山茱萸多糖對難治性癲癇幼鼠行為學(xué)和海馬組織中多藥耐藥基因1b及主穹隆蛋白表達(dá)的影響

冶秀蘭,李 明,王兆建,趙海燕,馬建寧,劉 婧,鄭 怡,李順清,張 玉

（青海大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，青海 西寧810001）

癲癇是一種常見神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，患病率為4%～10%，其中難治性癲癇（refractory epilepsy，RE）占20%［1］。根據(jù)2010年國際抗癲癇聯(lián)盟［2］的定義，RE指經(jīng)合理選擇2種耐受性好的藥物治療后，癥狀未得到有效控制的癲癇。目前RE治療以藥物為主，但是易產(chǎn)生不良反應(yīng)，使治療效果不理想，因此，尋找有效治療RE的方法尤為重要［3］。山茱萸多糖是中藥山茱萸的有效成分，具有抗休克、抗腫瘤、抗衰老和抗氧化等多方面作用。研究［4］顯示：山茱萸多糖對腦損傷大鼠的行為能力具有改善作用。研究［5］顯示：RE患者往往出現(xiàn)對抗癲癇藥物耐受現(xiàn)象，多藥耐藥基因1b（multidrug resistance gene 1b，MDR1b）表達(dá)變化與RE耐藥機制密切相關(guān)。主穹窿蛋白（major vault protein，MVP）是穹隆主要蛋白成分，其過量表達(dá)參與腫瘤耐藥，可作為多藥耐藥的預(yù)測因子，有研究［6］顯示：MVP與RE存在一定關(guān)聯(lián)。目前山茱萸多糖在RE中作用的報道較少。本研究建立RE幼鼠模型，研究山茱萸多糖對RE幼鼠行為學(xué)的改善作用，并深入探討其對MDR1b和MVP的影響，闡明其對RE作用的分子機制，為RE的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、主要試劑和儀器SPF級健康雄性SD幼鼠50只，5周齡，體質(zhì)量100～150 g，購自廣東省實驗動物檢測所，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0044。實驗用幼鼠均自由進(jìn)食，保持室內(nèi)溫度為（24±1）℃，相對濕度為（55±10）%，光照條件為12 h/12 h明暗交替進(jìn)行。山茱萸多糖（粉末狀，純度≥98%，陜西扶風(fēng)斯諾特生物科技有限公司），拉莫三嗪（三金集團湖南三金制藥有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H 20050596），海人酸（kainic acid，KA）（純度≥98%，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司），腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β） 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、TRIzol試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），SYBR PremixExTaqⅡ試劑盒（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司），BCA蛋白試劑盒（上海睿時生物科技有限公司），兔 抗 大 鼠 核 因 子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、MDR1b、MVP一抗、山羊抗兔二抗（美國Abcam公司）。51800型腦立體定位儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司），SAF-680T酶標(biāo)儀（上海巴玖實業(yè)有限公司），Verti7500型實時熒光定量PCR （Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（美國ABI公司），WD-9413C凝膠成像系統(tǒng)（北京六一光學(xué)儀器廠）。

1.2 建模、分組和干預(yù)方法取40只幼鼠，參照文獻(xiàn)［7］，采用側(cè)腦室注射KA建立RE幼鼠模型：術(shù)前12 h禁食，腹腔注射3%戊巴比妥納進(jìn)行麻醉，將幼鼠頭顱固定于腦立體定位儀上，沿頭部正中線切開頭皮，取前囟為原點，以向右1.4 mm、向后0.8 mm、深度3.7 mm為注射點（右側(cè)側(cè)腦室）。骨鉆鉆開顱骨，緩慢進(jìn)針后注射KA溶液3μL，濃度0.5 g·L－1，留針5 min，之后緩慢退針，縫合皮膚。術(shù)后腹腔注射青霉素800 000 U·kg－1，每日1次，連續(xù)1周，預(yù)防感染。注射KA溶液后，于上午8：00～10：00，采用Racine法［8］觀察幼鼠驚厥的發(fā)作等級（無驚厥為0級，口和面部出現(xiàn)肌肉陣攣為Ⅰ級，Ⅰ級基礎(chǔ)上出現(xiàn)節(jié)律點頭為Ⅱ級，Ⅱ級基礎(chǔ)上出現(xiàn)前肢陣攣為Ⅲ級，Ⅲ級基礎(chǔ)上出現(xiàn)后肢伸直為Ⅳ級，Ⅳ級基礎(chǔ)上出現(xiàn)跌倒為Ⅴ級），持續(xù)觀察1周，1周內(nèi)若觀察到幼鼠超過5次達(dá)到Ⅱ級以上驚厥，表示造模成功。造模成功的37只幼鼠隨機分為模型組8只、低劑量山茱萸多糖組9只、高劑量山茱萸多糖組10只和陽性對照組10只。另取10只幼鼠作為假手術(shù)組。低劑量山茱萸多糖組和高劑量山茱萸多糖組幼鼠分別給予0.14和0.56 g·kg－1山茱萸多糖（溶于2 mL生理鹽水）灌胃，陽性對照組幼鼠給予154 mg·kg－1拉莫三嗪（溶于2 mL生理鹽水）灌胃，假手術(shù)組和模型組幼鼠給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)14 d。

1.3 視頻錄像觀察各組幼鼠癲癇發(fā)作行為采用苦味酸對幼鼠進(jìn)行標(biāo)記，給藥后每天8：00～20：00進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測至給藥結(jié)束，記錄各組幼鼠癲癇發(fā)作總次數(shù)和總持續(xù)時間。

1.4 ELISA法測定各組幼鼠血清中TNF-α和IL-1β水平行為學(xué)能力檢測完畢后，采集幼鼠尾部靜脈血2 mL，離心取上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，終止反應(yīng)后，使用酶標(biāo)儀讀取每個樣品吸光度（A）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)樣品TNF-α和IL-1β水平。

1.5 HE染色觀察各組幼鼠海馬組織病理形態(tài)表現(xiàn)采血完畢，斷頭處死，取大腦，分離海馬組織，一部分置于40%中性甲醛中固定，另一部分置于－80℃冰箱中保存。取40%中性甲醛中固定的海馬組織，進(jìn)行常規(guī)脫水，浸蠟包埋，冠狀切片，切片厚度約為4μm，脫蠟，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組幼鼠海馬組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.6 RT-qPCR法檢測海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP mRNA表達(dá)水平取－80℃保存的海馬組織，TRIzol試劑盒提取組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA。之后參照SYBR PremixExTaqⅡ試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系，并采用PCR儀進(jìn)行擴增反應(yīng)，設(shè)定擴增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性35 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，設(shè)置循環(huán)35次；72℃終末延伸10 min。采用GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2－△△CT法計算各組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP mRNA表達(dá)水平。引物序列見表1。

1.7 Western blotting法檢測各組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP蛋白相對表達(dá)水平取－80℃保存的海馬組織，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，加熱變性，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，每孔上樣20μL，100 V電泳2 h，300 mA電流轉(zhuǎn)膜3 h。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜置5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBS洗滌3次，加入1∶1 000稀釋的NF-κB、MDR1b和MVP一抗稀釋液，4℃搖床過夜，PBS洗滌3次，后加入1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗稀釋液，室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像，以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

表1 NF-κB、MDR1b和MVP引物序列Tab.1 Primer sequences of NF-κB,MDR1b，and MVP

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Shapiro-Wilk檢驗分析數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，各組幼鼠癲癇發(fā)作總次數(shù)、總持續(xù)時間，血清中TNF-α和IL-1β水平及海馬組織中NF-κB、MDR1b、MVP mRNA和蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組幼鼠癲癇發(fā)作行為與假手術(shù)組比較，模型組幼鼠癲癇發(fā)作總次數(shù)和總持續(xù)時間增加（P＜0.05）；與模型組比較，低和高劑量山茱萸多糖組及陽性對照組幼鼠癲癇發(fā)作總次數(shù)和總持續(xù)時間降低（P＜0.05）；與低劑量山茱萸多糖組比較，高劑量山茱萸多糖組和陽性對照組幼鼠癲癇發(fā)作總次數(shù)和總持續(xù)時間降低（P＜0.05）；高劑量山茱萸多糖組和陽性對照組幼鼠癲癇發(fā)作總次數(shù)和總持續(xù)時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組幼鼠癲癇發(fā)作總次數(shù)和總持續(xù)時間Tab.2 Total number of attacks and duration of pups of young rats in various groups (±s）

表2 各組幼鼠癲癇發(fā)作總次數(shù)和總持續(xù)時間Tab.2 Total number of attacks and duration of pups of young rats in various groups (±s）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of Cornus officinalis polysaccharide group.

Group Sham operation Model Cornusofficinalis polysaccharide Low dose High dose Positive control FP n 10 8 9 10 10 Total number of attack 0.00±0.00 50.12±7.25*36.23±5.89△17.65±2.12△#18.12±2.18△#191.259＜0.01 T otal duration of seizure(t/min)0.00±0.00 258.31±35.12*89.31±12.65△#180.16±20.31△84.31±11.25△#253.780＜0.01

2.2 各組幼鼠血清中TNF-α和IL-1β水平與假手術(shù)組比較，模型組幼鼠血清中TNF-α和IL-1β水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，低和高劑量山茱萸多糖組及陽性對照組幼鼠血清中TNF-α和IL-1β水平降低（P＜0.05）；與低劑量山茱萸多糖組比較，高劑量山茱萸多糖組和陽性對照組幼鼠血清中TNF-α和IL-1β水平降低（P＜0.05）；高劑量山茱萸多糖組和陽性對照組幼鼠血清中TNF-α和IL-1β水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.3 各組幼鼠海馬組織CA 1區(qū)病理形態(tài)表現(xiàn)假手術(shù)組幼鼠海馬組織CA 1區(qū)細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)完整，邊界清晰，未見細(xì)胞核固縮，胞質(zhì)呈淡紅色；模型組幼鼠海馬組織CA 1區(qū)細(xì)胞排列紊亂，大量細(xì)胞呈空泡樣變，可見大量核破裂，核固縮；低和高劑量山茱萸多糖組及陽性對照組幼鼠海馬組織CA 1區(qū)細(xì)胞排列較為整齊，細(xì)胞輪廓較清晰，可見少量空泡變性、核破裂和核固縮。見圖1。

2.4 各組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP m RNA表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，模型組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，低和高劑量山茱萸多糖組及陽性對照組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與低劑量山茱萸多糖組比較，高劑量山茱萸多糖組和陽性對照組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；高劑量山茱萸多糖組和陽性對照組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP mRNA表達(dá)水平組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表3 各組幼鼠血清中TNF-α、IL-1β水平Tab.3 Levels of TNF-αand IL-1βin serum of young rats in various groups [±s,ρβ/(g·L?1)]

表3 各組幼鼠血清中TNF-α、IL-1β水平Tab.3 Levels of TNF-αand IL-1βin serum of young rats in various groups [±s,ρβ/(g·L?1)]

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of Cornus officinalis polysaccharide group.

Group Sham operation Model Cornusofficinalis polysaccharide Low dose High dose Positive control FP n 10 8 9 10 10 TNF-α 100.36±12.03 231.45±25.44*196.32±21.45△151.16±16.21△#150.35±17.12△#64.884＜0.01 IL-1β 75.21±9.21 135.26±15.13*113.44±14.12△94.35±11.10△#92.16±10.25△#32.541＜0.01

圖1 各組幼鼠海馬組織CA 1區(qū)病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of CA 1 area of hippocampus tissue of young rats in various groups(HE,×200)

2.5 各組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，模型組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量山茱萸多糖組、高劑量山茱萸多糖組和陽性對照組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與低劑量山茱萸多糖組比較，高劑量山茱萸多糖組和陽性對照組幼鼠海馬組織中NFκB、MDR1b和MVP蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；高劑量山茱萸多糖組和陽性對照組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP蛋白表達(dá)水平組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2和表5。

表4 各組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP mRNA表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of NF-κB,MDR1b,and MVP mRNA in hippocampus tissue of young rats in various groups (±s）

表4 各組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP mRNA表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of NF-κB,MDR1b,and MVP mRNA in hippocampus tissue of young rats in various groups (±s）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of Cornus officinalis polysaccharide group.

Group Sham operation Model Cornusofficinalispolysaccharide Low dose High dose Positive control FP n 10 8 9 10 10 NF-κB 0.18±0.02 0.51±0.07*0.40±0.05△0.29±0.04△#0.28±0.04△#68.666＜0.01 MDR1b 0.11±0.03 0.45±0.05*0.33±0.07△0.21±0.04△#0.22±0.04△#67.035＜0.01 MVP 0.13±0.02 0.49±0.06*0.37±0.07△0.25±0.03△#0.26±0.04△#76.411＜0.01

3 討論

癲癇是慢性腦部疾病，其特征是大腦神經(jīng)元過度放電導(dǎo)致的短暫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，常反復(fù)發(fā)作［9］。近年來，隨著抗癲癇手術(shù)和藥物的普及，大部分患者能通過手術(shù)和藥物治療控制癥狀，但是仍有約30%的患者癥狀并無改善，而發(fā)展為RE［10］。由于RE的發(fā)病機制尚不清楚，且目前尚無有效治療手段，故亟需尋找該病有效治療方式以減輕患者癥狀。近年來，山茱萸多糖成為臨床研究熱點之一，其具有抗腫瘤、降壓及改善認(rèn)知功能等作用，對于阿爾茨海默病和癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有明顯治療作用［11-12］。因此，研究山茱萸多糖在RE治療中的作用有重要意義。

圖2 Western blottting法檢測各組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of NF-κB,MDR1b and MVP proteins in hippocampus tissue of young rats in various groups

TNF-α和IL-1β是機體炎癥反應(yīng)主要因子，其水平異常升高可增加機體神經(jīng)損傷程度，從而影響行為學(xué)能力［13］。研究［14］顯示：山茱萸提取物能通過降低機體炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。王福興［15］研究表明：山茱萸提取物能通過減輕機體炎癥反應(yīng)，減緩糖尿病大鼠發(fā)病進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，各劑量山茱萸多糖組幼鼠癲癇發(fā)作總次數(shù)和持續(xù)總時間減少，血清中TNF-α和IL-1β水平降低；HE染色結(jié)果顯示：各劑量山茱萸多糖組幼鼠海馬組織CA 1區(qū)細(xì)胞排列較為整齊，細(xì)胞輪廓較清晰，可見少量空泡變性、核破裂和核固縮，提示山茱萸多糖可減輕炎癥反應(yīng)，減少海馬組織損傷，改善幼鼠癲癇發(fā)作情況。

表5 各組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP蛋白表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of NF-κB,MDR1b,and MVP proteins in hippocampus tissue of young rats in various groups (±s）

表5 各組幼鼠海馬組織中NF-κB、MDR1b和MVP蛋白表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of NF-κB,MDR1b,and MVP proteins in hippocampus tissue of young rats in various groups (±s）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of Cornus officinalis polysaccharide group.

Group Sham operation Model Cornusofficinalis polysaccharide Low dose High dose Positive control FP n 10 8 9 10 10 NF-κB 0.15±0.03 0.49±0.06*0.38±0.05△0.24±0.03△#0.22±0.04△#91.720＜0.01 MDR1b 0.09±0.01 0.43±0.07*0.31±0.06△0.18±0.04△#0.17±0.03△#76.949＜0.01 MVP 0.10±0.02 0.47±0.05*0.35±0.06△0.22±0.03△#0.21±0.05△#94.265＜0.01

本研究結(jié)果顯示：模型組幼鼠海馬組織中MDR1b和MVP呈高表達(dá)，同時癲癇發(fā)作總次數(shù)較多和持續(xù)總時間較長，提示MDR1b和MVP高表達(dá)可能是引起RE的重要原因之一。NF-κB是一種有多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的蛋白質(zhì)因子，在腦部疾病發(fā)展進(jìn)程中起調(diào)控作用［16］。MDR1b表達(dá)受NF-κB信號通路調(diào)控，且在MDR1b基因啟動區(qū)存在NF-κB作用位點［17］。NF-κB活化能促進(jìn)MVP表達(dá)，且參與TNF-α和IL-1β等多種炎癥因子的表達(dá)，而炎癥反應(yīng)也會促進(jìn)NF-κB活化，進(jìn)而促進(jìn)多藥耐藥基因表達(dá)，形成惡性循環(huán)［18-19］。抑制NF-κB信號通路可降低耐藥基因的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善耐藥癲癇大鼠的發(fā)作情況［20］。另有研究［21］顯示：阻斷NF-κB信號通路可抑制MDR1b表達(dá)，逆轉(zhuǎn)RE的耐藥作用。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，各劑量山茱萸多糖組幼鼠海馬組織中MDR1b和MVP mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，提示山茱萸多糖治療RE可能與下調(diào)MDR1b、MVP mRNA和蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，山茱萸多糖可減輕炎癥反應(yīng)和海馬組織損傷程度，改善RE幼鼠癲癇發(fā)作情況，其作用機制可能與抑制MDR1b及MVP表達(dá)有關(guān)。未來應(yīng)研究山茱萸多糖是否存在其他調(diào)控機制，為臨床治療RE提供參考。