-480細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)采用預(yù)冷不含血清的培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，鋪于24孔板上室內(nèi)，紫外線殺菌，單純培養(yǎng)基孵育2 h。接種細(xì)胞于24孔板上室內(nèi)，密度為每孔6×104個，下室加入DMEM，孵育12 h，洗滌死亡懸浮細(xì)胞。4%多聚甲醛固定10 min，0.5%結(jié)晶紫染色10 min。95%乙醇4℃條件下洗滌6 h，光學(xué)顯微鏡下選取5個視野，計算侵襲細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.7 細(xì)胞劃痕實驗檢測各組SW-480細(xì)胞劃痕愈合率采用記號筆在6孔板背后以直尺均勻劃2條橫線，間隔0.5 cm，橫穿過孔。加入6×104個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。采用無菌槍頭比照直尺，垂直劃線，PBS洗滌3次，加入無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后顯微鏡下觀察。劃痕愈合率＝（0 h劃痕寬度－24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.8 Western blotting法檢測各組SW-480細(xì)胞中目的蛋白表達水平加入2 mL RIPA組織裂解液，勻漿，冰浴30 min，40℃、500 g離心5 min，吸去上層液體，超聲波破核，再次離心，取上層液體10μL待測。配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，切膜，封閉液封閉1 h，逐次加入大鼠抗人TGF-βR1（1∶1 000）、p-Smad2（1∶1 000）、p-Smad3（1∶1 000）、β-actin單克隆抗體（1∶1 000）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000）。Bio-Rad成像儀曝光成像，Image Lab Software測定灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各種組織和細(xì)胞中miR-106b與TGF-βR1 mRNA表達水平，各組細(xì)胞劃痕愈合率和細(xì)胞遷移數(shù)，SW-480細(xì)胞中熒光素酶活性、TGF-βR1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達水平符合正態(tài)分布，均以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組組織和細(xì)胞中miR-106b表達水平結(jié)腸癌組織中miR-106b表達水平（28.42±4.23）高于正常結(jié)腸組織（15.11±2.01），結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞中miR-106b表達水平（1.09±0.13）高于正常結(jié)腸上皮NCM 460細(xì)胞（0.15±0.02）（P＜0.01）。

2.2 各組SW-480細(xì)胞中TGF-βR1蛋白表達水平與空質(zhì)粒組（1.13±0.01）比較，miR-106b組SW-480細(xì) 胞 中TGF-βR1蛋 白（0.32±0.01）表達水平明顯降低，p GL 3-TGF-βR1組細(xì)胞中TGF-βR1蛋白（2.39±0.01）表達水平明顯升高（P＜0.01）。與miR-106b組 比 較，miR-106bmimics+pGL 3-TGF-βR1組SW-480細(xì)胞中TGFβR1蛋白（1.42±0.02）表達水平明顯升高（P＜0.01）。與p GL 3-TGF-βR1組 比 較，miR-106bmimics+p GL 3-TGF-βR1組細(xì)胞中TGF-βR1蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。見圖1。

2.3 miR-106b與TGF-βR1的靶向關(guān)系生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示：miR-106b與TGF-βR1存在一定的互補堿基對，見圖2。與空質(zhì)粒組比較，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-TGF-βR1載體的SW-480細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01）。見表1。

圖1 Western blotting法檢測各組細(xì)胞中TGF-βR1蛋白表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of TGF-βR1 protein in cells in various groups detected by Western blotting method

圖2 miR-106b與TGFβR1互補的核苷酸序列Fig.2 Complementary nucleotide sequences of miR-106b and TGFβR1

表1 各組細(xì)胞中雙熒光素酶活性Tab.1 Activities of double luciferase in cells in various groups (n=3，±s）

表1 各組細(xì)胞中雙熒光素酶活性Tab.1 Activities of double luciferase in cells in various groups (n=3，±s）

*P＜0.05 compared with blank vector group.

Group Blank vector miR-106b Luciferase activity WT-TGF-βR1 1.12±0.09 0.46±0.05*MUT-TGF-βR1 1.09±0.12 0.99±0.11

2.4 各組SW-480細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)miR-106b組SW-480細(xì)胞中miR-106b表達水平高于空質(zhì)粒組（P＜0.01），提示轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)研究。與空質(zhì)粒組比較，miR-106b組SW-480細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.01），p GL 3-TGF-βR1組S W-480細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.01）；與miR-106b組比較，miR-106b-mimics+p GL 3-TGF-βR1組SW-480細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.01）；與pGL3-TGF-βR1組比較，miR-106bmimics+pGL3-TGF-βR1組SW-480細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)明顯升高（P＜0.01）。見圖3和表2。

2.5 各組SW-480細(xì)胞劃痕愈合率與空質(zhì)粒組（84.2%±9.6%） 和 miR-106b-mimics+p GL 3-TGF-βR1組（91.3%±10.4%）比較，miR-106b組細(xì)胞劃痕愈合率（98.8%±11.9%）明顯升高（P＜0.01），pGL 3-TGFβR1組細(xì)胞劃痕愈合率（53.1%±6.3%）明顯降低（P＜0.01）。見圖4。

圖3 Transwell小室實驗檢測各組細(xì)胞侵襲形態(tài)表現(xiàn)（結(jié)晶紫，×200）Fig.3 Invasion morphology of cells in various groups detected by Transwell chamber assay (Crystal violet,×200)

圖4 細(xì)胞劃痕實驗檢測各組SW-480細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)（×20）Fig.4 Morphology of SW-480 cells in various groups detected by cell scratch test（×20）

表2 各組侵襲細(xì)胞數(shù)和SW-480細(xì)胞中p-Smad2及p-Smad3蛋白表達水平Tab.2 Number of invasion cells and expression levels of p-Smad2 and p-Smad3 proteins in SW-480 cells in various groups(n=3，±s）

表2 各組侵襲細(xì)胞數(shù)和SW-480細(xì)胞中p-Smad2及p-Smad3蛋白表達水平Tab.2 Number of invasion cells and expression levels of p-Smad2 and p-Smad3 proteins in SW-480 cells in various groups(n=3，±s）

*P＜0.01comparedwithblankvectorgroup；△P＜0.01comparedwithmiR-106bgroup；#P＜0.01comparedwithpGL3-TGFβR1group.

Group Blankvector miR-106b pGL3-TGF-βR1 miR-106b-mimics+pGL3-TGF-βR1 FP Numberofinvasioncells 169.2±12.3 265.4±20.3*124.8±17.6*△177.6±13.4△#24.521＜0.01 p-Smad2protein 1.22±0.01 0.30±0.01*2.63±0.02*1.51±0.06△#174.532＜0.01 p-Smad3protein 1.34±0.02 0.23±0.01*2.54±0.12*1.38±0.09△#207.348＜0.01

2.6 各組細(xì)胞中p-Smad2和p-Smad3蛋白表達水平與空質(zhì)粒組比較，miR-106b組SW-480細(xì)胞中p-Smad2和p-Smad3蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與空質(zhì)粒組比較，pGL3-TGF-βR1組SW-480細(xì)胞中p-Smad2和p-Smad3蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。與miR-106b組比較，miR-106b-mimics+pGL3-TGF-βR1組SW-480細(xì)胞中p-Smad2和p-Smad3水平明顯升高（P＜0.01）。與pGL3-TGF-βR1組比較，miR-106b-mimics+pGL3-TGFβR1組SW-480細(xì)胞中p-Smad2和p-Smad3水平明顯降低（P＜0.01）。見圖5和表2。

圖5 Western blotting法檢測各組SW-480細(xì)胞中p-Smad2和p-Smad3蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of p-Smad2 and p-Smad3 proteins in SW-480 cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性程度較高，其發(fā)病機制復(fù)雜，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控［7］。miRNAs是長度為22 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，與靶基因相互作用后調(diào)控轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后基因表達。近年來研究［8-9］顯示：多種miRNAs在結(jié)腸癌組織或患者血清中呈差異性表達。miR-106b在胃癌、卵巢癌、前列腺癌和肝癌等腫瘤組織中高表達，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等有關(guān)［10-13］。研究［14］顯示：miR-106b在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達，可以促進腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。另外研究［15］顯示：miR-106b在肝癌組織中同樣高表達，與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)。然而miR-106b與結(jié)腸癌的關(guān)系尚不清楚。本文作者采用RT-qPCR法檢測結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中miR-106b表達情況的結(jié)果顯示：在癌組織和SW-480細(xì)胞中miR-106b表達均上調(diào)，提示miR-106b可能作為促癌基因參與了結(jié)腸癌的發(fā)生。miRNAs在腫瘤增殖、侵襲和遷移中的作用已經(jīng)得到證實。miRNAs作為促癌基因，可調(diào)控細(xì)胞周期，促進細(xì)胞的增殖，激活信號通路進而促進細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果提示：過表達miR-106b可促進結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，miR-106b與結(jié)腸癌的惡性進展有關(guān)。

TGF-β/Smad信號通道是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中重要的通路之一，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移中發(fā)揮重要的作用［16］。TGF-β/Smad信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑制和促進腫瘤進展的雙重作用，在惡性腫瘤的起始階段，TGF-β/Smad信號通路可抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖、促進腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制惡性腫瘤的發(fā)展；在惡性腫瘤的晚期，TGF-β/Smad信號通路可促進腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，從而促進惡性腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移過程［17-18］。

TGF-β屬于RGF超家族，包含TGF-βR1和TGF-βR2，可引起Smads蛋白受體（Smad2和Smad3）磷酸化，進而與Smad4結(jié)合，激活下游基因。TGF-βR1作為TGF-β/Smad2/3信號通路中關(guān)鍵蛋白，被TGF-β磷酸化后可促使Smad2和Smad3發(fā)生磷酸化，放大TGF-β的信號效應(yīng)。p-Smad2/3和TGF-β1蛋白表達水平可反映TGF-β/Smad信號通路狀況，p-Smad2/3和TGF-β1蛋白表達水平升高表明TGF-β/Smad信號通路激活；反之，p-Smad2/3和TGF-β1蛋白表達水平降低 表 明TGF-β/Smad信 號 通 路 受 到 抑 制［19］。ZHU等［20］研究顯示：miR-187可通過抑制TGF-β/Smad通路引起胃癌細(xì)胞的化療藥物的抵抗。WANG等［21］研究顯示：miR-133b可靶向抑制TGFβR1蛋白通過TGF-β/Smad通路抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)化生。本研究結(jié)果顯示：過表達miR-106b可明顯降低結(jié)腸癌細(xì)胞中TGF-βR1、p-Smad2和p-Smad3的表達；上調(diào)TGF-βR1可減弱miR-106b對TGF-βR1、p-Smad2和p-Smad3表達的抑制，提示miR-106b對結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移抑制作用可能與抑制TGF-β/Smad通路有關(guān)，TGF-β可通過促進血管生成與炎癥、誘發(fā)免疫逃逸、促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種機制來促進腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，但更為詳細(xì)的機制尚需進一步研究證實。

綜上所述，miR-106b過表達可明顯抑制TGF-β/Smad通路，進而促進細(xì)胞的侵襲和遷移，為結(jié)腸癌的治療提供了新靶點，但miR-106b是否可調(diào)控腫瘤其他惡性行為，如耐藥、增殖和凋亡等尚不清楚，有待進一步研究以明確。