二甲雙胍通過PI3K/AKT/GSK 3β信號通路對肺癌A549細胞增殖的影響

穆春青,周 磊,趙 楠,王 紅,李 智

（1.錦州醫科大學附屬第一醫院轉化醫學研究院，遼寧 錦州121000；2.錦州醫科大學轉化醫學研究院，遼寧 錦州121000）

肺癌是呼吸系統常見的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌占在所有肺癌類型的80%～85%，在非小細胞肺癌患者中，肺腺癌是最常見的類型［1］。早期肺癌可采用手術治療，但大部分患者確診時已處于中晚期，失去了手術機會［2］，化療是臨床治療肺癌最常用的方法［3］。二甲雙胍是口服治療2型糖尿病的藥物，自1970年以來，DILMAN［4］發現了二甲雙胍除降糖外還有抗衰老和抗癌作用，二甲雙胍的抗腫瘤作用逐漸被發掘。回顧性分析和流行病學研究［5-7］提示：二甲雙胍降低了2型糖尿病患者發生癌癥的風險并提高了患者的生存率。有研究［8-10］顯示：二甲雙胍可抑制肺癌細胞增殖并誘導肺癌細胞凋亡。動物體內實驗［11］表明：二甲雙胍可預防肺部腫瘤的發生，并明顯抑制腫瘤在小鼠體內的生長，二甲雙胍抗肺癌的作用機制主要包括激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase，AMPK）信號通路［12］、抑制胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）信號傳導通路［13］、促進肺癌細胞凋亡［14］和抑制相關炎癥反應［15-16］等。二甲雙胍是否可以通過磷脂酰 肌 醇 -3 激 酶 （phosphoinositide-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/糖原 合 成 激 酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK 3β）信號通路發揮抗肺癌作用尚未見報道。本實驗選取肺腺癌A 549細胞作為研究對象，探討二甲雙胍對A 549細胞增殖的影響及其可能的作用機制，為二甲雙胍用于肺癌的預防或治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人肺腺癌細胞A 549

購自中國科學院上海細胞庫。10%胎牛血清購自美國Hyclone公司，DMEM培養基和胰蛋白酶購自美國Gibco公司，MTT試劑、1%青霉素-鏈霉素混合物、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、凝膠制備試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶公司，二甲雙胍購自美國Sigma公司，內參β-actin蛋白、HRP標記山羊抗兔IgG（H+L）、PI3K、 AKT、 磷 酸 化 AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）、GSK 3β、磷酸化GSK 3β（phosphorylated GSK3β，p-GSK 3β）抗體購自沈陽萬類生物公司，磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）購自上海谷研公司，PCR引物購自上海生工，結晶紫購自上海碧云天公司。酶標儀和RT-PCR儀購自美國Thermo公司，轉膜儀和凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養人肺腺癌A 549細胞采用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合物的DMEM培養基，在含5%CO2的濕潤培養箱中培養。

1.3 MTT法檢測各組肺癌A 549細胞增殖率將處于對數生長期的A 549細胞接種于96孔板中，每孔5×103個，待細胞貼壁后，將細胞分為對照組和不同濃度（1、2、4、8、16和32 mmol·L－1）二甲雙胍組，另設空白組。對照組加入DMEM完全培養基，實驗組加入含不同濃度二甲雙胍的DMEM完全培養基，空白組不加入細胞只加入DMEM完全培養基。培養24、48和72 h后，每孔加入20μL MTT溶液，37℃孵育4 h后，每孔加入150μL DMSO溶液，震蕩3 min，采用酶標儀檢測490 nm處的吸光度（A）值，計算細胞增殖率。細胞增殖率=（實驗組A值－空白組A值）/（對照組A值－空白組A值）×100%。

1.4 各組A 549細胞克隆形成數將A 549細胞接種于6孔板中，每孔500個，細胞貼壁后，將細胞分為對照組和二甲雙胍組，對照組加入2 mL DMEM完全培養基，二甲雙胍組加入2 mL分別含有2和8 mmol·L－1二甲雙胍的DMEM完全培養基，連續培養7 d后，PBS緩沖液漂洗2次，采用4%多聚甲醛固定細胞10 min，洗掉固定液，結晶紫溶液染色10 min，蒸餾水洗滌2次，將6孔板放置于白色背景下拍照，采用低倍顯微鏡記錄大于50個細胞的克隆數作為細胞克隆形成數。

1.5 細胞劃痕實驗檢測各組A 549細胞遷移率將A 549細胞接種于6孔板中，每孔1×105個細胞，細胞貼壁后，采用無菌的20μL槍頭做“1”字劃痕，PBS緩沖液洗掉劃下的細胞，對照組加入2 mL DMEM培養基，二甲雙胍組加入2 mL分別含有2和8 mmol·L－1二甲雙胍的DMEM培養基，于0和48 h采用倒置顯微鏡拍照，采用Image J軟件計算劃痕寬度。細胞遷移率=（0 h劃痕寬度－48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.6 RT-PCR法檢測各組A549細胞中PI3K、AKT和GSK3βmRNA表達水平按每孔1×105個細胞接種于6孔板中，對照組加入DMEM完全培養基，二甲雙胍組加入含有不同濃度（2和8 mmol·L－1）二甲雙胍的DMEM完全培養基，處理細胞48 h后，采用TRIzol法提取細胞總RNA，取1μg RNA逆轉錄成cDNA，采用RT試劑盒進行PCR反應，以actin為內參基因，分別檢測PI3K、AKT和GSK3β mRNA表達水平。β-actin上游引物為5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，β-actin下游引物為5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′；PI3K上游引物為5′-TCACTACCGCCA-CGAGTCTCTG-3′，PI3K下 游 引 物 為5′-ACTGCCTCCACGCTGTCCTC-3′；AKT上游引物為5′-TGACCATGAACGAGTTTGAGTA-3′，AKT下游引物為5′-GAGGATCTTCATGGC-GTAGTAG-3′；GSK3β上游 引 物 為5′-CTTCA-GGACAAGCGATTTA-3′，GSK3β下 游 引 物 為5′-CCAGCACCAGGTTAAGGTAG-3′。采用2－△△Ct法計算目標基因mRNA表達水平。

1.7 Western blotting法檢測各組A549細胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK3β和p-GSK 3β蛋白表達水平細胞接種于培養皿中，待貼壁后，對照組加入DMEM完全培養基，二甲雙胍組加入含有不同濃度（2和8 mmol·L－1）二甲雙胍的DMEM完全培養基，連續培養48 h后，采用細胞刮刀刮下細胞，離心，棄上清，PBS緩沖液洗滌2次，加入含1 mmol·L－1PMSF的RIPA裂解液，渦旋混勻，冰上裂解20 min后，14 000 g離心10 min，取上清，BCA法測量蛋白濃度，取30μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后將蛋白轉移到PVDF膜上，采用5%BSA室溫封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌PVDF膜3次，加入二抗抗體室溫孵育2 h，洗膜，ECL試劑盒顯影，凝膠成像儀拍照，采用Image J軟件分析條帶灰度值，計算目標蛋白表達水平。目標蛋白表達水平＝目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.8 統計學分析采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析。各組細胞增殖率，細胞克隆數，細胞遷移率，各組細胞中PI3K、AKT、GSK 3βmRNA和PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白表達水平均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組A 549細胞增殖率MTT實驗結果顯示：與對照組比較，不同濃度（1、2、4、8、16和32 mmol·L－1）二甲雙胍對肺癌A 549細胞均有一定的抑制作用。同一時間內隨著二甲雙胍濃度的增加，細胞增殖率降低，采用同一濃度二甲雙胍處理后，隨著作用時間的增加，細胞增殖率降低（24 h：F=7.348，P=0.001；48 h：F=250.008，P=0.000；72 h：F=447.896，P=0.000），為了得到更好的觀察效果，后續實驗選擇2和8 mmol·L－1二甲雙胍處理肺癌細胞。見表1。

2.2 各組A549細胞克隆數二甲雙胍處理肺癌A 549細胞7 d后，克隆形成實驗結果顯示：與對照組比較，2 mmol·L－1二甲雙胍組細胞克隆形成面積減小，細胞克隆數減少（P＜0.05）；8 mmol·L－1二甲雙胍組細胞克隆形成面積進一步減小，細胞克隆數進一步減少（P＜0.05）。見圖1和2。

表1 不同時間點各組A 549細胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of A 549 cells in various groups at different time points (n=3,±s,η/%)

表1 不同時間點各組A 549細胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of A 549 cells in various groups at different time points (n=3,±s,η/%)

*P＜0.05 compared with control group.

Group Control Metformin(mmol·L－1)1 2 4 8 16 32（t/d） 24 Proliferation rate of A 549 cells 100.00±0.00 96.95±1.88*91.80±1.23*87.01±8.19*84.46±1.61*81.90±6.79*79.60±1.37*48 100.00±0.00 91.09±0.41*87.87±3.46*84.13±1.06*74.79±0.41*67.20±2.00*57.04±3.77*72 100.00±0.00 91.54±4.25*81.91±1.00*76.24±0.22*60.32±2.98*52.99±2.13*22.68±0.30*

圖1 結晶紫染色觀察各組A549細胞克隆形態表現Fig.1 Clone morphology of A 549 cells in various groups detected by crystal violet staining

圖2 各組A 549細胞克隆形成數Fig.2 Clone formation number of A 549 cells in various groups

2.3 各組A 549細胞遷移率細胞劃痕實驗結果顯示：作用48 h后，與對照組比較，2和8 mmol·L－1二甲雙胍組細胞遷移率降低（P＜0.05），且8 mmol·L－1二甲雙胍組細胞遷移率低于2 mmol·L－1二甲雙胍組（P＜0.05）。見圖3和4。

2.4 各組A 549細胞中PI3K、AKT和GSK 3β mRNA表達水平RT-PCR法檢測結果顯示：與對照組比較，2和8 mmol·L－1二甲雙胍組細胞中PI3K、AKT和GSK 3βmRNA表達水平降低（P＜0.05）；與2 mmol·L－1二甲雙胍組比較，8 mmol·L－1二甲雙胍組細胞中PI3K、AKT和GSK 3βmRNA表達水平降低（P＜0.05）。見圖5。

圖3 各組A549細胞遷移情況(×100)Fig.3 Migration of A 549 cells in various groups(×100)

圖4 各組A549細胞遷移率Fig.4 Migration rates of A 549 cells in various groups

2.5各組A549細胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK 3β和p-GSK 3β蛋 白 表 達 水 平Western blotting法檢測結果顯示：與對照組比較，2和8 mmol·L－1二甲雙胍組A 549細胞中PI3K和p-PI3K蛋白表達水平均降低（P＜0.05），AKT蛋白表達水平不變，p-AKT蛋白表達水平降低（P＜0.05），GSK3β蛋白表達水平不變，p-GSK 3β蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與2 mmol·L－1二甲雙胍組比較，8 mmol·L－1二甲雙胍組A 549細胞中PI3K、p-PI3K、p-AKT和p-GSK3β蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見圖6和7。

圖5 各組A 549細胞中PI3K、AKT和GSK 3βmRNA表達水平Fig.5 Expression levels of PI3K，AKT，and GSK 3β mRNA in A549 cells in various groups

3 討 論

肺癌對人類健康造成巨大的威脅，近年來肺癌的發病率逐年上升，每年約有1 800萬人被診斷出肺癌，1 600萬人死于肺癌［2］。二甲雙胍作為2型糖尿病患者的一線用藥，具有安全廉價的優點，全世界超過1.2億的糖尿病患者使用二甲雙胍降低血糖［17］，研究［18］顯示：二甲雙胍能抑制多種腫瘤細胞增殖，并且二甲雙胍對肺癌也有一定療效［19］，本實驗采用二甲雙胍處理肺癌細胞后，細胞增殖受到抑制，細胞克隆數形成數減少。腫瘤細胞發生轉移是癌癥治療的難點，控制肺癌細胞轉移成為治療肺癌的有效方法［20］，有研究［21］顯示：二甲雙胍可通過上調microRNA-7的表達抑制肺癌A 549細胞遷移和侵襲。本實驗采用2和8 mmol·L－1二甲雙胍處理肺癌A 549細胞后，細胞遷移率均明顯降低。

PI3K/AKT/GSK 3β細胞信號通路在信號傳導過程中發揮重要的作用，并與體內多種腫瘤細胞的增殖、分化、遷移和凋亡過程等有關［22］。有研究［23-24］顯示：抑制PI3K/AKT信號通路可抑制肺癌細胞增殖，PI3K是由p85亞基和p110亞基構成的異源二聚體，當細胞受到外界刺激后PI3K被激活，隨后PI3K催化生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸 （phosphoinositide-3-kinase，PIP3），PIP3與AKT結合并使其磷酸化，GSK3β是真核細胞內可溶性的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，處于PI3K／AKT細胞信號傳導通路下游，活化的AKT會導致GSK 3β蛋白N端的第9位絲氨酸磷酸化，促進下游的β連環蛋白去磷酸化，去磷酸化β連環蛋白進入細胞核從而促進細胞增殖。有研究［25］顯示：抑制PI3K/AKT/GSK 3β信號通路可抑制肺腺癌A 549細胞的侵襲和遷移。也有研究［26］顯示：二甲雙胍可通過抑制PI3K/AKT/GSK3β通路抑制人結腸癌HT 29細胞增殖。本研究分別采用RT-PCR和Western blotting法檢測肺癌A 549細胞中PI3K、AKT、GSK3βmRNA和PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK 3β和p-GSK 3β蛋白表達水平，結果顯示：二甲雙胍處理肺癌細胞后，細胞中PI3K、AKT和GSK3βmRNA表達水平降低，PI3K、p-PI3K、p-AKT及p-GSK 3β蛋白表達水平降低，提示二甲雙胍處理肺癌細胞后，可抑制細胞中PI3K活化，導致PIP3減少，磷酸化的AKT隨之減少，導致GSK 3β蛋白N端的第9位絲氨酸的磷酸化受到抑制，因此細胞增殖受到抑制。

圖6 Western blotting法檢測各組A547細胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK3β和p-GSK 3β蛋白表達電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expressions of PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT,GSK3β,and p-GSK 3βproteins in A 547 cells in various groups detected by Western blotting method

圖7 各組A547細胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK 3β和p-GSK3β蛋白表達水平Fig.7 Expression levels of PI3K,p-PI3K, AKT,p-AKT,GSK 3β,and p-GSK 3βproteins in A 547 cells in various groups

綜上所述，二甲雙胍可抑制肺癌A 549細胞增殖，阻止細胞發生遷移，其機制可能與PI3K/AKT/GSK3β細胞信號通路有關，本研究結論為二甲雙胍用于肺癌的預防或治療提供了實驗依據，但由于藥物的作用機制十分復雜，二甲雙胍的具體抗肺癌機制尚需進一步探討。