miR-30a-5p靶向調控TRIM 31表達對結直腸癌細胞5-氟尿嘧啶耐藥的逆轉作用及其機制

盧瑞云,谷敬鋒,張 建,張 新,徐 菲

（河北醫科大學第一醫院胃腸外科，河北 石家莊050039）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）已成為全球范圍內嚴重威脅人們生命的惡性腫瘤之一，由于飲食習慣問題，我國結直腸癌的發病率正在逐年升高［1］。大多數結直腸癌在臨床診斷時已出現局部進展或轉移，20%～30%的CRC患者對化療，如5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）不敏感，出現化 療 耐 受，導 致 病 情 惡 化［2］。研 究［3］顯 示：microRNAs可以調控特定基因表達誘導CRC對術前化療產生耐藥性，影響癌癥的進展和轉移。有研究［4-6］顯示：miR-30a-5p可作為腫瘤抑制因子，通過靶向調控PIK 3CD基因和胰島素受體底物2抑制CRC細胞的增殖、侵襲和遷移，且在多種腫瘤組織中低表達。三結構域蛋白31（tripartite motifcontaining protein 31，TRIM 31）是TRIM家族蛋白的重要成員，其在CRC組織中高表達，并促進CRC細胞的侵襲和遷移［7-8］。ZHANG等［9］研究也顯示：干擾TRIM 31表達可增強CRC放療敏感性。然而，miR-30a-5p是否通過靶向調控TRIM 31表達參與調節CRC化療耐藥有待進一步探討。因此，本研究收集臨床5-FU耐藥的CRC組織并采用5-FU耐藥細胞株HT-29/5-FU探討miR-30a-5p和TRIM 31在耐藥CRC組織中表達差異以及二者對CRC細胞5-FU耐藥性的影響，旨在為臨床克服CRC化療耐藥提供潛在靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2017年1月—2019年4月在河北醫科大學第一醫院胃腸外科經病理確診且以5-FU為一線化療藥物的50例CRC患者的臨床資料及其癌組織。納入標準：①經病理確診為CRC；②以5-FU為一線化療藥物進行治療；③術前未接受其他抗腫瘤治療。排除標準：①臨床資料不全者；②并發其他威脅生命的疾病者。50例CRC患者中5-FU化療敏感患者（5-FU/S組）27例，男性14例，女性13例；年齡34～76歲，中位年齡53歲，平均年齡（49.21±7.01）歲；組織分化程度：高/中分化13例，低分化14例；轉移部位：肺轉移16例，肝轉移5例，多部位轉移6例。5-FU化療耐藥患者（5-FU/R組）23例，男性13例，女性10例；年齡31～75歲，中位年齡54歲，平均年齡（50.67±6.71）歲；組織分化程度：高/中分化11例，低分化12例；轉移部位：肺轉移9例，肝轉移11例，多部位轉移3例。化療敏感為在化療治療后達到完全臨床緩解或化療后6個月內無復發；化療耐藥為在化療治療期間病情持續進展或者化療后6個月出現復發。2組患者性別、年齡和組織分化程度比較差異無統計學意義（P＞0.05），轉移部位比較差異有統計學意義（P＜0.05）。本研究經河北醫科大學第一醫院倫理學委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞、主要試劑和儀器耐藥株HT-29/5-FU由本實驗室前期通過5-FU濃度遞增法誘導HT-29細胞建立，其親本HT-29細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。RPMI-1640培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國Gibco公司，5-FU化合物和噻唑藍（MTT）購自美國Sigma公司，LipofectamineTM3000試劑和TRIzol試劑購自美國ThermoFisher公司，RNA反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒以及miR-30a-5p引物和TRIM 31引物由上海生工生物工程有限公司提供，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒和雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，miR-30a-5p mimics及其陰性對照mimics NC和TRIM 31過表達質粒及其空載質粒Vector由上海吉瑪制藥技術有限公司提供，TRIM 31抗體（貨號：ab67785）和GAPDH抗體（貨號：ab8245）購自英國Abcam公司，辣酸根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗小鼠IgG二抗（貨號：sc-2005）購自美國Santa公司。qPCR儀購自美國Bio-Rad公司，酶標儀購自美國BioTek公司，流式細胞儀購自美國Beckman公司。

1.3 細胞培養和轉染耐藥細胞株HT-29/5-FU及其親本HT-29細胞培養于含有10%FBS的RPMI-1640培養基并置于37℃、5%CO2的常規培養箱中培養，每隔2～3 d傳代1次。取對數生長期HT-29/5-FU耐藥細胞，以每孔2×105個細胞接種于6孔板，待細胞融合度達約85%時，按照LipofectamineTM3000轉染試劑盒說明書，將HT-29/5-FU細胞分為mimics NC組（轉染miR-30a-5p minics陰性對照mimics NC）、miR-30a-5p mimics組（轉染miR-30a-5p mimics）、miR-30a-5p mimics+vector組（轉染miR-30a-5p mimics和陰性對照空載體）和miR-30a-5p mimics+TRIM 31過表達組（轉染miR-30a-5p mimics和TRIM 31過表達質粒），另選擇不進行任何轉染的HT-29/5-FU細胞作為空白對照組。轉染48 h后采用RT-qPCR法檢測各組細胞中miR-30a-5p和TRIM 31 mRNA表達水平，Western blotting法檢測各組細胞中TRIM 31蛋白表達水平以驗證轉染效果。

1.4 MTT法檢測各組細胞的耐藥指數（resistance index，RI） 取對數生長期耐藥株HT-29/5-FU細胞及其親本HT-29細胞或轉染后的HT-29/5-FU細胞，以每孔5×103個細胞接種于96孔板中培養24 h，再分別加入濃度為0、5、10、20、40、100 mg·L－15-FU和0、10、20、40 mg·L－15-FU繼續培養24 h。每孔加入10μL MTT孵育4 h，再加入150μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide DMSO），室溫震蕩15 min，酶標儀檢測各孔490 nm處吸光度（A）值，以A值代表增殖活性，并計算各組細胞的半數抑制濃度（median inhibitory concetration，IC50）值 和RI。RI=HT-29/5-FU細胞的IC50/HT-29細胞的IC50。

1.5 RT-qPCR法檢測各組癌組織和細胞中miR-30a-5p和TRIM 31 mRNA表達水平取癌組織或細胞，采用TRTzol試劑提取樣品總RNA，依照RNA反轉錄試劑盒說明書將其轉錄為cDNA，以cDNA為模板，U 6和GAPDH為內參引物，進行逆轉錄循環。miR-30a-5p上游引物序列：5′-TACGGATCCCCTTCATCTTACTTTTTTCCCCC AA-3′，miR-30a-5下游引物序列：5′-ATCGCTAGCGAAACTAGAAGCTCGGTGATGAATA-3′；TRIM 31上 游 引 物 序 列：5′-AACCTGTCACCATCGACTGTG-3′，TRIM 31下游引物序列：5′-TGATTGCGTTCTTCCT-TACGG-3′；U6上游 引 物 序 列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH上 游 引 物 序 列：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAA-GG-3′，GAPDH下游引物序列：5′-GCCATC-ACGCCACAGTTTC-3′。RT-qPCR反應條件：50℃、30 min，95℃、10 min，94℃、15 s，60℃、1 min，共45個循環，94℃、15 s，60℃、1 min。miR-30a-5p表達水平以U 6為內參，TRIM 31 mRNA表達水平以GAPDH為內參，采用2－??Ct方法計算各組癌組織和細胞中miR-30a-5p和TRIM 31 mRNA表達水平。

1.6 Western blotting法檢測各組細胞中TRIM 31蛋白表達水平收集待檢測細胞沉淀，RAPI裂解液提取細胞總蛋白量，考馬斯亮藍（G-250）法測定蛋白濃度，選擇上樣量為20μg，上樣體積20μL，沸水煮10 min變性，離心上樣，進行SDS凝膠電泳，接著進行電轉將蛋白轉移到PVDF膜上，10%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入TRIM 31一抗（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）一抗，4℃孵育過夜。次日，TBST緩沖液洗膜3次，滴加二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜，加入ECL化學發光試劑進行顯影，Image J軟件對蛋白條件進行灰度分析，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.7 各組細胞凋亡率檢測取對數生長期轉染后的HT-29/5-FU耐藥細胞，以每孔2×105個細胞種于六孔板，每孔設置3個重復，貼壁后分別用0和10 mg·L－15-FU處理24 h，采用胰酶輕柔消化得到單細胞，預冷1×PBS洗滌3次，加入180μL AnnexinⅤ-FITC結合液重懸浮細胞，再分別加入10μL AnnexinⅤ-FITC和10μL PI，室溫避光孵育20 min后，采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡率，細胞凋亡率=（B4象限的早期凋亡細胞數+B2象限的晚期凋亡細胞數）/細胞總數×100%。

1.8 雙熒光素酶報告基因系統實驗檢測TRIM 31野生型（TRIM 31-WT）載體熒光素酶活性采用TargetScan數據庫預測到miR-30a-5p與TRIM 31有部分結合序列。設計合成TRIM 31野生型（WT）結合序列和TRIM 31突變型（MUT）結合序列，分別插入熒光素酶表達載體，得到TRIM 31-WT和TRIM 31-MUT熒光素酶報告載體。再將miR-30a-5p mimics和mimics NC分別與TRIM 31-WT和TRIM 31-MUT共轉染至293T細胞中，按照試劑盒說明書采用酶標儀分別檢測293T細胞中熒光素酶活性。

1.9 統計學分析采用SPSS 21.0統計軟件進行統計學分析。癌組織中miR-30a-5p和TRIM 31 mRNA表達水平相關性分析采用Pearson相關性分析；各組癌組織和CRC細胞中miR-30a-5p及TRIM 31 mRNA表達水平、TRIM 31蛋白表達水平、細胞增殖活性和細胞凋亡率均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析或兩因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組CRC組織中miR-30a-5p和TRIM 31 mRNA表達水平5-FU/R組患者CRC組織中miR-30a-5p表達水平明顯低于5-FU/S組（t=12.761，P＜0.01），而5-FU/R組患者CRC組織中TRIM 31 mRNA表達水平則明顯高于5-FU/S組（t=12.066，P＜0.01），見圖1A和B。相關性分析結果顯示：miR-30a-5p表達水平與TRIM 31 mRNA表達水平呈負相關關系（R2=0.885，P＜0.01），提示在CRC組織的5-FU耐藥過程中兩者之間可能存在負調控關系。見圖1C。

圖1 5-FU/R和5-FU/S組患者CRC組織中miR-30a-5p和TRIM 31 mRNA表達水平Fig.1 Expression levels of miR-30a-5p and TRIM 31 mRNA in CRCtissueof patientsin 5-FU/Rgroup and 5-FU/Sgroup

2.2 HT-29/5-FU細胞藥敏性鑒定MTT實驗結果顯示：不同濃度5-FU作用24 h時，HT-29/5-FU細胞增殖活性明顯高于親本HT-29細胞，差異有統計學意義（F組別=707.580，P＜0.01；F濃度=219.814，P＜0.01； F組別×濃度=48.865，P＜0.01）。見圖2。HT-29/5-FU細胞的IC50值為（104.41±0.22）mg·L－1，HT-29細胞的IC50值為（9.82±0.31）mg·L－1，RI值 為12.42，說 明HT-29/5-FU細胞對5-FU耐藥。

2.3 HT-29/5-FU和HT-29細胞中miR-30a-5p和TRIM 31 m RNA及蛋白表達水平耐藥HT-29/5-FU細胞中miR-30a-5p表達水平明顯低于HT-29細胞（t=12.858，P＜0.01）。耐藥HT-29/5-FU細胞中TRIM 31 mRNA和蛋白表達水平均明顯高于HT-29細胞（t=10.887，P＜0.01；t=16.003，P＜0.01），提示HT-29細胞5-FU耐藥性可能與miR-30a-5p和TRIM 31異常表達有關。見圖3和4。

圖2 HT-29細胞和HT-29/5-FU細胞的增殖活性Fig.2 Proliferation activities of HT-29 cells and HT-29/5-FU cells

2.4 轉染后各組HT-29/5-FU細胞中miR-30a-5p和TRIM 31 mRNA及蛋白表達水平RT-qPCR法檢測結果顯示：與空白對照組和mimics NC組比較，miR-30a-5p mimics組HT-29/5-FU細胞中miR-30a-5p表達水平明顯升高（F=117.701，P＜0.01）。見圖5。Western blotting法檢測結果顯示：與空白對照組和mimics NC組比較，miR-30a-5p mimics組HT-29/5-FU細胞中TRIM 31蛋白表達水平明顯降低（F=668.585，P＜0.01）。見圖6。

圖3 HT-29/5-FU和HT-29細胞中miR-30a-5p和TRIM 31 m RNA表達水平Fig.3 Expression levels of miR-30a-5p and TRIM 31 mRNA in HT-29/5-FU and HT-29 cells

圖4 HT-29/5-FU和HT-29細胞中TRIM 31蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.4 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of TRIM 31 protein in HT-29/5-FU and HT-29 cells

圖5 轉染后各組HT-29/5-FU細胞中miR-30a-5p表達水平Fig.5 Expression levels of miR-30a-5p in HT-29/5-FU cells after transfection in various groups

圖6 轉染后各組HT-29/5-FU細胞中TRIM 31蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.6 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of TRIM 31 protein in HT-29/5-FU cells after transfection in various groups

2.5 各組HT-29/5-FU細胞中TRIM 31蛋白表達水平、細胞增殖活性和IC50值 與陰性對照組比較，miR-30a-5p mimics組和miR-30a-5p mimics+vector組HT-29/5-FU細胞中TRIM 31蛋白表達水平明顯降 低（t=18.309，P＜0.01；t=19.232，P＜0.01）；與miR-30a-5p mimics+vector組比較，miR-30a-5p mimics+TRIM 31組HT-29/5-FU細胞中TRIM 31蛋白表達水平明顯升高（t=23.445，P＜0.01）。見圖7。不同濃度5-FU處理后，miR-30a-5p mimics+TRIM 31組HT-29/5-FU細胞增殖活性高于miR-30a-5p mimics+vector組（F組別=1406.868，P＜0.01；F濃度=506.552，P＜0.01；F組別×濃度=47.450，P＜0.01）。見圖8。mimics NC組、miR-30a-5p mimics組、miR-30a-5p mimics+vector組 和 miR-30a-5p mimics+TRIM 31組HT-29/5-FU細胞IC50值分別為（97.35±0.02）、（6.54±0.03）、 （6.49±0.02） 和 （40.45±0.02）mg·L－1；與mimics NC組比較，miR-30a-5p mimics組和miR-30a-5p mimics+vector組HT-29/5-FU細胞IC50值明顯降低（t=281.6，P＜0.01；t=239.9，P＜0.01）；與miR-30a-5p mimics+vector組比較，miR-30a-5p mimics+TRIM 31組HT-29/5-FU細胞IC50值明顯升高（t=78.99，P＜0.01）。

2.6 各組HT-29/5-FU細胞凋亡率0 mg·L－15-FU處理后，與mimics NC組比較，miR-30a-5p mimics組和miR-30a-5p mimics+vector組HT-29/5-FU細胞凋亡率明顯升高（t=15.689，P＜0.01；t=14.013，P＜0.01）；與miR-30a-5p mimics+vector組比較，miR-30a-5p mimics+TRIM 31組HT-29/5-FU細胞凋亡率明顯降低（t=9.153，P＜0.01）。采用10 mg·L－15-FU處理后，與mimics NC組比較，miR-30a-5p mimics組和miR-30a-5p mimics+vector組HT-29/5-FU細胞凋亡率明顯升高（t=29.634，P＜0.01；t=30.344，P＜0.01）；與miR-30a-5p mimics+vector組比較，miR-30a-5p mimics+TRIM 31組HT-29/5-FU細胞凋亡率明顯降低（t=19.818，P＜0.01）。見圖9。

2.7 miR-30a-5p與TRMI31的靶向關系采用TargetScan生物信息分析預測，miR-30a-5p與TRIM 31存在靶向結合序列，見圖10。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示：與mimics NC組比較，miR-30a-5p mimics組293T細胞中TRIM 31-WT質粒熒光素酶活性降低（t=18.280，P＜0.01），而TRIM 31-MUT質粒熒光素酶活性差異無統計學意義（t=1.936，P=0.125），見圖11，說明miR-30a-5p可負靶向調控TRIM 31表達。

圖7 共轉染miR-30a-5p mimics和TRIM 31過表達質粒后各組HT-29/5-FU細胞中TRIM 31蛋白表達電泳圖(A)和直條圖(B)Fig.7 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of TRIM 31 protein in HT-29/5-FU cells in various groups after co-transfection of miR-30a-5p mimics and TRIM 31 over-expression plasmids

圖8 共轉染miR-30a-5p mimics和TRIM 31過表達質粒后各組HT-29/5-FU細胞增殖活性Fig.8 Proliferation activities of HT-29/5-FU cells in various groups after co-transfection of miR-30a-5p mimics and TRIM 31 over-expressed plasmids

圖9 流式細胞術檢測各組HT-29/5-FU細胞凋亡率Fig.9 Apoptotic rates of HT-29/5-FU cells in various groups detected by flow cytometry

圖10 生物信息法分析預測miR-30a-5p與TRIM 31靶向結合序列Fig.10 Binding sites between miR-30a-5p with TRIM 31 predicted by bioinformatics analysis

圖11 2組HT-29細胞中TRIM 31-WT和TRIM 31-MUT質粒熒光素酶活性Fig.11 Luciferase activities of TRIM 31-WT and TRIM 31-MUT vectors in HT-29 cells in two groups

3 討 論

5-FU是一種治療CRC的常見化療藥物，其通過抑制胸苷酸合成酶活性干擾DNA復制，誘導DNA損傷，從而導致細胞周期阻滯和細胞凋亡。近十年來，5-FU相關化療方案的廣泛應用使得CRC患者的生存期延長。然而，在實際臨床治療過程中，5-FU化療獲得性耐藥現象普遍發生，影響治療效果，并導致不良預后。目前，亟需研究闡明CRC對5-FU耐藥的具體機制，探討切實可行的治療靶標。

研究［9］顯示：多種mircoRNAs可以在轉錄和翻譯等不同水平上精準調控基因表達程序來控制不同腫瘤耐藥機制。有研究［10-11］顯示：miR-30a-5p通過靶向SOX9抑制SKOV-3/DDP卵巢癌耐藥株對順鉑的耐藥作用；在胰腺癌中通過miR-30a-5p/FOXD1/ERK分子軸促進胰腺癌對吉西他濱耐藥的發生。可見miR-30a-5p在不同類型腫瘤中通過調控不同的作用基因表達實現對腫瘤耐藥的抑制。關于miR-30a-5p在CRC耐藥方面的研究［12］顯示：其在順鉑、絲裂霉素和阿霉素耐藥CRC細胞株中低表達，可以維持細胞的耐藥特性，而在CRC耐藥組織中的表達情況報道較少。本研究結果顯示：miR-30a-5p在5-FU耐藥化療CRC組織中低表達，提示miR-30a-5p低表達可能與CRC的5-FU耐藥機制有關。為了進一步探討miR-30a-5p參與調控CRC的5-FU耐藥機制，首先借鑒LIU等［13］構建多種人CRC的5-FU耐藥細胞株的方法，在本實驗室成功構建HT-29/5-FU耐藥細胞，與親本HT-29細胞比較，耐藥細胞中miR-30a-5p低表達，且與在耐藥性CRC組織中表達趨勢一致。

TRIM 31是TRIM家族中的一員，其在腦膠質瘤［14］、肝癌［15］和急性髓性白血病［16］患者中高表達，促進癌癥細胞增殖、侵襲和遷移，與癌癥惡化顯著相關；另一方面，TRIM 31已被證實與腫瘤放射敏感性和化學敏感性有關，TRIM 31基因敲除可誘導DNA損傷和細胞凋亡，增強CRC細胞的放化療敏感性［8］，所以其在多種癌癥的進展和耐藥過程中發揮重要作用。有研究［17］顯示：TRIM 31在胰腺癌細胞中的過表達可增加其細胞對吉西他濱的耐藥性。本研究結果顯示：TRIM 31在5-FU耐藥化療CRC組織中高表達，且在HT-29/5-FU耐藥細胞中高表達。已有研究［18-19］顯示：miRNA-29c-3p可通過靶向調控TRIM 31抑制肝癌腫瘤進展，由此猜想miR-30a-5p是否通過調控TRIM 31參與CRC對5-FU的耐藥。FU等［20］通過過表達miR-20b證明了其可以靶向ADAM 9，抑制CRC細胞增殖和凋亡，降低細胞對5-FU的耐藥性，本研究在HT-29/5-FU耐藥細胞株中轉染miR-30a-5p mimics的結果顯示：過表達miR-30a-5p可以下調細胞中TRIM 31表達水平，抑制耐藥株細胞活性，增加對5-FU的敏感性。進一步同時共轉染TRIM 31過表達質粒后，HT-29/5-FU細胞增殖活性提高，HT-29/5-FU細胞凋亡被促進，逆轉了miR-30a-5p過表達提高的細胞藥敏性，說明miR-30a-5p是通過下調TRIM 31表達介導CRC細胞對5-FU的耐藥。TargetScan數據庫分析結果顯示：miR-30a-5p與TRIM 31之間存在互補序列。雖然miR-30a-5p與TRIM 31的3′UTR的結合存在不保守性，但是雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示：miR-30a-5p可以負靶向TRIM 31的3′UTR區降低熒光素酶活性，結果證實過表達miR-30a-5p可以靶向下調TRIM 31，增強CRC細胞對5-FU的敏感性。

綜上所述，miR-30a-5p可以增強CRC對5-FU敏感性，且由TRIM 31下調介導實現，本研究結果為miR-30a-5p影響CRC耐藥提供了新的調控機制，為CRC新的治療靶點和預后生物標志物研究提供了新方向。