基于miniPDX動物模型篩選化療方案治療卵巢癌的臨床效果評價

蘇 丹,劉 屹,崔慢慢,楊 年,黃 宇,何文靜

（四川省人民醫院婦產科 四川省醫學科學院，四川 成都610072）

上皮性卵巢癌（epithelial overian cancer，EOC）是女性死亡率最高的婦科腫瘤，化療是其主要的治療方法之一。臨床實踐中多依據EOC的治療指南和醫生的用藥習慣選擇化療方案，對于患者個體而言，化療開始前并不確定哪種方案最有效。立足于精準治療，化療藥敏試驗應運而生。目前應用最廣的是將患者腫瘤細胞原代培養進行體外試驗，但由于缺乏腫瘤生長微環境，試驗結果和臨床之間有一定差異［1］。人源性腫瘤移植動物模型（patient derived xenograft，PDX）是將患者腫瘤轉移到免疫缺陷小鼠身體中進行體內試驗，能更加真實地反映患者腫瘤的分子多樣性、細胞和組織學異質性，已被用于臨床前藥物評估、生物標志物識別、生物研究及個性化藥物策略［2］。目前已有關于PDX模型在婦科惡性腫瘤靶向治療的報道［3］。在此基礎上建立的迷你人源性腫瘤移植（mini patient derived xenograft，miniPDX）動物模型建模時間更短，因此其較PDX模型在臨床上應用更廣泛，miniPDX模型已被證實在指導膽囊癌化療方案選擇的臨床試驗［4］中有效，但是其在治療EOC中的應用尚未見相關報道。本研究根據miniPDX模型藥物敏感性試驗結果指導EOC患者化療，以采用常規化療方案的患者為對照，比較2組患者的療效和不良反應，探討miniPDX模型在指導EOC個體化療方面的意義，同時聯合2組患者的免疫組織化學結果及化療后復發時間，分析免疫標志物在預測化療鉑敏感性方面的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2019年1月—2020年11月在四川省人民醫院婦產科首次診斷未行化療即行腫瘤細胞減滅術的22例EOC患者作為研究對象。根據國際婦產科學聯合會（FIGO，2019年版）EOC診斷及分期標準，患者術后病理報告證實原發腫瘤為EOC（包括卵巢漿液性癌、卵巢粘液性癌和卵巢子宮內膜樣腺癌等）。收集患者的臨床資料，包括年齡、病理類型和病理分期等。納入標準：①經病理學確診為卵巢癌的患者；②未進行過化療者；③根據實體瘤療效評價標準（RECIST 1.1）至少有1個可測量病灶；④美國東部腫瘤協作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評分為0～2分；⑤患者愿意進行miniPDX模型藥敏試驗，并愿意根據藥敏結果選擇化療方案進行術后化療。患者及其家屬均知情并簽署相關知情同意書。該實驗獲得四川省人民醫院倫理委員會批準。排除標準：①術前進行過化療；②不愿進行miniPDX模型藥敏試驗，或不愿意根據藥敏結果選擇化療方案進行術后化療。另選取同期患者基本情況匹配并采用常規化療方案進行治療的41例EOC患者作為對照組，常規化療方案采用紫杉醇+卡鉑或紫杉醇+順鉑，該2種方案是美國國立綜合癌癥網（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）［5］推薦的一線治療方案，且因其經濟實惠，在本院EOC的治療中應用最廣?；焺┝烤碞CCN推薦的EOC治療指南推薦治療量計算。

1.2 治療方法患者同意行miniPDX模型藥敏試驗并簽署了相關同意書。取術中EOC患者原發腫瘤組織建立miniPDX模型。采用OncoVeeTMminiPDX法（上海立迪生物技術股份有限公司）檢 測 藥 物 敏 感 性［4，6］。采 用Hank’s平 衡 鹽 溶 液（HBSS）沖洗EOC組織標本，去除血管等非腫瘤組織及壞死的腫瘤組織。切片后，采用膠原酶37℃消化腫瘤組織1～2 h，收集細胞，去除血細胞和成纖維細胞。然后將EOC細胞懸液轉移至HBSS沖洗膠囊中。選擇4周齡的BALB/c裸鼠將膠囊植入其背部皮下，每只裸鼠植入3個膠囊。接種腫瘤細胞1 d后，根據婦科腫瘤醫生建議給予裸鼠3種不同的聯合用藥方案進行試驗，共7 d。同時設立給予生理鹽水治療的裸鼠作為對照。7 d后取出膠囊里的細胞，采用CellTiter-Glo熒光細胞活力測定法測定腫瘤細胞的相對熒光值（relative fuorescence units，RFU）。計算腫瘤細胞相對增殖率，腫瘤細胞相對增殖率=（第7天藥物處理組的RFU?第0天藥物處理組的RFU）/（第7天對照組的RFU?第0天對照組的RFU）×100%。藥物選擇NCCN指南推薦的EOC一線治療藥物［5］。該部分試驗獲得四川省人民醫院倫理委員會批準，符合赫爾辛基宣言。根據藥敏試驗結果從高至低順序，選擇腫瘤細胞相對增殖率最低，即對細胞生長抑制最強，化療敏感性最高的給藥方案給予腫瘤細胞所對應患者進行化療，共6～8個周期。持續用藥至病情進展、無法耐受不良反應或患者要求停藥為止。

化療藥物用法：紫杉醇175 mg·m－2（d1，靜脈注射），21 d為1個周期；順鉑70 mg·m－2（d1，靜脈注射），21 d為1個周期；卡鉑（GFR+25）×AUC（AUC=5）（d1，靜脈注射），21 d為1個周期；奧沙利鉑130 mg·m－2（d1，靜脈注射），21 d為1個周期；吉西他濱1 000 mg·m－2（d1，靜脈注射），21 d為1個周期；貝伐珠單抗6 mg·m－2（d1，靜脈注射），21 d為1個周期；脂質體多柔比星50 mg·m－2（d1，靜脈注射），28 d為1個周期；白蛋白紫杉醇260 mg·m－2（d1，靜脈注射），21 d為1個周期。

1.3 療效評價標準和不良反應評價標準化療結束后根據婦科檢查、腫瘤標記物（如CA 125等）、B超和CT等檢查結果綜合判定局部腫瘤變化情況。療效評定參照RECIST（1.1版本）實體瘤療效評價標準［7］，以腫瘤病灶最長徑縮小情況作為評定近期療效的指標：病灶完全消失，全部病理性淋巴結靶結節和非靶結節短直徑必須減少至10 mm，并持續4周為完全緩解（complete response，CR）；腫瘤直徑縮小≥30%，并維持4周為部分緩解（partial response，PR）；靶病灶減小的程度未達到PR水平，增加的程度也未達到進展水平（研究時可以直徑之和的最小值作為參考）為穩定（stable disease，SD）；所有測量的靶病灶直徑和相對增加＞20%，絕對值增加至少5 mm或出現1個或多個新發病灶腫瘤為進展（progressive disease，PD）?？偩徑饴剩╫verall response rate，ORR）=（CR+PR）/總數×100%。以CR和PR為有效，以SD和PD為無效。不良反應參照WHO化療藥物毒性反應分度標準［8］。0度：無不良反應；Ⅰ度：輕度不良反應；Ⅱ度：中度不良反應；Ⅲ度：重度不良反應；Ⅳ度：有嚴重的并發癥，危及生命。Ⅲ度+Ⅳ度=嚴重不良反應。當不良反應等級達到Ⅲ或Ⅳ度，經積極對癥處理后仍未緩解者，應考慮停藥。

1.4 隨訪隨訪期限設定為自首次診斷EOC至2020年11月?；熎陂g每21 d隨訪1次，化療結束每3個月隨訪1次。隨訪期間進行婦科檢查、淺表淋巴結觸診、腫瘤標記物（如CA 125等）、盆腹腔B超和盆腹腔CT檢查等。未規律復查者進行電話隨訪。

1.5 免疫組織化學染色檢測將2組患者腫瘤組織病理切片進行CK7、WT-1、p16、p53、Ki-67和配對盒基因8抗原（paired box gene-8，PAX-8）免疫組織化學染色，并分析其陽性結果與患者對含鉑化療敏感性間的關系。鉑耐藥患者為一線治療時迅速進展或在一線治療后短期內（＜6個月）即復發；鉑敏感患者為6個月以上復發［9］。上述腫瘤組織免疫組織化學染色檢測均取得了患者同意。

1.6 統計學分析采用Excel 2019軟件建立數據庫，采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析。經正態分布檢驗和方差齊性檢驗，患者年齡分布符合正態分布，以±s表示，年齡組間比較采用概率法非配對t檢驗。不同病理類型和分期患者的臨床治療效果、不良反應、免疫標志物與化療敏感性等組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。以P＜0.05代表差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組患者基本情況最終根據miniPDX藥敏試驗選擇化療方案進行治療的有22例Ⅲ～Ⅳ期EOC患者，另有41例同期以常規化療方案進行治療的Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌患者作為對照組。2組患者的基本情況見表1。2組患者的年齡、病理類型和分期等臨床特征比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 2組患者基本情況Tab.1 Basic informations of patients in two groups

2.2 miniPDX模型檢測結果將22例藥敏組患者的術中腫瘤組織送檢，建立miniPDX模型。婦科腫瘤醫生根據患者腫瘤病理類型和患者基礎情況提出3種聯合化療方案，并將其作用于小鼠進行藥敏試驗。不同聯合化療方案的細胞增殖率大小依次為：紫杉醇+卡鉑＞紫杉醇+順鉑＞吉西他濱+順鉑+貝伐珠單抗＞紫杉醇+奈達鉑+貝伐珠單抗＞紫杉醇+奧沙利鉑＞脂質體多柔比星+卡鉑＞白蛋白紫杉醇+卡鉑。因采用脂質體多柔比星+順鉑、吉西他濱+順鉑、白蛋白紫杉醇+奈達鉑方案者各1例，不具有代表性，未進入上述比較。對某一患者而言，應選取增殖率最低，即對腫瘤生長抑制最強的方案對其進行個體化化療。該22例患者中最終采用白蛋白紫杉醇+卡鉑及紫杉醇+順鉑化療者6例，采用紫杉醇+奧沙利鉑及脂質體多柔比星+卡鉑者3例，采用紫杉醇+卡鉑者2例，采用吉西他濱+順鉑+貝伐珠單抗及脂質體多柔比星+順鉑化療者1例。見表2。

2.3 2組患者臨床近期療效評價根據藥敏結果選擇敏感性高即增殖率低的化療方案對相應患者化療6～8個周期后進行療效評價的結果顯示：miniPDX組22例患者中有14例CR，4例PR，ORR為81.8%（18/22）；對照組41例患者中有13例CR，14例PR，ORR為65.9%（27/41），ORR小于miniPDX組（χ2=4.898，P=0.031），說明根據miniPDX藥敏試驗選擇化療方案可提高ORR。2組患者CR百分率比較差異有統計學意義（P=0.015），而PR、SD及PD百分率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.4 2組患者不良反應情況2組患者在治療過程中均有骨髓抑制、惡心嘔吐、肝酶異常和脫發等不良反應出現。其中最常見為脫發，其次為惡心嘔吐等胃腸道反應。miniPDX組和對照組患者各種嚴重不良反應的發生率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表2 采用不同化療方案患者的腫瘤細胞增殖率T ab.2 Proliferation rates of tumor cells in patients treated with different chemotherapy regimens

表3 2組患者臨床療效Tab.3 Clinical efficacies of patients in two groups

表4 2組患者不良反應發生情況Tab.4 Adverse effects of patients in two groups [n(η/%)]

2.5 免疫組織化學標志物與患者化療敏感性間關系將2組患者腫瘤組織進行CK 7、WT-1、p16、p53、Ki-67和PAX-8免疫組織化學染色的結果顯示：細胞核染色的有p53和Ki-67，而細胞漿染色的有CK7、WT-1、p16及PAX-8，見圖1。隨訪的2組所有63例患者均隨訪達到了6個月或已出現鉑耐藥。隨訪時間為4～23個月，平均隨訪時間為14.3個月。最終2組患者中共有鉑敏感者43例，鉑耐藥者20例。將免疫組織化學染色結果和化療鉑敏感間關系進行分析得出：p16、p53、Ki-67和PAX-8陽性者中鉑敏感患者百分率較p16、p53、Ki-67、PAX-8陰性者鉑敏感患者明顯升高（P＜0.05），提示p16、p53、Ki-67和PAX-8陽性可預測患者化療鉑敏感；而CK7和WT-1陽性者和陰性者中鉑敏感患者百分率比較差異無統計學意義（P＞0.05），提示CK7和WT-1可能與化療鉑敏感無關。見表5。

表5 免疫組織化學標志物與化療敏感性的關系Tab.5 Relationships between immunohistochemistry markers and chemotherapy sensitivities

圖1 EOC患者腫瘤組織中CK 7、WT-1、p16、p53、Ki-67和PAX-8表達（免疫組織化學，×100）Fig.1 Expressionsof CK 7,WT-1,p16,p53,Ki-67，and PAX-8 in cancer tissueof EOC patients(Immunohistochemistry,×100)

3 討 論

EOC是我國第一大婦科惡性腫瘤。隨著治療方式的改進，手術聯合鉑類／紫杉醇化療可大大提高EOC患者的生存率，但在臨床上仍有很多患者在術后3年內復發［9］。由于腫瘤是異質性、多態性、分化不均的細胞群體，即便是同一組織學類型、分化程度相同的腫瘤，對藥物的敏感性和耐藥性也明顯不同［10］。采用敏感化療藥物組成方案是克服卵巢惡性腫瘤抗藥性、提高患者生存率的有效途徑之一。

本研究對不同EOC患者個體選擇3種不同的聯合化療方案，通過mini PDX模型檢測這3種聯合化療方案的敏感性，并根據檢測結果選取增殖率最低的化療方案給予患者個體化治療的結果顯示：與對照組比較，mini PDX組患者獲得更高的ORR，分別為65.9%和81.8%；骨髓抑制、惡心嘔吐、肝酶異常和脫發等化療不良反應出現概率相似。因此mini PDX指導的個體化治療可提高EOC化療效果。本研究結果顯示：p16、p53、Ki-67和PAX-8等免疫組織化學標志物陽性與化療鉑敏感有關，可預測患者是否有化療鉑敏感，而CK7和WT-1陽性與化療鉑敏感無關。

本研究采用miniPDX模型進行藥敏試驗。miniPDX是采用特殊方法將原代人源腫瘤細胞（原發性或轉移性）移植到免疫缺陷小鼠內建立的一種藥敏測試模型。該模型可以對多種藥物及藥物組合方案進行快速藥物敏感性測試研究，并從中篩選出最優的個體化用藥方案，為患者的臨床用藥選擇提供科學依據。同時，采用生命組學大數據進行分析，可深入研究腫瘤發生發展及耐藥機制，從而實現腫瘤個體化精準醫療［11］。傳統腫瘤藥物篩選多采用體外培養的腫瘤細胞系進行試驗，這些細胞系無法體現腫瘤的異質性特征。而PDX模型保留了原始腫瘤的結構和基質成分，可以更準確地顯示癌細胞及其微環境之間復雜的生物化學和物理相互作用。在細胞水平上，PDX模型還保留了腫瘤之間和腫瘤細胞自身的異質性、表型和原始分子特征，包括染色體拷貝數變異、單核苷酸多態性和基因表達譜等。因此，PDX模型可提供與臨床關系更密切的體外癌癥建模系統［12］，模擬癌癥患者對細胞毒性藥物的臨床反應［4，12-13］。但PDX模型的建立需要多個移植周期，時間可長達4～8個月［14］。同時最終形成的腫瘤異種移植物侵襲性更強，生物學特性更傾向轉移性腫瘤［15］。miniPDX模型建立7 d即可得出建模結果，縮短了患者根據結果進行下一步治療的等待時間，這對EOC患者爭取后續化療時機也非常重要。

本研究結果顯示：細胞增殖率大小依次為紫杉醇+卡鉑＞紫杉醇+順鉑＞吉西他濱+順鉑+貝伐珠單抗＞紫杉醇+奈達鉑+貝伐珠單抗＞紫杉醇+奧沙利鉑＞脂質體多柔比星+卡鉑＞白蛋白紫杉醇+卡鉑。張喜梅等［16］研究顯示：細胞增殖率的大小依次為紫杉醇+順鉑＞吉西他濱+順鉑＞吉西他濱+卡鉑＞紫杉醇+卡鉑，說明紫杉醇+卡鉑方案對細胞增殖的抑制率均大于吉西他濱的聯合用藥方案，與本研究結果一致。張喜梅等［16］的研究顯示：吉西他濱的聯合用藥方案的細胞增殖率大于紫杉醇+卡鉑方案，與本研究結果相反，可能是由于本研究中吉西他濱聯合用藥方案加入了貝伐珠單抗，提高了抗腫瘤效果。本研究結果顯示：在化療方案中加入貝伐珠單抗可以降低細胞增殖率。該結果在小鼠卵巢癌腹腔種植瘤模型中的研究也得到了證實，如BIZZARO等［17］報道了貝伐珠單抗通過減少腫瘤血管生成抑制腫瘤增殖，從而增強紫杉醇+順鉑的化療效果，延緩腫瘤進展。本研究結果顯示：脂質體多柔比星聯合用藥較紫杉醇聯合用藥效果更好。研究［18］顯示：脂質體多柔比星單藥治療婦科腫瘤的ORR為9.5%～38.0%，與卡鉑聯用治療復發性EOC的ORR可達73.0%，治療效果明顯優于紫杉醇+卡鉑。與貝伐珠單抗聯合后，脂質體多柔比星可以導致微血管密度和胰島素樣生長因子結合蛋白水平降低，從而增強其抗腫瘤作用［19］。本研究結果提示：白蛋白紫杉醇聯合用藥較紫杉醇聯合用藥的抗腫瘤效果更好，與大多數實驗結果一致。但由婷婷等［20］進行的一項Meta分析結果顯示：白蛋白紫杉醇+鉑類在晚期EOC的一線治療中ORR為48.7%，紫杉醇+鉑類在晚期EOC的一線治療的ORR為53.0%，ORR比較差異無統計學意義；但在復發EOC的二線治療中，白蛋白紫杉醇的ORR為47.3%，紫杉醇的ORR為23.0%，ORR比較差異有統計學意義，因此白蛋白紫杉醇在二線治療中的應用價值更高。本研究中白蛋白紫杉醇+卡鉑方案的細胞增殖率小于紫杉醇+卡鉑方案，提示前者化療效果可能更好。關于脂質體多柔比星和白蛋白紫杉醇化療效果的比較目前尚未見報道。本研究結果雖然提示白蛋白紫杉醇聯合化療效果可能更好，但本研究是小鼠試驗，且樣本量較小，需進一步擴大樣本總結更多的臨床數據來獲得準確結論。

本研究結果提示：p16、p53、Ki-67和PAX-8陽性者存在化療鉑敏感，而CK 7和WT-1與化療敏感性無關。研究者［21］認為：p53、Ki-67、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多藥耐藥相關蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）、B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、胸苷酸合酶（thymidylate synthase，TS）、谷胱甘肽S-轉移酶π（glutathione S-transferaseπ，GST-π）和拓撲異構酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ，Topo-Ⅱ）等在調節化療敏感性中有重要作用［4］。p16是一種常見的抑癌基因，在卵巢癌中存在突變或缺失。p16蛋白表達陽性對腫瘤患者預后判斷具有重要意義［22］。p53基因是目前為止發現的于人類腫瘤發生關系最為密切的一種基因，若其發生基因突變可導致細胞癌變。p53蛋白陽性表達同卵巢癌分化程度、盆腔淋巴結轉移等密切相關［22］。WT?1是由腎母細胞瘤分離出來的轉錄因子，即可發揮癌基因又可發揮抑癌基因的作用。WT?1、Ki?67和P53在卵巢漿液性癌中高表達，且在高級別癌中陽性率明顯高于低級別癌，因此其可反映漿液性癌組織學分化程度［23］。PAX-8是Müllerian管上皮來源腫瘤的特異性標記物。卵巢來源于Müllerian管上皮。已有研究［24-25］顯示：PAX-8在鑒別原發性和轉移性卵巢癌中具有高度敏感性和特異性，其表達強度與卵巢癌的細胞分化程度及分期有關，并且可協助判斷患者預后。CK 7和CK 20是外科病理診斷最常使用的識別腺癌來源的免疫組織化學標志物，CK7和CK20聯合診斷有助于卵巢原發性腺癌與轉移性結直腸腺癌的鑒別以及提高結直腸腺癌診斷的特異性［26］。然而關于PAX-8、CK7及WT?1和腫瘤化療敏感性間的報道較少。本研究結果提示：PAX-8與化療敏感性有關，而CK7和WT?1與卵巢癌化療鉑敏感之間無明顯關聯。該結果仍需擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，miniPDX模型是指導卵巢癌患者化療方案選擇的有效工具，為卵巢癌的臨床化療提供了科學依據，減少了臨床經驗指導用藥的不良反應，p16、p53、Ki-67和PAX-8陽性者存在化療鉑敏感。該結論尚需更大樣本的研究和更長時間的隨訪來進一步證實。