骨髓間充質干細胞來源性外泌體攜帶miR-196b-5p對結腸癌細胞生物學特性的調控作用

李曉輝,瞿紫微,盧 昕,孟慶彬,陳華濤,任 駿,譚成沛

（1.湖北省武漢第一醫院胃腸外科，湖北 武漢430022；2.湖北省神農架林區中醫醫院普外科，湖北 神農架442000）

骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有高度自我更新和多向分化能力的成體干細胞，已成為組織修復和器官重建的重要種子細胞，基于MSCs的細胞治療方法已在臨床上得到了廣泛應用，但研究［1-3］顯示：干細胞移植的修復作用主要通過旁分泌方式進行。MSCs是制備外泌體的常用細胞來源之一，分泌的外泌體內富含獨特微小RNA（microRNA，miRNA）和轉移RNA（transfer RNA，tRNA），以囊泡的形式與細胞膜融合后分泌至細胞外，與靶細胞融合后將內容物釋放至靶細胞的細胞質中影響細胞信號傳導，因此外泌體常被用作藥物或肽載體來治療疾?。?-6］。研究［6-7］顯示：MSCs旁分泌在腸道內損傷和組織病變的研究中具有重要價值。外泌體包被的miRNA被認為是一種新型的生物標志物，可用于結直腸癌的診斷和預測［8］。研究［9］顯示：miR-196b-5p可調控結直腸癌細胞的轉移和侵襲。本課題組前期研究［10］顯示：攜帶miR-196b-5p的MSCs來源外泌體對結腸癌細胞的耐藥性具有一定影響。為了闡明攜帶miR-196b-5p的外泌體對結腸癌細胞生物學特性的作用，本研究分離小鼠骨髓來源的MSCs，經過miR-196b-5p模擬物（miR-196b-5p mimic）和miR-196b-5p抑制物（miR-196b-5p inhibitor）轉染后收集培養液，分離出外泌體并干預小鼠結腸癌CT 26.WT細胞，觀察細胞增殖、凋亡和遷移等生物學行為的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、主要試劑和儀器8只健康4周齡BALB/c小鼠，體質量15～16 g，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0002，動物使用許可證號：SYXK（鄂）2018-0104。小鼠結腸癌CT 26.WT細胞由中國科學院上海細胞庫提供。DMEM-LG和Opti-MEM（美國Hyclone公司），胎牛血清（美國Gibco公司），CD44、CD34、CD105和CD90抗體（美國eBioscience公司），磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）、0.25%胰蛋白酶、Percoll分離液、四唑鹽（monotetrazolium，MTT）、結晶紫（北京索萊寶公司），LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司），miR-196b-5p mimic和miR-196b-5p inhibitor（廣州銳博公司），外泌體提取試劑盒（美國SBI公司），聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜和化學發光試劑（美國Millipore公司），兔抗CD63、兔抗CD81和兔抗TSG101（英國Abcam公司），二甲基亞砜（美國Sigma公司），CycletestTMPlus DNA Reagent試劑盒和AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）。倒置熒光顯微鏡（德國徠卡公司，型號：DMIL LED），流式細胞儀（美國Beckman公司，型號：CytoFLEX S），實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitativePCR，RT-qPCR）儀（美國Bio-Rad公司，型號：CFX-96），酶聯免疫檢測儀（美國Thermo公司，型號：Multiskan FC）。

1.2 小鼠骨髓MSCs的分離和培養BALB/c小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇消毒后置于超凈工作臺中，取雙側股骨和脛骨暴露骨髓腔。注射器吸取無血清的DMEM-LG將骨髓沖洗至培養皿中，并反復吹打成單細胞懸液。250 g離心10 min，棄上清液，取等體積Percoll分離液置于新離心管中，再緩慢加入骨髓細胞懸液，600 g離心30 min，取第二層環狀乳白色淋巴細胞層置于新離心管中。加入10 mL DMEM-LG混勻細胞，250 g離心10 min，棄上清。加入含15%胎牛血清的DMEM-LG重懸，于37℃、5%CO2培養箱中培養細胞。2 d后去除非貼壁細胞，每隔3～4 d換液1次，當細胞達到80%～90%融合時進行傳代。

1.3 MSCs的鑒定采用0.25%胰蛋白酶消化處理生長良好的細胞，吹打成單細胞懸液。200 g離心5 min，棄上清，再以PBS清洗，并調整細胞密度為1×106mL－1。取100μL單細胞懸液，分別加入2μL CD44、CD34、CD105或CD90抗體，4℃避光孵育30 min。加入2 mL流式染色緩沖液洗滌1次，300 g離心5 min，棄上清。加入400μL流式染色緩沖液重懸細胞，采用流式染色檢測。

1.4 瞬時轉染miR-196b-5p mimic和miR-196b-5p inhibitor轉染前24 h，將1×105個細胞接種于500μL無抗完全培養基中，待細胞融合度達70%～80%時進行轉染。分別取50μL Opti-MEM稀釋miR-196b-5p mimic或 miR-196b-5p inhibitor及LipofectamineTM2000，再將稀釋后的miR-196b-5p mimic或miR-196b-5p inhibitor與LipofectamineTM2000混合，混勻后室溫靜置20 min，加入細胞培養板中，并置于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h。

1.5 外泌體提取細胞培養48 h后，收集培養基上清，4℃、3 000 g離心15 min。取上清液，加入1/5體積的外泌體沉淀液，混勻后4℃過夜。1 500 g離心15 min，棄上清。加入PBS洗滌，1 500 g離心15 min，棄上清。加入適量PBS制成外泌體懸液。

1.6 外泌體鑒定將外泌體懸液滴加于銅網上，靜置5 min，醋酸鈾避光染色5 min，雙蒸水洗滌后濾紙吸干，透射電鏡觀察拍照。采用Western blotting法檢測各組外泌體懸液中CD63、CD81和TSG101表達情況。提取外泌體總蛋白，以每孔10μL蛋白的上樣量進行SDS-PAGE電泳。濕轉法將蛋白轉印至PVDF膜上，封閉液室溫封閉2 h。加入一抗稀釋液（CD63稀釋比為1∶1 000，CD81稀釋比為1∶2 000，TSG101稀釋比為1∶1 000），室溫孵育1 h。PBS洗滌2次后，加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h。PBS洗滌2次后，加入化學發光試劑，顯影分析。

1.7 實驗分組和處理將復蘇后處于對數生長期的小鼠結腸癌CT 26.WT細胞分為培養基組、mimic-NC組、inhibitor-NC組、未轉染的外泌體組、mimic-外泌體組和inhibitor-外泌體組。培養基組細胞采用MSCs培養液上清和新鮮培養液按照體積比1∶1混合后培養；未轉染的外泌體組細胞采用未經干預的MSCs外泌體處理，外泌體加入量為10μg；mimic-NC組、inhibitor-NC組、mimic-外泌體組和inhibitor-外泌體組細胞分別采用轉染miR-196b-5p mimic（或miR-196b-5p inhibitor）NC、mimic或inhibitor的MSCs外泌體處理，外泌體加入量為10μg。干預24 h后，RT-qPCR法檢測各組結腸癌CT 26.WT細胞中miR-196b-5p表達水平。

1.8 RT-q PCR法檢測外泌體和結腸癌細胞中miR-196b-5p表達水平提取各組外泌體（或培養基）總RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行RT-qPCR擴增。PCR引物序列：miR-196b-5p上游引物序列為5′-GGGTAGGTAGTTTCCTG-3′，miR-196b-5p下 游 引 物 序 列 為5′-AACTGGTGTCGTGGAGTC-GGC-3′；U 6上 游引 物 序 列 為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，U 6下游引物序列為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。采用2－??Ct法計算外泌體和結腸癌CT 26.WT細胞中miR-196b-5p表達水平。

1.9 MTT法檢測各組結腸癌CT 26.WT細胞的增殖活性按照實驗分組處理，培養12、24和48 h后，每孔加入20μL MTT溶液（5 g·L－1），繼續培養4 h。吸掉上清后，加入150μL二甲基亞砜，搖床低速振蕩10 min后，酶聯免疫檢測儀測定各孔490 nm處的吸光度（A）值，以A值代表細胞的增殖活性。

1.10 流式細胞術檢測各組結腸癌CT 26.WT細胞不同細胞周期百分率和細胞凋亡率采用0.25%胰蛋白酶消化處理各組結腸癌CT 26.WT細胞，制成單細胞懸液，并收集于流式專用管中，檢測不同細胞周期CT 26.WT細胞百分率和細胞凋亡率。1 000 g離心5 min，棄上清，PBS重懸后加入700μL無水乙醇，－20℃中固定24 h。3 000 g離心30 s，棄上清，以預冷PBS清洗2次。加入50 mg·L－1碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶液400μL，避光染核10 min，采用流式細胞術檢測不同細胞周期CT 26.WT細胞百分率。1 000 g離心5 min，棄上清。預冷PBS重懸，1 000 g離心5 min，棄上清。加入200μL Binding buffer重懸細胞，加入AnnexinⅤ-FITC和PI各10μL，輕輕混勻，避光孵育30 min。加入300μL Binding buffer，采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。

1.11 Transwell小室法檢測結腸癌CT 26.WT細胞的遷移細胞數和侵襲細胞數 遷移細胞數：實驗前24 h需將細胞培養于無血清培養基中，接種前將24孔板和Transwell小室采用PBS浸泡5 min。采用無血清培養基洗滌細胞，再采用含10%胎牛血清的培養基重懸細胞，稀釋至1×105mL－1，每個Transwell小室中接種0.5 mL細胞懸液，下層24孔板中加入0.75 mL含10%胎牛血清的培養基，培養48 h。4%甲醛固定10 min后，PBS洗滌。加入1 mL 0.5%結晶紫溶液，染色30 min后，PBS洗滌3次，晾干，于顯微鏡下觀察并計數遷移細胞數。侵襲細胞數：在小室中需鋪80μL Matrigel膠，并在37℃培養箱中放置30 min，再后進行細胞接種，其余步驟同遷移細胞數檢測過程。

1.12 統計學分析 采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析。采用GraphPad Prism 5軟件繪圖。外泌體和結腸癌CT 26.WT細胞中miR-196b-5p表達水平、細胞增殖活性、遷移細胞數和侵襲細胞數符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 流式細胞術鑒定MSCs表面標志物流式細胞術檢測骨髓MSCs表面標志物的表達結果見圖1。CD34表達陰性，CD44、CD90和CD105表達陽性，符合MSCs表型特征。

圖1 MSCs表面標志物CD34、CD44、CD90,和CD105的表達Fig.1 Expressions of MSCs surface markers CD34,CD44,CD90,and CD105

2.2 外泌體觀察和鑒定透射電鏡觀察結果顯示：MSCs外泌體為直徑50～60 nm的盤狀囊泡，雙層膜結構，內膜凹陷（圖2）。進一步檢測外泌體特定的生物標志物CD63、CD81和TSG101的結果顯示：外泌體組、mimic-外泌體組和inhibitor-外泌體組均高表達CD63、CD81和TSG101，而外泌體組、mimic-外泌體組和inhibitor-外泌體組提取外泌體后的培養基中均未檢測出標志物蛋白表達（圖3），即外泌體提取成功。

2.3 攜帶miR-196b-5p的外泌體和結腸癌細胞中miR-196b-5p表達水平與培養基組比較，外泌體和陰性對照組的外泌體與結腸癌細胞中miR-196b-5p表達水平明顯升高（P＜0.05）；與外泌體組比較，陰性對照組的外泌體和結腸癌細胞中miR-196b-5p表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），而mimic組外泌體和結腸癌細胞中miR-196b-5p表達水平明顯升高（P＜0.05），inhibitor組miR-196b-5p表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖4。

圖2 電鏡下觀察外泌體形態表現(×40 000)Fig.2 Morphology of exosomes observed under electron microscope(×40 000)

2.4 各組結腸癌細胞增殖活性培養基組和2個陰性對照組結腸癌細胞增殖活性比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與外泌體組比較，mimic-外泌體組結腸癌細胞的增殖活性明顯升高（P＜0.05），而inhibitor-外泌體組結腸癌細胞增殖活性明顯降低（P＜0.05）。見圖5。

圖4 RT-qPCR法檢測外泌體(A)和結腸癌細胞(B)中miR-196b-5p表達水平Fig.4 Expression levels of miR-196b-5p in exosomes(A)and colon cancer cells(B)detected by RT-qPCR method

圖5 MTT法檢測各組結腸癌細胞增殖活性Fig.5 Proliferation activity of colon cancer cells in various groups detected by MTT assay

2.5 各組不同細胞周期結腸癌細胞百分率和細胞凋亡率與外泌體組比較，mimic-外泌體組G1期結腸癌細胞百分率升高（P＜0.05），S期結腸癌細胞百分率降低（P＜0.05），而inhibitor-外泌體組結腸癌細胞各周期細胞百分率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖6。與外泌體組比較，mimic-外泌體組結腸癌細胞凋亡率升高（P＜0.05），inhibitor-外泌體組結腸癌細胞凋亡率降低（P＜0.05）。見圖7。

2.6 各組結腸癌細胞的遷移細胞數和侵襲細胞數外泌體組和陰性對照組結腸癌細胞的遷移細胞數和侵襲細胞數比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與外泌體組比較，mimic-外泌體組結腸癌細胞遷移細胞數和侵襲細胞數均明顯減少（P＜0.05），而inhibitor-外泌體組結腸癌細胞遷移細胞數明顯增多（P＜0.05），侵襲細胞數增多但差異 無統計學意義（P＞0.05）。見圖8～11。

圖6 流式細胞術檢測各組不同細胞周期結腸癌細胞百分率Fig.6 Percentages of colon cancer cells at different cell cycles in various groups detected by flow cytometry

圖7 流式細胞術檢測各組結腸癌細胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of colon cancer cells in various groups detected by flow cytometry

圖8 各組結腸癌細胞遷移形態表現(結晶紫，×200)Fig.8 Migration morphology of colon cancer cells in various groups(Crystal violet，×200)

圖9 各組結腸癌細胞的遷移細胞數Fig.9 Number of migration colon cancer cells in various groups

3 討 論

結腸癌在我國的發病率呈現出逐年升高的趨勢［11-13］。手術和化療是目前治療結腸癌的主要方法［14］，針對轉移性結腸癌，手術療效甚微，而長期化療又易產生耐藥性，效果也并不理想。因此，尋找可替代腫瘤常規治療方法的新策略對于結腸癌的治療具有重大意義。外泌體是一種由細胞分泌的直徑為30～100 nm的細胞外囊泡，被認為是一種新的細胞間信號傳導方式，其攜帶miRNA可轉移到受體細胞，進而調節細胞中靶基因的表達［15-17］。有學者［18］認為：MSCs來源外泌體的治療價值可能比MSCs本身更高。本研究采用電鏡觀察所提取外泌體形態，檢測外泌體特定的生物標志物CD63、CD81和TSG101，結果顯示觀察到的外泌體直徑為30～100 nm，且上述標志物均表達，提示本研究成功獲得外泌體。

miR-196b-5p的表達水平與結直腸癌的惡性轉化有關，關于其在結直腸癌中的作用尚存爭議。XIN等［19］研究顯示：miR-196b-5p過表達會加速結直腸癌細胞的增殖、遷移與侵襲，抑制細胞凋亡。STIEGELBAUER等［9］的研究結果顯示：高表達的miR-196b-5p可抑制小鼠結腸癌細胞的遷移和侵襲，其機制可能是miR-195b-5p與遷移相關基因相互作用后對結腸癌的發展產生影響。高表達的miR-196b也被認為是預測轉移性結腸癌患者接種疫苗后評價治療效果的生物標志物之一［20］。余昆等［21］也發現：下調miR-196b-5p表達可促進結直腸癌細胞的增殖。本研究通過轉染miR-196b-5p mimic（或miR-196b-5p inhibitor）對MSCs外泌體攜帶的miR-196b-5p的表達進行干預，進而觀察外泌體對小鼠結腸癌CT 26.WT細胞生物學特性的影響，結果顯示：miR-196b-5p mimic外泌體組結腸癌細胞的增殖活性、遷移細胞數與侵襲細胞數均減少，且發生G1期阻滯現象，細胞凋亡率升高，而miR-196b-5p inhibitor外泌體組結腸癌細胞的增殖活性、遷移細胞數與侵襲細胞數增多，細胞凋亡率降低。本研究結果與STIEGELBAUER等［9］和余昆等［21］的結論一致，即攜帶高水平miR-196b-5p外泌體對結腸癌具有抑制作用。

圖10 各組結腸癌細胞侵襲形態表現(結晶紫，×200)Fig.10 Invasion morphology of colon cancer cells in various groups(Crystal violet,×200)

圖11 各組結腸癌細胞侵襲細胞數Fig.11 Number of invasion colon cancer cells in various groups

綜上所述，骨髓MSCs源性外泌體攜帶的高水平miR-196b-5p可抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡。結合本課題組前期對結腸癌耐藥性的研究結果顯示：骨髓MSCs源性外泌體攜帶miR-196b-5p可能為結腸癌的治療策略提供新思路，未來本課題組將進一步從體內實驗水平進行驗證。