人翼狀胬肉中miR-486-3p的表達及其潛在靶基因的生物信息學分析

徐玉亭，喬 晨，何思穎，董世棲，徐云峰，嚴 明

0引言

翼狀胬肉系角膜緣結膜上皮細胞異常生長和分化所致，其發生發展是一個復雜的過程，涉及細胞增殖、遷移、炎癥浸潤、纖維化、血管生成和細胞外基質分解[1]。最新研究表明，上皮細胞間充質轉化(epithelial mesenchymal transitios，EMT)可能在翼狀胬肉的發病機制中發揮關鍵作用[2-3]。microRNA(miRNA)是一類小分子非編碼RNA，可與靶基因mRNA的3’-UTR 通過完全或非完全堿基互補配對原則結合，進而發揮降解或抑制靶基因mRNA的作用，藉此參與調控機體的生長發育。近年越來越多的研究發現miRNA在人類的多種疾病中起著重要的調控作用[4]。目前已經證實，在翼狀胬肉中差異表達的miRNA有35個，其中有16個表達升高，19個表達降低[5]，這些miRNA均對翼狀胬肉的生長和分化發揮重要調控作用。研究發現miR-486-3p可通過靶向潛在靶基因對疾病的特定通路進行調控，已有研究證實膠質母細胞瘤[6]、肺癌[7]、膀胱癌[8]、宮頸癌[9]等多種疾病中miR-486-3p異常表達，其中miR-486-3p參與了腫瘤的增殖、生長和轉移等病理過程。翼狀胬肉頭部向角膜侵入性生長在某種程度上與膀胱癌及宮頸癌的侵襲式生長類似[10]，據此，我們推測miR-486-3p可能同樣參與了翼狀胬肉的疾病進程。本文擬對翼狀胬肉組織中miR-486-3p的表達情況及其潛在靶基因進行檢測和生物信息學分析，尋找miR-486-3p在翼狀胬肉發生發展中可能的作用機制。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1研究對象及取材選取2018-09/2019-12在武漢大學中南醫院和武漢愛爾眼科醫院就診的初發型翼狀胬肉患者69例69眼，其中男30例，女39例；左眼32眼，右眼37眼；平均年齡61.890±1.315歲。納入標準：(1)確診為原發性翼狀胬肉；(2)均為漢族，無血緣關系；(3)無其他眼部疾病及眼部手術史。排除標準：(1)復發性翼狀胬肉；(2)合并眼部嚴重外傷、眼部感染、白內障、青光眼、急性淚囊炎等病史；(3)合并嚴重精神疾病者。收集術中切除的鼻側結膜下增生翼狀胬肉組織和術眼顳側健康結膜組織，取材大小1.5mm×1.5mm。本研究經武漢大學中南醫院倫理委員會審核批準，并經患者及家屬知情同意。

1.1.2主要試劑及儀器低溫離心機(中國湘儀集團)；CFX96熒光定量PCR儀、普通PCR儀(美國Bio-Rad公司)；RNA保護劑(RNAlaterTM，美國SIGMA公司)；Trizol Reagent、逆轉錄酶試劑盒(miRNA 1strand cDNA Synthesis Kit)；Cham QTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix(中國南京Vazyme公司)；miRNA-486-3p及U6 逆轉錄引物均由中國武漢天一輝遠有限公司合成。

1.2方法

1.2.1組織RNA提取術中采集標本并立即置于RNA保護劑(RNAlaterTM)中，存放于-20℃中。取標本組織60～100mg，用研磨棒研磨徹底，加1mL Trizol，勻漿徹底，轉至EP管，顛倒上下混勻10下，室溫擱置5min。加入1/5體積氯仿(約0.2mL)，充分顛倒混勻15s，室溫異丙醇，混勻后-20℃放置1h(或室溫下放置20min)。4℃下12000r/min離心10min，棄上清，加入(-20℃)預冷的75%乙醇1mL混勻，4℃下7500r/min離心5min，棄上清。開風機干燥20～30min(不能完全干燥)，加入30μL DEPC水，于55℃～60℃水浴8～10min，溶解后測濃度，存于-80℃。

1.2.2逆轉錄及熒光定量miR-486-3p相對表達量測定按照miRNA 1strand cDNA Synthesis Kit試劑盒的步驟對所提取的RNA逆轉錄為miR-486-3p，每個樣本均獨立重復實驗2次。按照Cham QTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix的要求以2.5μL cDNA配制RT-PCR體系，按如下條件進行 PCR反應：95℃進行預變性30s，變性95℃ 3～10s，退火延伸60℃ 10～30s，擴增40個循環。以U6基因作為校正基數，△Ct=目的基因Ct值-U6基因Ct值，采用2-△Ct法計算miR-486-3p的相對表達量。miR-486-3p逆轉錄引物序列：Forward 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’，Reverse 5’-TCGCACTGGATACGACATCCTGTA- 3’；U6內參逆轉錄引物序列：Forward 5’- CTCGCTTCGGCAGCACA- 3’，Reverse 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.3生物信息學分析采用Targetscan 7.1數據庫(http：//www.target-scan.org/)、miWalk3.0數據庫(http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)、miRDB數據庫(http：//www.mirdb.org/)分別對miR-486-3p進行靶基因預測，取3個數據庫所得到的靶基因交集作為miR-486-3p的潛在靶基因；采用DAVID數據庫(https：//david-d.ncifcrf.gov/)對miR-486-3p潛在靶基因進行功能富集分析[GO(gene ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路分析]；采用String網站對miR-486-3p的靶基因進行互作分析(protein-protein interaction，PPI)。

2結果

2.1翼狀胬肉與正常結膜組織中miR-486-3p的表達RT-PCR檢測結果顯示，翼狀胬肉組織中miR-486-3p相對表達量[(6.183±1.366)×10-6]與正常結膜組織中miR-486-3p相對表達量[(7.930±1.394)×10-5]有顯著性差異(t=9.363，P<0.0001)，見圖1。

圖1 翼狀胬肉與正常結膜組織中miR-486-3p相對表達量(Log10) bP<0.01 vs 正常結膜組織。

2.2生物信息學分析結果

2.2.1 miR-486-3p潛在靶基因在Targetscan 7.1數據庫中將物種設置為Human，對miR-486-3p的靶基因進行預測，發現共4 472個靶基因；在miRDB數據庫中對人miR-486-3p靶基因進行預測，發現共879個靶基因；在miWalk3.0數據庫中篩選，得到人miR-486-3p潛在靶基因7088個。通過“http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/”網站繪制Venn圖，如圖2所示，得到 3個數據庫交集靶基因436個，這些潛在靶基因在細胞內的信號傳導通路中具有重要作用。

圖2 miR-486-3p潛在靶基因Venn圖。

2.2.2 miR-486-3p潛在靶基因的GO及KEGG通路分析miR-486-3p的潛在靶基因功能GO分析發現其主要生物學功能(biological process，BP)有221條，主要富集于RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的調控，囊泡介導的轉運、轉錄調控，DNA依賴性RNA代謝過程的調控等過程中；細胞組分(cellular component，CC)主要富集于質膜部分、突觸小體、網格蛋白包被的囊泡、細胞連接、包被的囊泡等；分子功能(molecular function，MF)主要富集于轉錄因子活性、轉錄調節活性、轉錄阻遏物活性、轉錄因子結合、序列特異性DNA結合等，見圖3A。KEGG通路分析氣泡圖顯示，miR-486-3p的靶基因主要富集于神經軸突導向(Axon guidance)通路及溶酶體(Lysosom)通路上,見圖3B。

圖3 miR-486-3p潛在靶基因功能富集及途徑分析 A：miR-486-3p潛在靶基因功能富集直方圖，其中BP表示生物學功能，CC表示細胞組分，MF表示分子功能；B：miR-486-3p潛在靶基因途徑富集氣泡圖。

2.2.3潛在靶基因與miR-486-3p結合位點預測及與Axon guidance通路的關系利用Targetscan 7.1數據庫對miR-486-3p及Axon guidance通路中的靶基因“SEMA6A、PLXNA1、LIMK1、PLXNA2、SEMA3G、MAPK3、SRGAP3、ABL1、EPHB2”進行檢索發現，miR-486-3p與靶基因ABL1和PLXNA1有潛在的結合位點，且潛在靶基因ABL1和PLXNA1主要參與SLIT/Robo和SEMA3A(Semaphorin 3A)/PLXNA1(Plexin A1)等Axon guidance信號通路，見圖4。

圖4 miR-486-3p與靶基因ABL1、PLXNA1預測結合位點及Axon guidance通路圖 A：miR-486-3p與靶基因ABL1、PLXNA1預測的結合位點；B：Axon guidance通路圖。

2.2.4 miR-486-3p潛在靶基因的PPI網絡分析通過String網站對miR-486-3p的436個潛在靶基因進行分析得到PPI網絡，采用Cytohubba插件對網絡的基因互作進行計算分析，根據Degree值進行排名，按照Degree值取排名前50的關鍵基因重新構建網絡圖，發現Degree值較高的基因分別是MAPK3、STAT3、GRIN1、SYK、ABL1，表明這些基因可能與翼狀胬肉的發生、發展有著重要關系，同時發現Axon guidance通路中的關鍵基因ABL1、PLXNA1也分別在Degree值前50的PPI網絡中起著重要的連接作用，見圖5。

圖5 miR-486-3p靶基因的PPI網絡圖 A：PPI網絡圖前50個Hub基因(按照Degree排名)，顏色越深表示其Degree值越大；B：前20個基因的條形圖。

3討論

翼狀胬肉的發生與紫外線照射、長期炎性因子刺激等因素導致的結膜下血管及纖維組織向角膜侵入性生長有關。研究發現翼狀胬肉主要表現為結膜下血管及纖維組織增生，其中結膜下纖維組織增生的機制主要與EMT有關，結膜下新生血管形成的機制主要與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有關[11]。

Axon guidance通路即軸突導向通路，神經軸突到達相應靶組織的發育過程中，依賴周圍環境中具有吸引和排斥作用的導向因子[12]。導向因子與相應的膜受體結合，通過 Ca2+、cAMP、Rho GTP酶信號通路最終引起細胞骨架向相應方向延伸[13]。目前已證實軸突導向因子除了引起神經系統發育外，還參與多種神經系統外的疾病進程，如目前研究較多的神經導向因子Semaphorins、Netrins、Slits家族[14]，其與新生血管的生成有著密切聯系[15]。研究發現神經導向因子Netrin-1因子對多種腫瘤血管的發生、胎盤血管的生成、角膜及視網膜新生血管的生成具有重要的調控作用[16]，神經導向因子Slit通過Slit/Robo信號通路對多種腫瘤及視網膜新生血管均有調控作用[17]，有學者發現Slit2/Robo4蛋白網絡通過抑制VEGF誘導新生血管形成和血管的滲透作用。神經導向因子SEMA因子家族不僅與神經系統、免疫系統、新生血管生成及多種腫瘤的發生及侵襲有密切聯系[18-19]，其家族成員Sema3A可以與VEGF 165競爭NP-1的結合位點從而調節VEGF 165活性，而VEGF 165是血管系統發育早期的重要分子[20]。

目前，翼狀胬肉的治療手段主要是手術切除，但術后高復發率導致了手術的局限性，尋找新的治療方式成為翼狀胬肉治療的研究熱點。miRNA是一類長度為17～22個核苷酸的單鏈非編碼小分子，通過與mRNA的互補序列結合調節基因的表達進而實現對機體生長發育、疾病發生發展的調控[21]。miRNA具有明顯促進血管新生、促進角膜EMT[22-23]和增加基質成纖維細胞數量的功能[2，24]，其與翼狀胬肉的嚴重程度和疾病進展密切相關[25]。因此，尋找與翼狀胬肉相關的miRNA及其靶基因，阻斷其靶基因的作用通路，有望成為小分子藥物治療翼狀胬肉的研究基礎。

miRNA-486-3p已被證實參與多種癌癥的發展，但其與翼狀胬肉的作用關系尚無相關研究。本研究采用基礎研究與生物信息學相結合的方式對miRNA-486-3p及其潛在靶基因進行深入分析，發現miRNA-486-3p在翼狀胬肉組織中表達明顯降低，其潛在靶基因功能主要富集在轉錄、囊泡的轉運等生物學功能上，其KEGG通路主要富集在Axon guidance、溶酶體等通路上，其中Axon guidance通路最具有顯著性意義。本研究通過Targetscan數據庫對miR-486-3p和ABL1、PLXNA1的靶點進行預測，發現其有潛在結合位點，進一步提示miR-486-3p可能通過靶向ABL1和PLXNA1對Axon guidance通路中的SLIT1/Robo和SEMA3A/PLXNA1通路來影響血管內皮細胞的骨架延伸方向，從而對翼狀胬肉的血管生成發揮作用。PPI網絡分析發現ABL1和PLXNA1在Degree排名前50的潛在基因中起著重要的關聯作用，進一步證實ABL1和PLXNA1是通過調控Axon guidance通路中的SLIT1/Robo和SEMA3A/PLXNA1從而對翼狀胬肉的發生、發展產生作用。

本研究結果表明，miR-486-3p在翼狀胬肉組織中差異表達，miR-486-3p可能通過靶向神經軸突導向因子的受體干預受體與神經軸突因子結合，導致結膜下血管異常增生，從而影響翼狀胬肉的發生和發展。本次研究發現翼狀胬肉組織中miRNA-486-3p的表達量降低，并通對miRNA-486-3p靶基因的預測及通路分析發現神經軸突因子與翼狀胬肉存在一定的相關性，該結果對闡明翼狀胬肉的發病機制及治療具有一定的創新性，為翼狀胬肉的分子治療提供了新的理論基礎，但本研究尚需臨床驗證，有一定的局限性，研究結果有待進一步研究證實。