MCM 10沉默對乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用及其機制

鞏 培,劉竟然,趙世敏,王玉珍,謝基明

（1.內蒙古農業大學生命科學學院生物制藥工程系，內蒙古 呼和浩特010108；2.內蒙古自治區人民醫院檢驗科，內蒙古 呼和浩特010020）

微小染色體維持蛋白（mini-chromosome maintenance protein，MCM）是近年來發現的一組反映細胞增殖的標志物。MCM包括MCM 2～10這9種進化高度保守的家族蛋白，是DNA復制過程中的通行證，控制細胞周期從G1期向S期進展［1-2］。MCM只在處于增殖活動周期的細胞中表達，其不表達意味著細胞退出增殖周期成為成熟細胞或細胞進入G0期［3］。MCM在惡性腫瘤中高水平表達，是細胞增殖活性的新指標，對于腫瘤的早期診斷和預后有重要意義［4］。研究［5］顯示：MCM 2在惡性乳腺組織中高表達，該標記物的診斷意義優于腫瘤增殖標記物Ki67。MCM 2、MCM 4、MCM 5、MCM 6、MCM 7和MCM 10在宮頸組織中高水平表達，且MCM 4、MCM 6和MCM 10的表達水平與腫瘤進展呈正相關關系［6-7］。MCM 2、MCM 4、MCM 8和MCM 10的過表達與胰腺癌的不良預后有關［8］。最新的研究［9］顯示：MCM 10在DNA復制的延伸和維持基因組穩定性方面均發揮不可或缺的作用，且MCM 10的高表達水平與尿道上皮細胞癌的進展和預后呈強相關關系。但MCM 10在乳腺癌細胞的病理生理過程中的作用目前尚無相關報道。本研究采用慢病毒干擾MCM 10，探討MCM 10干擾對乳腺癌MDA-MB-23細胞的增殖和凋亡的影響及其機制，為乳腺癌的靶向治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人乳腺癌細胞MDAMB-231購自美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。DMEM培養基購自美國Invitrogen公司，Ausbian胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自上海威正翔禹生物科技有限公司，BCA試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天生物有限公司，慢病毒GV 115載體購自上海吉凱基因化學技術有限公司，Anti-Flag和anti-GAPDH均購自美國Santa Cruz公司，TRIzol試劑盒購自上海普飛公司，M-MLV反轉錄試劑盒、dNTP、RNase抑制劑均購自北京Promega公司，SYBR Master Mixture購自日本TaKaRa公司，Caspase3/7活性檢測試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。倒置顯微鏡（型號CKX41）購自日本奧林巴斯公司，熒光顯微鏡（型號Ts2FL）購自日本尼康公司，細胞培養箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司，流式細胞儀（型號FACSCanto kgtnkgnⅡ）購自美國BD公司。

1.2 細胞培養MDA-MB-231細胞采用L-15培養基培養。培養基中血清含量為10%。MDA-MB-231細胞隔天換液，細胞生長至80%～90%融合時，采用含EDTA的PBS平衡鹽溶液漂洗后采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，置于37℃恒溫、5%CO2的培養箱中培養。

1.3 慢病毒載體介導的MCM 10沉默 將處于對數生長期的MDA-MB-231細胞采用胰酶消化，完全培養基制成（3～5）×104mL－1細胞懸液接種2 mL于6孔細胞培養板，培養24 h后，采用感染復數（multiplicity of infection，MOI）為10的慢病毒感染MDA-MB-231細胞干擾MCM 10，培養12 h后，采用完全培養液代替病毒感染液繼續培養48 h。慢病毒載體上的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因表達率達到90%時，收集細胞進行后續的MCM 10干擾效率驗證。根據靶向干擾MCM 10的序列不同分為MCM 10干擾組1（shMCM 10-1）、MCM 10干擾組2（shMCM 10-2）和對照組。shMCM 10-1干擾的靶基 因 序 列 為5′-ATCCTCAGAAGGTCTTAAT-3′， hMCM 10-2干 擾 的 靶 基 因 序 列 為5′-CGGCGACGGTGAATCTTAT-3′，對照組細胞、感染陰性對照病毒。

1.4 實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測MDA-MB-231細胞中MCM 10 mRNA表達水平采用TRIzol試劑盒對慢病毒感染的乳腺癌MDA-MB-231細胞進行裂解和總RNA提取。取2μg總RNA和2μL反轉錄引物，根據M-MLV試劑盒說明進行反轉錄，合成cDNA，RT-qPCR法擴增目的基因和內參基因。MCM 10上游引物：5′-GAAGAAGGTTACGCCACAGAG-3′；MCM 10下游引物：5′-TTTACAGGTTCCCAGGTCAAG-3′。采 用2－△△Ct法 分析各組測得的目的基因MCM 10以及內參基因GAPDH的Ct值。以與對照組相比來計算實驗組MDA-MB-231細胞中MCM 10 mRNA表達水平。

1.5 Western blotting法檢測各組MDA-MB-231細胞中MCM 10標簽蛋白Flag表達水平收集對數生長期的目的細胞，提取總蛋白，采用BCA試劑盒檢測MDA-MB-231細胞中蛋白的表達水平。取50μg蛋白樣品按比例加入上樣緩沖液，沸水浴5 min，冷卻離心后行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（twelve sodium sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），采用濕轉法120 V、90 min將蛋白質電轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，再以磷酸鹽緩沖液和吐溫20（TBST）溶解的5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h。PCDF膜與一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，次日用TBST洗滌3次（每次10 min），后室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10 000）2 h，TBST洗滌3次（每次10 min）后檢測PVDF膜上MCM 10標簽蛋白Flag的表達水平。Flag蛋白表達水平=Flag蛋白條帶灰度值/內參β-action條帶灰度值。

1.6 Cellomics法檢測各組MDA-MB-231細胞增殖情況采用Cellomics細胞計數儀檢測細胞增殖率。Cellomics細胞計數儀能在保持細胞結構和功能完整性的前提下，檢測細胞形態、生長和遷移情況，可以對細胞進行追蹤分析，設定參數后，可以單獨對GFP陽性細胞進行分析。采用慢病毒感染細胞后，不可避免的因素是由于感染效率的不同造成的差異。采用非標記的明亮視野細胞成像特征，可以對GFP陽性的細胞進行計數，從而排除轉染效率造成的檢驗誤差。采用Cellomics細胞計數儀自動計數細胞生長不同時間的細胞數，計算細胞相對增殖倍數。

1.7 流式細胞術檢測各組MDA-MB-231細胞凋亡率慢病毒感染MDA-MB-231細胞5 d后，收集消化離心的MDA-MB-231細胞，經過細胞的洗滌、重懸和Annexin-V-APC染色，采用流式細胞儀于488 nm處檢測吸光度（A）值，以A值代表各組凋亡細胞數，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.8 Caspase3/7活性檢測試劑盒檢測各組MDAMB-231細胞中Caspase3/7活性試劑盒基于Caspase3/7可以催化底物Ac-DEVD-pNA產生黃色的p NA（P-nitroaniline），通過檢測熒光強度來計算Caspase3/7活性。根據檢測試劑盒說明書，96孔細胞培養板每孔加入100μL Caspase3/7檢測緩沖液，室溫避光孵育2 h，于490 nm激發波長、525 nm發射波長下檢測各孔熒光強度。Caspase3/7活性=處理組熒光強度值—空白對照組熒光強度值。

1.9 統計學分析采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析。各組MDA-MB-231細胞中MCM 10 mRNA表達水平、細胞凋亡率和MDA-MB-231細胞中Caspase3/7活性符合正態分布且方差齊，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組MDA-MB-231細胞中MCM 10 mRNA表達水平和細胞中目標蛋白表達水平采用GenBank中人MCM 10的基因序列信息設計干擾序列。干擾Oligo序列合成、退火和酶切后與慢病毒載體GV 115相連，經過轉化后挑出陽性克隆測序，測序正確的質粒進行病毒包裝。感染目的細胞MDAMB-231。采用熒光顯微鏡觀察病毒感染情況（圖1）。提取各組細胞總RNA以及總蛋白，RT-qPCR法檢測各組MDA-MB-231細胞中MCM 10 mRNA表達水平，Western blotting法檢測各組MDA-MB-231細胞中Flag表達水平。與對照組比較，shMCM 10-1組MDA-MB-231細胞中MCM 10 mRNA表達水平降低約70%（P＜0.01），shMCM 10-2組MDA-MB-231細胞中MCM 10 mRNA的表達水平降低84%（P＜0.01）（圖2）。慢病毒載體GV 115攜帶Flag標簽，干擾序列插入后抑制了Flag的表達，即shMCM 10-1和shMCM 10-2組無標簽蛋白Flag表達，Western blotting法檢測結果證實了該結論，在蛋白水平未檢測到MCM 10表達（圖3）。

圖1 各組MDA-MB-231細胞中慢病毒感染情況Fig.1 Lentivirus infection in MDA-MB-231 cells in various groups

圖3 Western blotting法檢測各組MDA-MB-231細胞中Flag蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expression of Flag protein in MDA-MB-231 cells in various groups detected by Western blotting method

2.2 MCM 10干擾后各組MDA-MB-231細胞增殖情況 經shRNA慢病毒感染3 d后，細胞鋪于96孔細胞培養板，鋪板細胞數為每孔2 000個細胞。Cellomics連續監測5 d，細胞增殖形態表現見圖4。

與對照組比較，shMCM 10-1組和shMCM 10-2組MDA-MB-231細胞計數和相對增殖倍數明顯降低（P＜0.01）。見圖5。

圖4 感染慢病毒后MDA-MB231細胞的增殖形態表現(Bar=200μm)Fig.4 Proliferation morphology of MDA-MB 231 cells after lenti-virus infection(Bar=200μm)

圖5 MDA-MB-231細胞感染MCM 10干擾慢病毒和對照后各組細胞計數（A）及相對增殖倍數（B）Fig.5 Cell count(A)and relative proliferation multiples(B)of MDA-MB231 cells in various groups after sh MCM 10 and control lentivirus infection

2.3 MCM 10干擾后各組MDA-MB-231細胞凋亡率和細胞中Caspase3/7活性shRNA慢病毒感染5 d后，采用流式細胞術檢測各組凋亡細胞的熒光強度，結果見圖6。與對照組比較，shMCM 10-1組和shMCM 10-2組MDA-MB-231細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），細胞中Caspase3/7活性升高（P＜0.01）。見圖7和8。

圖6 各組MDA-MB-231細胞中凋亡細胞的熒光強度Fig.6 Fluorescence intensities of apoptotic cells in MDA-MB-231 cells in various groups

圖7 各組MDA-MB-231細胞的凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of MDA-MB-231 cells in various groups

3 討 論

圖8 各組MDA-MB-231細胞中Caspase3/7活性Fig.8 Activities of Caspase 3/7 in MDA-MB-231 cells in various groups

乳腺癌是威脅女性健康最主要的疾病之一，占女性惡性腫瘤的22%。隨著社會發展、經濟增長以及生活工作環境的變化，全球范圍內乳腺癌的患病率在近10年來升高了近10倍［10］。我國乳腺癌患病率每年以3%～4%的速率在增長，發病趨于年輕化并且城市患病率明顯高于農村［11］。傳統的乳腺癌治療仍以手術為主，包括化療、放療和內分泌治療在內的綜合治療方案［12］。近年來，隨著對乳腺癌細胞生長、增殖和凋亡機制的深入研究，靶向治療成為繼傳統治療模式后又一全新的治療方法，是目前腫瘤研究最活躍的領域［13］。在乳腺癌的靶向治療中，最成功的是基于高表達人表皮生長因子受體2（human epidermal growth receptor-2，Her-2）開發出來的曲妥珠單抗Herceptin，其可以有效降低腫瘤的復發率［14］。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一種特殊類型的乳腺癌，占所有乳腺癌種類的15%～20%，該類型腫瘤體積大，具有惡性程度高、易轉移和預后差等特點。TNBC不表達Her-2，因此對于以Her-2為靶標的治療無效［15］。所以化療仍然是TNBC的主要治療方法，但僅有不到20%的TNBC患者對化療有效［16-17］。尋找TNBC新的有效治療靶點是解決這一問題的關鍵。

有研究［18］表明：MCM 10高表達與乳腺癌患者的生存時間呈負相關關系，但是與乳腺癌的分型的關系未知。ABDUS等［19］采用疾病數據庫發現：MCM 2可作為乳腺癌的預后標志物，但目前缺乏MCM 10的基礎數據。本研究［20］結果顯示：乳腺癌Rab7基因敲除后，MDA-MB-231細胞中MCM 10基因的表達率降低，該結果提示MCM 10可能在乳腺癌發生發展中發揮作用。采用TCGA數據庫分析結果顯示：MCM 10在乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。本研究采用慢病毒對TNBC的MDA-MB-231細胞中MCM 10進行干擾，采用RT-qPCR和Western blotting法驗證干擾效率的結果表明：與shMCM 10-1組比較，shMCM 10-2組MDA-MB-231細胞中MCM 10的干擾效率較高。采用Cellomics細胞計數儀檢測各組細胞增殖情況的結果表明：與對照組比較，shMCM 10-1組和shMCM 10-2組MDA-MB-231細胞的生長速率受到明顯抑制。Annexin-Ⅴ-APC單染法對凋亡細胞數進行計數結果表明：與對照組比較，MCM 10干擾后MDA-MB-231細胞的凋亡率明顯升高。Caspase3是細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶，本研究采用熒光分光光度法檢測細胞MDA-MB-231細胞中Caspase3/7活性的結果表明：與對照組比較，MCM 10干擾后MDA-MB-231細胞中Caspase3/7活性升高。

綜上所述，MCM 10干擾后TNBC MDA-MB-231細胞增殖受到抑制，細胞凋亡被促進，細胞中凋亡蛋白Caspase3/7活性升高。MCM 10具有作為TNBC細胞治療靶點的巨大潛力。