兒童急性呼吸窘迫綜合征CD4+T細胞亞群格局及其影響研究

金載璇，吳 斌

兒童急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是臨床常見的危急重癥，多由嚴重感染、創傷等因素誘發，主要以難治性低氧血癥為特征。由于病死率較高，已成為嚴重威脅重癥患兒生命的主要原因。研究[1-2]表明，各種炎性細胞活化，導致促炎與抗炎因子的失衡，所誘發的免疫炎癥反應是ARDS產生的重要原因。其中，Th17/Treg細胞之間的平衡在免疫炎癥性疾病的發生發展中發揮重要作用[3-4]。研究[5]發現，ARDS病人肺泡灌洗能夠減少外周血中性粒細胞的凋亡，上述過程與腫瘤壞死因子-α、白細胞介素(IL)-10、IL-8、粒細胞集落刺激因子等促炎因子有關，調控著CD4+T細胞，Th17和Treg細胞的增殖、分化，而Th17、Treg細胞成熟并被激活后又進一步產生相應炎癥因子，促進了ARDS的發生發展，上述過程形成了一個相互作用的炎癥網絡。因此，探討ARDS中CD4+T細胞的亞群及其功能對于影響ARDS的發生發展，緩解炎性損傷具有重要意義。

根據CD4+T細胞亞群分泌的細胞因子的類型及效應的不同，可將其分為IFN-γ+Th1、IL-4+Th2、IL-17+Th17以及Foxp3+Treg。上述細胞因子在ARDS炎性反應發病中的分布格局及貢獻度鮮見研究。本研究分析了CD4+T細胞亞群在ARDS中的格局變化，并評估了其在ARDS發病中的影響?，F作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年3月至2019年10月我院兒科ICU收治的ARDS患兒61例，其中男37例，女24例；均符合2015年版“兒童急性呼吸窘迫綜合征：兒童急性肺損傷會議共識推薦”中制定的診斷標準[6]，同時排除存在心力衰竭、肺動脈高壓、彌散性肺出血患兒，以及存在先天性遺傳代謝性疾病患兒。兒童ARDS(PARDS)新的診斷標準為：(1)排除有圍生期相關肺部疾病的患兒；(2)發生在7 d以內的已知臨床表現；(3)不能完全用心功能衰竭或液體超負荷來解釋的呼吸衰竭；(4)胸部影像學出現新的滲出性改變與急性器質性肺損傷的表現一致；(5)在無創機械通氣時，面罩BiPAP或CPAP≥5 cmH2O，滿足P/F≤300或S/F≤264，可診斷PARDS；(6)在有創機械通氣時，滿足4≤氧指數≤8或5≤OSI<7.5，可診斷輕度PARDS；8≤氧指數<16或7.5≤OSI<12.3，可診斷中度PARDS；氧指數≥16或OSI≥12.3，可診斷重度PARDS。將ARDS患兒分為輕度(25例)、中度(20例)和重度(16例)。同時，選取同期同性別、同年齡的61名健康查體兒童作為對照組，對照組兒童身體健康，近1個月內未發生感染、過敏性疾病，且沒有免疫抑制劑治療史，血、尿常規檢查均在正常范圍正常。ARDS組和對照組兒童性別與年齡分布見表1。所有研究對象的監護人對本研究均知情同意，并簽署知情同意書，并經我院醫學倫理委員會審核批準開展。

表1 ARDS組和對照組兒童性別與年齡分布

1.2 主要儀器和試劑 BD CantoⅡ流式細胞分析儀(BD公司)及其提供的配套試劑。

1.3 CD4+T細胞亞群的檢測 ARDS患兒入科病程第1天，健康體檢兒童按預約清晨抽取外周空腹肘靜脈血2 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，按照標準操作規程操作，避光孵育后，采用流式細胞術檢測T細胞絕對數量及Treg、Th17、Th1和Th2占CD4+T細胞的比例。

1.4 細胞因子的檢測 采用Real-timePCR檢測患兒CD4+T細胞亞群的標志性細胞因子的表達。ARDS患兒入科病程第1天，健康體檢兒童按預約清晨抽取外周空腹肘靜脈血2 mL，置于生化管中離心分離血清，采用試劑微球代替紅細胞與細胞因子結合，通過標準曲線檢測患兒血清中IL-4、IFN-γ、IL-17A及IL-17F的水平。

1.5 危重評分評估 包含 10 項生理參數，總分 100 分，評分越低，患兒病情越危重，≤70分為極危重，>70～80分為危重，>80分為非危重[7]。觀察并記錄各組患兒額心率及收縮壓等指標變化，評分越低，提示其病情程度越嚴重。

1.6 統計學方法 采用t檢驗、方差分析和Spearman相關分析。

2 結果

2.1 ARDS患兒與對照組T細胞總量及Th1、Th2細胞的變化 與對照組比較，ARDS患兒T細胞總量、Th1、Th2均明顯升高(P<0.01)；3指標在ARDS組不同程度之間的比較顯示，Th1指標為重度高于輕度(P<0.05)，Th2指標為重度高于中、輕度(P<0.05)和(P<0.01)，T細胞總量和Th1/Th2比例在不同程度組間差異均無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 ARDS患兒與對照組T細胞總量及Th1、Th2細胞的變化

2.2 ARDS患兒與對照組Treg、Th17及Th17/Treg的變化 與對照組比較，ARDS患兒Th17細胞數量、Treg細胞和Th17/Treg比例均明顯升高(P<0.01)。3個指標在ARDS組不同程度之間的比較顯示，均為重度的高于輕、中度(P<0.05～P<0.01)，輕、中度之間差異無統計學意義(P>0.05)(見表3)。

表3 ARDS患兒與對照組Treg、Th17及Th17/Treg的變化

2.3 ARDS患兒與對照組CD4+T細胞標志性細胞因子的變化 ARDS組患兒中IL-4、IFN-γ、IL-17A及IL-17F水平明顯高于對照組(P<0.01)，而且隨著疾病程度的加重，4個因子的水平呈升高趨勢(P<0.01)(見表4)。

表4 ARDS患兒與對照組CD4+T細胞標志性細胞因子的變化

2.4 ARDS患兒外周血CD4+T細胞亞群相關細胞因子與病情嚴重程度的相關性 ARDS患兒外周血IL-4、IFN-γ、IL-17A及IL-17F水平與小兒危重病評分評分均呈負相關關系(rs=-0.933、rs=-0.910、rs=-0.946、rs=-0.930，P<0.01)。

3 討論

ARDS是指由嚴重感染、休克、創傷及燒傷等疾病誘導的肺組織出現彌漫性的炎性損傷及炎性水腫為主要病理特征的臨床危重癥。臨床可出現肺容積降低、肺順應性下降、嚴重通氣/血流比例失調為主的進行性低氧血癥和呼吸窘迫等表現。目前，ARDS發病機制尚不清楚，機體的促炎反應與抗炎反應的失調可能與ARDS的發病密切相關。當機體受到各種因素刺激后，可導致炎性細胞在內皮細胞表面黏附，引起血管內皮的損傷，最終產生大量炎性細胞因子的釋放[8-9]，肺毛細血管通透性增加，肺組織發生炎性水腫等病理改變。但具體的炎癥調控機制尚不明確。CD4+T淋巴細胞亞群在多種炎癥性疾病的發生發展中均發揮重要作用，本研究推測，ARDS的炎性因子損傷過程可能與CD4+T淋巴細胞亞群的變化密切相關。

Th細胞在正常機體中處于前體狀態，當受到外界特異性抗原的刺激下，可分化為Th1細胞和Th2細胞兩個亞群，Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ及TNF-α，參與機體的細胞免疫；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5及IL-6等，參與機體的體液免疫。研究[10-11]發現，當肺組織受到創傷、手術等外界刺激后，可出現以Th2為優勢的Th1/Th2比例的失衡，導致以抗炎細胞因子分泌增多的免疫抑制現象，導致機體IgE增高，氣道出現高反應性，肺組織炎性損傷加劇。本研究結果顯示，與對照組比較，ARDS患兒T細胞總量、Th1、Th2均顯著升高，且Th2升高更顯著，Th1/Th2比例降低，且病情越重，Th1、Th2細胞變化越顯著(P<0.05～P<0.01)，同時，Th1、Th2細胞亞群的相關細胞因子也出現了相應的趨勢，提示外周血Th1細胞和Th2細胞亞群可能參與了ARDS患兒的病理生理發病過程。

同時，Th17細胞亞群也是CD4+T細胞亞群的重要一員，參與了類風濕性關節炎、自身免疫性心肌炎等多種炎癥性疾病的免疫損傷過程[12-13]。Th17細胞具有強大的促炎作用，主要通過分泌IL-17、IL-21及IL-6等促炎細胞因子發揮作用。在TGF-β1和IL-6作用下，CD4+T細胞可被活化并轉化為Th17細胞，Th17細胞可促進其主要效應因子IL-17的分泌，促進免疫應答的發生，參與炎癥性腸病、哮喘、移植排斥等多種炎癥性疾病的病理過程。Treg細胞是發揮免疫抑制作用的T淋巴細胞亞群，主要通過分泌IL-4和IL-10等細胞因子發揮抑制炎癥反應的過程。研究[14]發現，TGF-β1可促進初始CD4+T細胞表達Foxp3，促進其向Treg細胞的轉化，同時，在TGF-β1在初始CD4+T細胞轉化為Th17細胞中亦發揮重要作用，因此，Th17細胞與Treg細胞存在相互轉化的分化過程，可影響對方的增殖、活化，二者之間的平衡直接影響著機體免疫功能的平衡狀態，炎癥的消散和吸收的過程。Th17/Treg平衡在慢性阻塞性肺疾病、兒童膿毒癥的發病中均發揮重要作用。本研究中，我們推測Th17/Treg在ARDS患兒中發揮重要作用，結果顯示，ARDS患兒Th17細胞數量顯著升高，Treg細胞降低，Th17/Treg比例升高，且病情越重，Th17及Treg細胞變化越顯著(P<0.05～P<0.01)，且相關細胞因子也出現了相應的變化，提示Th17細胞在ARDS患兒發病過程中發揮了重要影響。

小兒危重病評分是評估為重癥患兒病情情況和疾病預后的重要指標，在兒科領域被廣泛接受和采納，應用于院前轉運、急診室救治、危重癥臨床研究等多種領域。本研究采用小兒危重病評分評分評估ARDS患兒病情，并與CD4+T細胞亞群相關細胞因子進行相關性分析，結果顯示，ARDS患兒外周血IL-4、IFN-γ、IL-17A及IL-17F水平與小兒危重病評分評分之間呈顯著負相關。提示CD4+T細胞亞群相關細胞因子可在一定程度上反映ARDS患兒的病情變化。