敲降miR-222-3p靶向PTEN對甲狀腺癌131I放療抵抗的影響及其機制

馮曜宇,張承磊,侯麗娟,王益夫,吳秀玲,馬云海

（1.昆明醫科大學第一附屬醫院血管外科，云南 昆明650031；2.云南大學附屬醫院普外三科，云南 昆明650021；3.昆明醫科大學第一附屬醫院甲狀腺外科，云南 昆明650031）

甲狀腺癌是最常見的內分泌惡性腫瘤，雖然僅占全身惡性腫瘤的1%，但近年來發病率迅速增長［1-2］。放射性核素131I是治療分化型甲狀腺癌的有效方法［3-4］。然而，由于甲狀腺癌細胞易發生繼發性放療抵抗，導致放療后病灶殘留、增殖和轉移，無法達到預期治療效果。研究［5］顯示：微小RNA（microRNA，miRNA）的異常表達與腫瘤的放療抵抗有密切關聯，例如miR-22通過下調沉默調節蛋白1（sirtuin 1，Sirt1）表達水平抑制乳腺癌的放療抵抗。miR-24通過靶向刺激蛋白1（stimulating protein 1，SP1）并下調其表達水平從而抑制鼻咽癌的放療抵抗［6］。研究［7-8］表明：miR-222-3p在甲狀腺癌細胞中高表達，其可以促進癌細胞的侵襲和轉移，但miR-222-3p通過靶向下游基因調控甲狀腺癌131I放療抵抗的具體分子機制尚未見報道。本研究通過敲降甲狀腺癌細胞中miR-222-3p表達，探討敲降miR-222-3p對甲狀腺癌131I放療抵抗的作用機制，為甲狀腺癌臨床治療131I放療抵抗提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人甲狀腺癌K1細胞（貨號：BNCC337627）、人乳頭瘤狀甲狀腺癌TPC-1細胞（貨號：BNCC337912）、人乳頭狀甲狀腺癌BCPAP細胞（貨號：BNCC338685）和正常甲狀腺濾泡上皮Nth-ori 3-1細胞（貨號：BNCC340487）均購于北京北納創聯生物技術研究院（ATCC細胞庫）。TRIzol Reagent試劑盒和一步法逆轉錄試劑盒One Step TB GreenTMPrimeScriptTM實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒購于日本TaKaRa公司，miR-222-3p inhibitor、pcDNA 3.1-PTEN和1%青霉素-鏈霉素購于美國Thermo Fisher Scientific公司，全蛋白提取試劑盒購于美國Bio-Rad公司，免疫印跡一抗β-actin、人第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因（gene of phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten，PTEN）抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗購于美國CST公司，ECL化學發光底物液購于美國Amersham Pharmacia公司，CCK-8試劑盒購于北京索萊寶公司，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購于上海美吉公司，Lipofectamine 3000購于美國Invitrogen公司，雙熒光素酶報告基因試劑盒購于美國Promega公司，10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和RPMI-1640培養基均購于美國Gibco公司。流式細胞儀購于美國BD公司，ABI 7500 RT-qPCR儀購于美國Applied Biosystems公司，iMark多功能酶標儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養將甲狀腺癌K1、TPC-1、BCPAP細胞和正常甲狀腺濾泡上皮Nth-ori 3-1細胞置于含10%FBS及1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養基中，在37℃、5%CO2培養箱中常規培養。

1.3 放射抗性K 1（K1R）細胞的建立將對數生長期的K 1細胞置于0.5 Gy放射性核素131I照射下刺激培養24 h。更換新鮮的RPMI-1640培養基繼續培養，觀察細胞活性，若無明顯死亡則選擇該對數生長期細胞增加放療劑量，反復傳代培養，直至最后在3 Gy放射性核素131I照射下能夠穩定存活，即成功構建131I放療抵抗K 1R細胞。實驗分為空白對照組、131I處理組、131I+miR-222-3p敲降組、131I+PTEN過表達組和131I+PTEN過表達+miR-222-3p過表達組。空白對照組K1和K1R細胞不經任何處理，131I處理組K 1和K1R細胞經1和3 Gy131I處理，131I+miR-222-3p敲降組K1和K 1R細胞轉染miR-222-3p敲降載體后再經1和3 Gy131I處理，131I+PTEN過表達組K1和K1R細胞轉染PTEN過表達載體后再經1和3 Gy131I處理，131I+PTEN過表達+miR-222-3p過表達組K1和K1R細胞同時轉染PTEN過表達載體和miR-222-3p mimic后再經1和3 Gy131I處理。

1.4 細胞轉染采用不含FBS的RPMI-1640培養基稀釋Lipofectamine 3000和miR-222-3p inhibitor，1︰1混勻，室溫孵育10～15 min。將孵育混合物加入到匯合度為80%的細胞培養液中，置于5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養2～4 d。pcDNA 3.1-PTEN（PTEN）、miR-222-3p mimic（miR-222-3p）轉染細胞方法同miR-222-3p inhibitor。其中，miR-222-3p mimic、 miR-222-3p inhibitor、pcDNA 3.1-PTEN和對照序列檢測均由上海吉瑪公司負責完成。

1.5 RT-qPCR法檢測miR-222-3p表達水平采用TRIzol Reagent試劑盒提取甲狀腺癌細胞總RNA，首先將RNA反轉錄為cDNA，然后進行RT-qPCR擴增，擴增的參數設置如下：95℃、5 min預變性；95℃、10 s；95℃、5 s，60℃、30 s，40個循環。以U 6為內參，采用2－ΔΔCt法計算miR-222-3p表達水平。RT-qPCR引物序列見表1。

1.6 克隆形成實驗檢測K1和K1R細胞克隆形成數胰酶消化培養細胞，采用含10%FBS的RPMI-1640培養基重懸細胞，6孔板中每孔接種300個細胞。將6孔板置于5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養14 d。PBS清洗后采用甲醇固定30 min，1%結晶紫染色10 min，統計克隆形成數（大于50個細胞計為1個克隆）。每組樣品進行3次重復，取細胞集落數的平均值。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

1.7 CCK-8實驗檢測K1和K1R細胞增殖活性將空白對照組織和轉染組的甲狀腺K1和K1R細胞給予1和3Gy131I處理后接種于96孔板中，細胞密度為1×104mL－1。取10μL待轉染DNA轉入K1和K1R細胞中，培養不同時間（0、24、48、72和96 h）。于相應時間點分別加入10μL CCK-8試劑繼續培養2 h，采用酶標儀檢測450 nm處吸光度（A）值。每組樣品進行3次重復，取A值的平均值，并繪制細胞生長曲線。以A值表示細胞增殖活性。

1.8 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測K 1和K1R細胞凋亡率將空白對照組和轉染組的甲狀腺K1和K1R細胞給予1和3 Gy131I處理后繼續培養，選取對數期生長的細胞。采用胰蛋白酶消化成單個細胞后與500μL預冷的結合緩沖液均勻混合，加入5μL Annexin-Ⅴ-FITC，室溫避光孵育15 min。上機前5 min加入2.5μL PI染色，上機檢測K 1和K1R細胞的凋亡情況。每組樣品進行3次重復。細胞凋亡率＝凋亡細胞數/總細胞數×100%，實驗重復3次取平均值。

1.9 野生型PTEN m RNA 3′-UTR熒光素酶報告載體的構建通過miRTarBase軟件檢索miR-222-3p的靶基因，預測結果顯示miR-222-3p可能與PTEN mRNA 3′-UTR結合。因此，根據PTEN mRNA 3′-UTR的序列，設計末端SpeⅠ和Hin dⅢ酶切位點的特異性引物：上游引物序列5′-TGGAAAGGGACGAACTGGTG-3′，下 游 引物序列5′-CATAGCGCCTCTGACTGGGA-3′。將RT-qPCR引物和PMIR-REPORT luciferase報告載體分別采用限制性內切酶SpeⅠ和Hin dⅢ雙酶切處理后，通過純化、連接和轉化等常規步驟進行構建，挑選陽性克隆并測序鑒定。構建獲得的野生型PTEN mRNA 3′-UTR-熒光素酶報告基因載體，命名為PTEN-WT；突變型PTEN mRNA 3′-UTR-熒光素酶報告載體構建由上海吉瑪公司負責完成，命名為PTEN-MUT。

1.10 雙熒光素酶報告基因檢測miR-222-3p和PTEN的靶向關系首先將miR-222-3p的候選靶基因PTEN 3′-UTR靶序列插入至螢火蟲熒光素酶基因下游。挑菌、測序后提純質粒。將PTEN-WT端結合位點進行突變，并將其命名為PTEN-MUT進行共轉染。具體方法：在24孔板中，每孔細胞轉 染PTEN-WT（200 ng）、PTEN-MUT（200 ng）miR-222-3p mimic（600 ng）及mimic NC（600 mg）。50μL Opti-MEMⅠ培養基稀釋2μL Lipofectamin 3000試劑后室溫孵育5 min；混合需轉染的DNA和稀釋的Lipofectamin 3000，室溫孵育20 min后直接將復合物加入到含0.4 mL Opti-MEMⅠ培養基的細胞中，輕輕搖動培養板混勻；在37℃、5%CO2培養箱培養8 h后更換為0.5 mL含10% FBS、不含抗生素的正常DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h，收集細胞。參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各組細胞的相對熒光素酶活性，各組細胞的相對熒光素酶活性可以反映miR-222-3p與PTEN的靶向關系。熒光素酶活性=螢火蟲熒光強度/海腎熒光強度。實驗重復3次。

1.11 Western blotting法檢測K1和K1R細胞中PTEN蛋白表達水平 收集培養細胞，裂解提取全蛋白后進行定量SDS-PAGE。半干法轉膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗兔抗PTEN（1︰1 000）、β-actin（1︰1 000）4℃孵育10 h，二抗羊抗兔IgG-HRP（1︰3 000）雜交。化學發光儀成像，并采用Image J軟件對蛋白條帶進行定量。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參β-actin條帶灰度值，結果以3次實驗的平均值表示。

1.12 統計學分析 采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析。細胞中miR-222-3p表達水平、細胞克隆形成數、細胞增殖活性、細胞凋亡率、細胞熒光素酶活性和細胞中PTEN蛋白表達水平均以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各種細胞中miR-222-3p表達水平和K 1R細胞增殖活性RT-qPCR檢測結果顯示：與Nthy-ori3-1細胞比較，甲狀腺癌細胞中miR-222-3p表達水平升高（F=148.80，P＜0.01）；甲狀腺癌K 1細胞中miR-222-3p表達水平高于甲狀腺癌TPC-1和甲狀腺癌BCPAP細胞（F=13.00，P＜0.01）；甲狀腺癌放療抵抗K1R細胞中miR-222-3p表達水平高于甲狀腺癌K1細胞（t=6.12，P＜0.01）。CCK-8實驗檢測結果顯示：與甲狀腺癌K1細胞比較，不同劑量131I處理后甲狀腺癌放療抵抗K 1R細胞增殖活性升高（P＜0.05），半數抑制濃度（median inhibitory concentration，IC50）升 高（K1：IC50=1.45 Gy；K 1R：IC50=4.07 Gy），即miR-222-3p與K1R細胞對131I放療抵抗有關聯。見圖1。

圖1 各種細胞中miR-222-3p表達水平（A）和細胞增殖活性（B）Fig.1 Expression levels of miR-222-3p（A）in different kinds of cells and proliferation activities of cells(B)

2.2 敲降miR-222-3p增強甲狀腺癌K 1R細胞的放療敏感性RT-qPCR檢測結果顯示：轉染miR-222-3p inhibitor的K1和K1R細胞中miR-222-3p表達水平低于轉染前（K1：t=15.92，P＜0.01；K 1R：t=18.37，P＜0.01）。見圖2。

圖2 甲狀腺癌K 1和KIR細胞中miR-222-3p表達水平Fig.2 Expression levels of miR-222-3p in thyroid cancer K 1 and KIR cells

克隆形成實驗結果顯示：與敲降miR-222-3p前比較，敲降miR-222-3p后K1和K1R克隆形成數降低（K1：t=10.75，P＜0.01；K1R：t=9.80，P＜0.01）。見圖3和4。

CCK-8實驗檢測結果顯示：敲降miR-222-3p后，K1和K 1R細胞增殖活性降低（K 1：t24h=4.23，t48h=11.2，t72h=12.53，t96h=19.77，P＜0.01；K1R：t24h=5.50，t48h=8.07，t72h=12.53，t96h=19.94，P＜0.01）。見 圖5。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞術結果顯示：敲降miR-222-3p表達后K1和K1R細胞凋亡率高于敲降前（K1：t=10.15，P＜0.01；K1R：t=6.76，P＜0.01）。見圖6。

圖3 K 1和K1R細胞轉染前后克隆形態表現（結晶紫，×40）Fig.3 Colony morphology of K 1 and K 1R cells before and after transfection（Crystal violet,×40）

圖4 敲降miR-222-3p前后甲狀腺癌K 1和KIR細胞克隆形成數Fig.4 Number of colony formation of thyroid cancer K 1 and KIR cells before and after miR-222-3p knockdown

2.3 miR-222-3p和PTEN的靶向關系、熒光素酶活性及PTEN蛋白表達水平生物信息學工具miRTarBase預測結果顯示PTEN可能為miR-222-3p的靶基因，見圖7。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示：miR-222-3p mimics/PTEN-WT的HEK-293T細胞中熒光素酶活性低于其相應的對照組（P＜0.01），而共轉染miR-222-3p mimics/PTENMUT載體的HEK-293T細胞的熒光素酶活性與其相應的對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖8。Western blotting法檢測結果顯示：敲降miR-222-3p后K1和K 1R細胞中PTEN蛋白表達水平高于敲降前（K 1：t=17.67，P＜0.01；K 1R：t=30.98，P＜0.01）。PTEN是miR-222-3p的靶基因，且miR-222-3p可負調控PTEN表達水平。見圖9。

2.4 miR-222-3p靶向PTEN調控甲狀腺癌131I的放療抵抗Western blotting法檢測結果顯示：與對照組比較，轉染pcDNA 3.1-PTEN的K1和K1R細胞中PTEN蛋白表達水平升高（K 1：t=10.75，P＜0.01；K1R：t=9.80，P＜0.01）；而 共 轉 染pcDNA 3.1-PTEN和miR-222-3p mimic的K1和K1R細胞中PTEN蛋白表達水平與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.01）。見圖10。克隆形成實驗、CCK-8實驗和AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測結果顯示：與PTEN過表達前比較，PTEN過表達后K1和K1R細胞克隆形成數減少（K1：t=10.75，P＜0.01；K1R：t=9.80，P＜0.01），細胞增殖活性降低（K1：t24h=4.23，t48h=11.2，t72h=12.53，t96h=19.77，P＜0.01；K1R：t24h=5.50，t48h=8.07，t72h=12.53，t96h=19.94，P＜0.01），細胞凋亡率升高（K1：t=10.15，P＜0.01；K1R：t=6.76，P＜0.01）。見圖11～14。

圖5 敲降miR-222-3p前后甲狀腺癌K1和K 1R細胞增殖活性Fig.5 Proliferation activities of thyroid cancer K 1 and K 1R cells before and after miR-222-3p knockdown

圖6 AnnexinⅤ-FTC/PI雙染流式細胞術檢測各組miR-222-3p敲降前后甲狀腺癌K1和K 1R細胞凋亡率Fig.6 Apoptotic rates of thyroid cancer K 1 and K 1R cells before and after miR-222-3p knockdown detected by AnnexinⅤ-FITC/PI doble staining flow cytometry

圖7 miRTar Base預測PTEN與miR-222-3p的靶向關系Fig.7 Targeting relationship between PTEN and miR-222-3p predicted by miRTar Base

圖8 2組HEK-29T細胞中熒光酶活性Fig.8 Luctiferase activities in HEK-29T cells in two groups

圖9 Western blotting法檢測miR-222-3p敲降前后甲前腺癌K 1和K1R細胞中PTEN蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.9 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of PTEN protein in thyroid cancer cells before and after miR-222-3p knockdown

圖10 各組甲狀腺癌K1和K 1R細胞中PTEN蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.10 E lectrophoregram (A)and histogram(B)of expressions of PTEN protein in thyroid cancer K 1 and K 1R cells in various groups

圖11 PTEN過表達前后甲狀腺癌K1和K1R細胞克隆形態表現(結晶紫)Fig.11 Colyny morphology of thyroid cancer K 1 and K 1R cells before and after over-expression of PTEN(Crystal violet)

圖12 PTEN過表達前后各組甲狀腺癌K 1和K1R細胞克隆形成數Fig.12 Number of colony formation of thyroid cancer K 1 and K 1R cells in various groups before and after over?expression of PTEN

圖13 不同時間點各組甲狀腺癌K1和K1R細胞增殖活性Fig.13 Proliferation activities of thyroid cancer K 1 and K 1R cells in various groups at different time points

3 討論

甲狀腺癌絕大部分起源于濾泡上皮細胞，女性發病率多于男性，在女性惡性腫瘤中居第三位。長期以來，甲狀腺癌被認為多發于中年，然而臨床統計數據［2］表明15～34歲年輕人中甲狀腺癌發病率迅速增長。甲狀腺癌患者多數分化程度高，經放射性核素131I治療后，患者整體預后較佳，平均生存時間較 長［9-11］。然而，由于甲 狀 腺 癌 細 胞 發生131I放療抵抗，也會導致治療失敗［12］。因此迫切需要尋找甲狀腺癌中調控放療抵抗的關鍵分子，并深入研討其分子機制，為甲狀腺癌臨床治療放療抵抗性提供更多參考依據。

研究［13］表明：miRNA是調控多種腫瘤放療抵抗的關鍵因素。目前，關于miR-222-3p參與多種腫瘤，如胃癌［14］、上皮性卵巢癌［15］、非小細胞肺癌［16］和甲狀腺癌［17］等發生發展的研究均有報道；然而關于miR-222-3p參與調控甲狀腺癌放療抵抗的分子機制尚不明確。本研究首次證實：miR-222-3p參與甲狀腺癌131I放療抵抗，且下調miR-222-3p表達水平可以增強甲狀腺癌細胞131I放療的敏感性。

PTEN作為抑癌基因［18］，通過調控PI3K/AKT信號通路，抑制癌細胞的增殖和轉移，促進癌細胞的凋亡［19-21］，進而增強癌細胞的放療敏感性［22］。本研究結果顯示：PTEN為miR-222-3p的靶基因。敲降miR-22-3p可以上調PTEN表達水平，抑制甲狀腺癌細胞增殖，促進甲狀腺癌細胞凋亡，進而緩解甲狀腺癌131I放療抵抗。

綜上所述，miR-222-3p/PTEN分子軸與甲狀腺癌131I放療抵抗有關聯，敲降miR-222-3p可以上調PTEN表達水平，進而緩解甲狀腺癌131I放療抵抗，miR-222-3p及其分子軸miR-222-3p/PTEN可以作為臨床上緩解甲狀腺癌131I放療抵抗的治療靶點。