染色體微陣列分析技術在不明原因神經發育障礙性疾病患兒中的應用

邵 晨，閆冬梅，王艷娟，趙亞麗，楊舒婷，王志偉，劉 雙，仝 嬌，王雷雷

神經發育障礙性疾病(neurodevelopmental disabilities，NDDs)通常是指由于異常的神經發育基礎而導致的精神、心理、行為發育障礙，包括發育落后/智力障礙(developmental delay/intellectual disability,DD/ID)、學習障礙、自閉癥癥候群(autism spectrum disorders,ASD)等，影響超過15%的兒童[1]。DD/ID是指發育成熟以前(18歲以前)出現的認知和適應行為障礙，是兒科門診較為常見的疾病之一，國外報道DD/ID的患病率為1%～3%[2]，ASD是一組嚴重影響兒童健康、具有顯著臨床和病因異質性的常見的NDDs。

NDDs發病機制復雜，與環境、遺傳等因素關系密切[3]，其中遺傳因素是主要因素之一。以ASD為例，一半以上的致病危險因素可歸因于遺傳學的變異；DD/ID的患兒中，有一半以上可以找到遺傳學病因[4]。遺傳性因素包括染色體數目和結構異常、單基因病、線粒體病、多基因和/或表觀遺傳異常等。據統計，染色體數目和結構異常占整個遺傳因素的25%～30%[5]。拷貝數變異(copy number variations，CNVs)是由基因組發生重排而導致的，一般指長度為1 kb至數Mb的基因組大片段的拷貝數增加或者減少，主要表現為亞顯微水平的缺失和重復。CNVs是導致DD/ID和ASD發生的重要病因，可以引起基因組與分子表型的異質性，導致疾病的發生。

近年來，隨著基因組學技術的快速發展，NDDs遺傳分子機制及診斷方法的研究取得了很大的進展[6]。染色體微陣列芯片分析(chromosomal microarray analysis,CMA)又稱染色體基因芯片分析技術，能夠檢測出>100 kb的CNVs[7]，在西方國家DD/ID、ASD等疾病的臨床診斷中得到廣泛應用[8-9]。相比于傳統的染色體核型分析，CMA能夠顯著提高具有臨床意義的CNVs的檢出率，已成為DD/ID、ASD及多發畸形等疾病的一線實驗診斷方法[10-11]。文獻[12-13]報道顯示，CMA在“原發性”智力障礙或者無法解釋的發育遲緩、自閉癥和先天性結構畸形病例中體現出了重大應用價值。但CMA技術應用于我國NDDs兒童診斷的臨床實踐起步較晚，目前我國CMA在NDDs兒童的臨床分子診斷中的檢測性能等信息不夠完善，因此本研究對100例NDDs患兒進行CMA檢測，針對檢測結果進行分析，該研究將有助于擴充臨床數據，為CMA在兒科疾病診斷中的廣泛應用和遺傳咨詢提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年3月至2018年8月于連云港市婦幼保健院就診的NDDs患兒100例，其中男72例，女28例，年齡40 d至11歲，平均年齡3.31歲；ASD患兒55例，DD/ID患兒45例。所有患兒的父母均進行CMA檢測前的遺傳咨詢并簽署知情同意書，本研究經連云港市婦幼保健院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 納入標準 (1)年齡0～18歲；(2)ID：依據韋氏智力測試(WISC-R及WPPST)IQ<70；DD：嬰幼兒采用Gesell發育量表評測，DQ<75者診斷發育遲緩；ASD患兒為通過美國精神障礙診斷與統計手冊(第5版)[14]；(3)臨床表現及實驗室檢查無代謝性病、單基因遺傳變性病證據；(4)獲得病人父母或其他監護人的知情同意，愿意參加本研究。

1.3 排除標準 (1)診斷不明確，或伴有其他神經系統器質性疾病；(2)細胞遺傳學分析已明確病因的患兒，如21-三體、18-三體、13-三體綜合征等；(3)臨床資料不齊全和/或已診斷病因的患兒病例；(4)患有神經系統疾病的患兒，如腦癱、癲癇、精神分裂癥、Rett綜合征等精神神經疾病及聾啞等。

1.4 研究方法

1.4.1 CMA檢測 樣本采集：利用EDTA抗凝采血管采集本研究中NDDs患兒外周血2 mL。采用提取試劑盒(QIAamp@DNA Blood Mini Kit)提取全基因組DNA，并于-20 ℃環境中儲存備用。染色體微陣列分析檢測將5 μL全基因組DNA用NspI酶隨機消化為短片段，消化后產物末端補齊，連接上共同引物。將上述處理后樣本DNA擴增為150～2 000 bp的片段，將擴增產物通過磁珠法純化。將純化產物通過片段化酶片段化為25～125 bp的片段，連接上生物素標記。將標記后產物與雜交液混合均勻并變性后加載于美國Affymetrix公司的CytoScan750K芯片(包括550 000個非多態性CNV探針和200 000個SNP探針)，置于雜交儀中(Genechip hybridization oven 645)50 ℃，60 r/min，雜交16～18 h后，置于洗滌工作站(GeneChip@FluidiesStation450Dx v.2)洗滌并染色。將洗滌后芯片置于掃描儀(GeneChip@Scanner 3000Dx v．2withAutoLoader)中掃描，獲取數據并加載于配套ChASv3.0軟件后利用相關的生物信息學方法分析檢測結果。

1.4.2 CMA數據分析及結果判讀 選擇芯片識別的≥200 kb的微缺失和≥500 kb的微重復且可信度≥90%的片段利用各種生物信息學數據庫進行分析。相關數據庫主要包括人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance In Man，OMIM，https://www.omim.org/)、國際公共良性CNVs數據庫(Database of Genomic Variants，DGVs，http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、人類基因組變異和表型數據庫(Database of genomic variation and Phenotype in Humans using Ensembl Resources，DECIPHER，http://decipher.Sanger.Ac.uk/)，人類遺傳學細胞遺傳學微陣列委員會在線數據庫(International Standard Cytogenomic Array Consortium，ISCA，http://www.iscaconsortium.org/)、美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/)等。根據美國醫學遺傳學和基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)對CNVs解釋的標準和指南[10]，按照臨床意義將所有檢測到的非多態性CNVs分成以下5類：(1)致病性CNVs；(2)可能為致病性CNVs；(3)臨床意義未知CNVs；(4)可能良性CNVs；(5)良性CNVs。

2 結果

2.1 CMA檢測出的CNVs 利用750K芯片對100例DD/ID及ASD患兒進行了檢測，結果顯示22例(22.00%，22/100)患兒檢測到染色體拷貝數變異，攜帶病理性及可能致病CNVs患兒14例(14/100,14.00%)，共涉及17個致病性及可能致病性CNVs，包括14個微缺失(1q21.1q21.2、6p22.3、7q11.23、7q11.23、7q31.1、8p23.3p23.1、9q34.3、10q26.13q26.3、15q11.2q13.2、15q11.2q13.1、15q11.2q13.1、Xp22.32p22.31、Xp22.33p11.23、Xq21.1q28)；3個微重復(2q36.3q37.3、9q34.12q34.3、8q24.23q24.3)(見表1)，檢出率達14.00%。攜帶臨床意義未知CNVs的患兒有8例(8/100,8.00%)。78例患兒染色體未見明顯異常，所有樣本的檢測成功率為100%。

表1 CMA檢測結果[n;百分率(%)]

對45例DD/ID患兒進行CMA檢測發現12例病理性或可能致病性CNVs，檢出率為26.67%，其中男3例，女9例。12例DD/ID患兒中檢測出的14個病理性及可能致病性CNVs，其中12個染色體微缺失，2個染色體微重復(見表2)。同時在對55例ASD患兒CMA檢測中發現2例病理性及可能致病性CNVs，檢出率為3.64%，其中男1例，女1例。在2例ASD患兒中檢測出的3個病理性CNVs包含2個染色體微缺失，1個微重復(見表3)；病理性及可能致病性CNVs中發現與神經發育相關的OMIM基因有MCPH1、CLN8、TRAPPC9、GPAA1、PUF60等。

表2 DD/ID病人中CMA檢測結果為病理性及可能致病CNVs

表3 ASD病人中CMA檢測結果為病理性及可能致病CNVs

對8例臨床意義未知病例進行CMA檢測發現10個臨床意義未知CNVs，包括4個微缺失(3p22.2、5q33.3、7q34、22q13.2)，6個微重復(2q21.3q22.1、16q24.3、19q13.42q13.43、Xq11.2q12、Xq26.2、Yq11.223q11.23)(見表4)。在這些患兒中發現與神經發育相關的OMIM基因，分別是BRAF、ANKRD11，FANCA、AMER1、GPC3。

表4 臨床意義未知CNVs

2.2 CNVs染色體分布 檢測出2例ASD患兒的病理性CNVs,分別分布在8號、X染色體上，其中1例患兒在8號染色體上同時發現缺失片段及重復片段。12例DD/ID患兒檢測出的病理性及可能致病性CNVs分布在1號、2號、6號、7號、9號、10號、15號、X號染色體上。其中3例患兒病理性及可能致病性CNVs分布在15號染色體上，3例患兒病理性及可能致病性CNVs分布在7號染色體上。2例患兒病理性及可能致病性CNVs分布在9號染色體上，2例患兒病理性及可能致病性CNVs分布在X染色體上。1例患兒X染色體上發現2個缺失片段。在8例患兒檢測出的臨床意義未知的CNVs分布在2號、3號、5號、7號、16號、19號、22號、X、Y染色體上。其中1例患兒分別在3號、5號、7號染色體上發現缺失片段。2例患兒臨床意義未知CNVs分布在X染色體(見圖1)。

1例診斷為DD的患兒，CMA技術檢測的致病性CNVs分析圖見圖2，該片段有兩處缺失，分別是：arr[hg19]Xp22.33p11.23(168,551 -46,489,686)x1，大小為46.3 Mb，包含OMIM基因數156個；arr[hg19]Xq21.1q28 (82,441,085-155,233,098)×1，大小為72.79Mb，包含OMIM基因數304個，患兒為女孩，7個月大，表現發育遲緩。

1例診斷為DD的9q34.3微缺失綜合征患兒，CMA技術檢測的致病性CNVs分析圖見圖3，該片段有一處缺失：arr[hg19] 9q34.3(140,434,785-141,018,648)x1，大小為0.58 Mb，包含OMIM基因數6個。患兒為女孩，14個月大，表現發育遲緩。

3 討論

隨著二胎政策的放開，高齡產婦的增多，孕期暴露風險因素的可變性，越來越多的家庭迎來了第二個寶寶的同時NDDs兒童的數量也在逐年增長，NDDs的發病率因疾病類型不同差異較大，但整體受累人群比例較高。以ASD為例，全球人口發病率約為0.6%[15]，因我國人口眾多，NDDs對我國兒童的健康帶來巨大的威脅，且至今無有效的治療方法，不僅給家庭帶來經濟負擔和心理負擔，也給社會帶來沉重負擔，同時嚴重影響人口素質。CNVs是導致DD/ID及ASD等NDDs發病的遺傳學因素之一，而目前西方發達國家對CNVs的研究主要采用CMA技術，該技術已成為DD/ID、多發畸形及ASD等疾病的一線診斷實驗[10]，但CMA技術在我國起步較晚，本研究旨在探討CMA技術在發掘NDDs遺傳學因素中的應用，同時為本地區建立一套完整的基因診斷路徑，為以后兒科遺傳疾病的遺傳分析提供指導。

染色體異常和基因組相關的微缺失微重復是NDDs患兒重要的遺傳學病因，常染色體顯性遺傳占智力障礙或全面發育遲緩比例為13%～39%[2]，新生突變是導致重度智力障礙或全面發育遲緩的重要病因[16]。常染色體隱性遺傳占智力障礙或全面發育遲緩比例為10%～20%[17]。本研究顯示，CMA對ASD患兒的分子診斷率為3.64%，CMA對DD/ID患兒的分子診斷率為26.67%,診斷水平高于有研究[18]已報道的CMA對DD/ID分子診斷率14.7%；低于CMA對ASD分子診斷率12%，高于劉欣等[3]已報道的CMA對DD/ID分子診斷率26.3%。分析原因主要為兩個方面，一是納入標準不同，劉欣等的納入標準為診斷為ASD、DD/ID、學習障礙、注意力缺失/多動癥(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)的患兒及部分伴有面容異常或多發畸形的患兒，納入病種比本研究多樣。二是地域之間的差異。該結果對本地區的NDDs患兒臨床分子診斷，干預方面具有指導意義。

本研究在101例NDDs病人中檢出的18個病理性及可能致病性CNVs中包括3個已知的NDDs致病性熱點區域，即1q21.1q21.2、15q11.2q13.1、7q11.23，與國外已報道的情況[18]類似，說明這些已鑒定的熱點變異同樣在我國兒童NDDs的發生中發揮重要作用。對檢測結果為臨床意義未知CNVs的8個病例中，4例患兒發現了與已報道的神經發育相關的基因變異，分別是：BRAF、ANKRD11、FANCA、AMER1、GPC3。WU等[19]報道Noonan綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，主要臨床表現為先天性心臟病、身材矮小、特殊面容、發育遲緩、凝血功能障礙、骨骼畸形等，BRAF基因新生突變導致Noonan綜合征的發生。SACHAROW等[20]報道ANKRD11 基因突變所致KBG 綜合征,以廣泛發育遲緩(語言發育遲緩尤為突出)、顱面異常、上頜中切牙過大和骨骼異常為特征的罕見常染色體顯性遺傳性疾病。值得注意的是，人種間基因組的差異可能導致同一致病性位點在不同人群中的發生頻率出現明顯差異，比如Phelan-McDermid綜合征相關位點22q13微缺失在中國ID患兒中的發生明顯高于西方(1.7%和0.24%)[21]。這一現象表明建立我國患兒NDDs致病性CNVs譜系數據庫對有效開展相關領域研究的重要性和必要性。

我們對DD/ID病人檢出的14個致病性CNVs分析發現與XU等[18]已報道的一些經典的綜合征位點如1q21.1q21.2、15q11.2q13.1、7q11.23相吻合。另外，我們還發現1例X染色體異常的發育遲緩患兒；人類全基因組有25 000個功能基因(目前仍在增加中)，其中X染色體上有829個，僅占人類基因組基因的3.3%，然而10%～15%的精神發育遲滯與X染色體基因/基因組變異有關[22]，所以本例中的發育遲緩患兒可能與其染色體異常密切相關。另外我們還發現1例9q34.3微缺失綜合征，研究[23]表明9q34.3微缺失綜合征主要臨床表型包括智力低下、發育遲緩、語言發育障礙、肌張力低下、特殊面容(如眼距增寬、鼻孔前傾、濃眉)，部分病人可能出現新生兒喂養困難、食管反流、癲癇、心臟畸形及肥胖表型[23]。本研究中的9q34.3微缺失綜合征患兒有相似癥狀。另外9號染色體上不同區段的重復臨床表型也會不同，9p22.1-p22.3區域重復與特殊面容有關，9p21.2-21.3區域重復與語言發育落后有關，9p22.3-24區域的重復與智力低下有關[24-25]。

ASD病因復雜，近年來研究[26-27]發現，CNVs在ASD病因中的構成比為10%～20%。靜進等[28]研究發現ASD病人染色體異常包括2q24缺失、3p14缺失和重復、1p36缺失、3q27～3q28缺失、7p21缺失等，涉及的易感基因包括MET、RELN、FOXP2、NRP2、PTEN、TsC1/Tsc2等。另外有多項研究發現EN2、RELN、NRP2、OXTR、GluR6和FOXP2基因的突變或多態性可能與中國人的ASD有關[29]。該研究中對ASD患兒檢測出2例染色體異常包含3個CNVs分別是：8p23.3p23.1缺失、8q24.23q24.3重復、Xp22.32p22.31缺失。其中1例患兒在8號染色體上同時發現缺失片段及重復片段。與神經發育相關的OMIM基因有：MCPH1、CLN8、TRAPPC9、GPAA1、PUF60、NLGN4。DUERINCKX等[30]的研究表明常染色體隱性智力缺陷(Autosomal recessive intellectual disability，ARID)是智力缺陷的非常不同的亞組，而TRAPPC9和MCPH1的每個突變都會導致一種ARID。LOW等[31]研究發現12例病人中觀察到的臨床和分子數據表明PUF60的變異導致以身材矮小為特征的綜合征，發育遲緩、面部畸形等。還有學者[32]報道了5個新發的PUF60變異與偶發的ID患兒常見先天性異常相關的。基于以上研究，我們認為TRAPPC9、MCPH1和PUF60可能是導致ASD發病的原因，關于他們的致病機制需要進一步研究。