宮頸細胞學p16INK4a蛋白檢測聯合細胞學檢測在宮頸癌篩查中的價值

劉湛秋，何 玉，許 馳，胡曉文，王 麗，駱欣敏

近年來，宮頸癌的發病率和死亡率仍呈上升趨勢，且發病年齡呈年輕化趨勢[1]。為了盡早發現癌前病變，降低宮頸癌的發病率，有必要找出宮頸癌早期診斷的生物標志物。理想的篩查方法應該識別更多的癌前病變，并盡可能減少陰道鏡的轉診率。目前宮頸癌篩查方法主要有細胞學檢測、人乳頭瘤病毒(HPV)檢測及兩者聯合檢測，但細胞學檢測缺乏敏感性，且易受閱片醫師的主觀影響；HPV檢測缺乏特異性，不能甄別“持續性”高危型HPV(HR-HPV)感染這一宮頸癌發生的必要因素，較高的陽性率可能導致不必要的轉診和治療。p16INK4a蛋白作為誘導細胞周期阻滯的一種細胞周期調節蛋白，被認為是HR-HPV持續感染的一個生物標志物，能夠預測宮頸高級別上皮內病變的存在[2]。本研究以醫院門診人群為基礎，同時行液基薄層細胞學(TCT)、HPV及p16檢測，比較并探討p16、HPV、TCT單獨及聯合檢測對宮頸高級別上皮內瘤變和宮頸癌的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年5-8月于我院婦科門診就診要求行宮頸癌篩查的受檢者790例，同時進行HPV、TCT和p16檢查。納入標準：年齡20～70歲，有性生活史，非妊娠狀態，無宮頸手術史(如宮頸錐切術、宮頸切除術)，同意采集用于本研究的宮頸上皮脫落細胞及宮頸組織。所有受檢者均簽署知情同意書，并通過我院倫理委員會審查。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采集標本前24 h內禁止性生活、陰道檢查及陰道用藥，先將宮頸表面分泌物拭凈，將細胞刷置于子宮頸管內，旋轉5～8圈后取出，將附著于小刷子上的標本置于保存液中。

1.2.2 HPV分型檢測 HPV分型檢測試劑盒(廣州安必平醫藥科技有限公司)，包括高危HPV分型：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59及66型，和低危HPV分型：HPV68、CP8304、6、11、43、73、82、26、40、42、44、54、61及83型。

1.2.3 TCT檢測 采用全自動制片系統制作薄層涂片，由細胞學醫生采用TBS分級法進行細胞學閱片，其結果判斷為未見上皮內病變細胞和惡性細胞(NILM) 時定義為陰性，當判讀為意義不明的不典型鱗狀細胞(ASCUS)及以上時定義為陽性。

1.2.4 p16檢測 采用廣州江元醫療科技有限公司生產的全自動免疫細胞獨立溫控單獨滴染染色機和配套的p16抗體檢測試劑盒(免疫細胞化學法),按步驟依次完成。普通光學顯微鏡下,整張涂片：上皮細胞細胞質(或伴細胞核)染為黃棕色5個及以上為陽性，上皮細胞的細胞質及細胞核未見黃棕色或染為黃棕色小于5個為陰性(見圖1、2)。所有標本均由2名經驗豐富的細胞學診斷醫師閱片診斷。

1.2.5 陰道鏡檢查及病理學診斷 任一檢測結果陽性以及檢測均陰性但有明顯臨床癥狀高度懷疑宮頸病變者轉診陰道鏡及定位活檢。由有經驗的婦科醫生操作，在子宮頸和陰道壁的異常區域進行2～4點活檢，未見病變則對在宮頸外鱗柱交界處的隨機活檢，對于細胞學提示腺體病變、鱗柱交界不完全可見或Ⅲ型轉化區，則進行宮頸搔刮術(endocervical curettage,ECC)。活檢或ECC標本送至我院病理科進行診斷。組織病理學分為宮頸慢性炎、宮頸低級別鱗狀上皮內病變(LSIL)、宮頸高級別鱗狀上皮內病變(HSIL)和宮頸癌；宮頸上皮內瘤變(CIN)1歸為LSIL，CIN2-3歸為HSIL。

1.2.6 計算公式 靈敏度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%,陽性預測值(PPV)=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%,陰性預測值(NPV)=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%，準確率=(真陽性例數+真陰性例數)/總例數×100%,假陽性率=假陽性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%，約登指數=靈敏度+特異度-1。

1.3 統計學方法 采用χ2檢驗和χ2趨勢檢驗，采用受試者工作特征 (ROC) 曲線對各種篩查方法的診斷能力進行評價。

2 結果

2.1 篩查結果 790例受檢者中，HR-HPV陽性率為25.6%(202/790)，TCT陽性率為16.3%(129/790)，p16陽性率為14.6%(115/790)，任一篩查陽性者共270例，三者均陰性但有明顯臨床癥狀者17例(均行陰道鏡活檢，其中16例病理診斷為慢性炎，1例為LSIL)，共召回210例女性行陰道鏡活檢，組織病理診斷為慢性炎131例、LSIL 41例、HSIL30例及宮頸癌8例。在HSIL及以上病變中，HPV陽性34例(89.5%)，TCT陽性29例(76.3%)，p16陽性33例(86.8%)。其中HPV16/18陽性率(67.6%，23/34)與非HPV16/18陽性率(32.4%，11/34)比較，差異有統計學意義(χ2= 8.47，P<0.05)；在非HPV16/18陽性HSIL及以上病變中，HPV33(54.5%，6/11)和HPV52(36.4%，4/11)較多(見表1)。

2.2 HPV、TCT和p16檢測在不同級別宮頸病變中的陽性表達情況 隨著宮頸病變程度的加重，HPV、TCT和p16 陽性率呈趨勢性增加(P<0.05～P<0.01)(見表1)。通過配對樣本McNemar檢驗可知，在宮頸慢性炎及LSIL中，p16陽性率分別低于HPV陽性率和TCT陽性率，差異均有統計學意義(P<0.05)。在HSIL及以上病變中，三者陽性率差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 不同級別宮頸上皮內病變各指標陽性率比較[n；百分率(%)]

2.3 HPV、TCT以及p16單獨及聯合篩查的臨床效果評價 790例篩查女性中，去除篩查陽性但未行陰道鏡檢查者77例，最終納入713例受檢者進行宮頸癌篩查效能的比較。p16、HPV、TCT檢測診斷HSIL及以上的靈敏度分別為86.8%、89.5%和76.3%，特異度分別為91.9%、80.3%和88.1%。p16+TCT、HPV+TCT、p16+HPV檢測的靈敏度分別為92.1%、94.7%和97.4%，特異度分別為85.6%、77.5%和78.8%(見表2)。

表2 以HSIL及以上為終點時，p16、HPV、TCT單獨篩查以及兩兩聯合篩查的臨床效果評價

續2

2.4 HPV、TCT、p16單獨及聯合篩查檢出HSIL及以上病變的價值 HPV、TCT、p16單獨及聯合診斷宮頸HSIL及以上病變的ROC曲線見圖3。由ROC曲線分析可知，HPV、TCT、p16、HPV+TCT、p16+HPV、p16+TCT診斷宮頸病變的曲線下面積分別為0.849、0.822、0.893、0.861、0.881、0.889，各指標對宮頸病變的診斷價值均有統計學意義(P<0.01)(見表3)。

表3 HPV、TCT、p16單獨及聯合篩查診斷宮頸HSIL及以上病變的ROC曲線分析

3 討論

宮頸癌是世界范圍內婦科常見的惡性腫瘤之一，同時它也是世界上唯一病因明確，可通過早期篩查、治療消滅的惡性腫瘤。2019年WHO公共衛生項目提出到2030年實現90%HPV疫苗接種覆蓋率、70%篩查覆蓋率和90%宮頸病變治療率的目標，到本世紀末，在全球范圍內消除宮頸癌戰略[3]。然而，目前宮頸癌篩查方式仍存在許多不足，有研究[4-5]發現p16INK4a蛋白作為一種分子生物標志物，對宮頸癌前病變和宮頸癌的診斷具有較高的靈敏度和特異度。在有HR-HPV感染的細胞中，病毒癌蛋白E7與宿主基因組整合并與pRb(視網膜母細胞瘤蛋白)結合，破壞其與E2F(轉錄因子)結合，從而加速細胞周期失調。pRb功能失活會通過負反饋作用機制導致p16蛋白過表達[6]。p16蛋白的高表達與E7蛋白的激活存在緊密的關系[7]。此外，PRIGENZI等[8]研究認為p16高表達與HR-HPV持續感染密切相關。本研究結果顯示，p16陽性率隨著宮頸病變的進展呈上升趨勢，宮頸病變的程度越高，p16在細胞內表達越多，這與WENTZENSEN等[9]的研究結論相似。

MARIAM等[10]研究結果顯示，P16/Ki-67雙染檢測診斷CIN2+和CIN3+的靈敏度為80.7%和86.8%，低于HPV檢測(89.9%和92.3%)，但特異度明顯高于HPV檢測(64.0%&56.1%；54.0%&44.4%)。本研究顯示，在宮頸癌篩查中，在以宮頸HSIL和以上病變為終點時，p16檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確率和假陽性率分別為86.8%、91.9%、37.5%、99.2%、91.6%和8.1%，其特異度和準確率明顯高于HPV檢測，假陽性率明顯低于HPV檢測，其ROC曲線下面積為0.893，提示具有較好的診斷HSIL及以上病變的價值。本研究中，單獨p16檢測對篩查HSIL及以上的特異度和準確率均高于單獨HPV和TCT檢測，其敏感性近似于HPV與既往臨床認知略有出入[5，10-11]，可能與研究樣本量偏少有關，有待更大范圍的研究驗證。

HPV檢測對宮頸癌初篩非常敏感，但特異性較低，需要提高特異性但保持高敏感性的分流檢測。賈漫漫等[12]研究認為p16/Ki67雙染檢測用于HPV陽性婦女分流措施的效果優于HPV16/18檢測和細胞學檢測。越來越多的研究[13-15]表明，p16在區分HSIL和LSIL以及從HR-HPV的一過性感染和持續感染中的區分起著重要作用。CUZICK等[16]對1 091例HPV陽性婦女同時進行了細胞學、p16和基因分型檢測，結果顯示p16或細胞學陽性(≥LSIL)的婦女診斷CIN2+的敏感度高達97.8%，而兩者均陰性的婦女，三年內CIN3+的風險低至0.2%。表明p16結合細胞學用于HPV陽性婦女的分流在保持很高敏感性的同時，降低陰道鏡的轉診率，并使短期內需要重復進行檢測的婦女人數大幅度降低。本文研究了p16聯合TCT檢測篩查CIN2+的靈敏度為92.1%，略低于HPV聯合TCT檢測(94.7%)、p16聯合HPV檢測(97.4%)，但p16+TCT檢測的特異度為85.6%，顯著高于HPV聯合TCT檢測(77.5%)、p16聯合HPV檢測(78.8%)。提示細胞學聯合p16檢測可能作為一種宮頸癌初篩的方法。

細胞學p16檢查作為一種新型宮頸癌篩查技術，操作簡單，陽性細胞在顯微鏡下易于辨認，根據顏色差異即可快速識別異常細胞，受閱片醫生主觀因素影響小，具有更好的可重復性和準確性，用于宮頸癌篩查兼具高靈敏度和高特異度，適合在各個層級的醫院開展，尤其適用于經濟欠發達、嚴重缺乏細胞學醫生的地區。WU等[17]報道，p16免疫化學染色在宮頸脫落細胞中不僅可以用作宮頸腫瘤細胞學診斷的輔助工具，而且還有助于對在 LSIL以及良性反應性改變的病例中鑒別診斷出HSIL病變的病例。本研究結果顯示，p16聯合TCT檢測在宮頸癌篩查中對于宮頸高級別病變及宮頸癌的診斷價值與HPV聯合TCT檢測相比，具有相似的敏感性和更高的特異性。細胞學p16檢測不僅可以作為宮頸癌篩查的輔助診斷，與常規細胞學相結合，可彌補細胞學漏診這一弊端，優化篩查策略，提高了篩查效率，降低陰道鏡的轉診率，實現CIN的精準分級，具有在臨床上推廣使用的潛能。