青光眼發(fā)病機(jī)制相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究進(jìn)展

許夢涵，劉 濤

0引言

青光眼(glaucoma)是一組以特征性的視神經(jīng)萎縮和視野缺損為共同特征的疾病，眼壓是其最主要的危險(xiǎn)因素。統(tǒng)計(jì)學(xué)調(diào)查顯示，到2020年全球范圍內(nèi)青光眼的患病人數(shù)可達(dá)到7960萬[1]，青光眼已成為我國最常見的不可逆性致盲性眼病。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)是電信號傳向視神經(jīng)中樞的唯一神經(jīng)元，其進(jìn)行性凋亡與青光眼所表現(xiàn)的視野缺損及視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層萎縮密切相關(guān)。目前臨床中對于青光眼主要依靠藥物和手術(shù)進(jìn)行治療，但并不能完全阻止RGC及軸突的進(jìn)行性損害。近年來，隨著遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展，對于青光眼相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究也趨于深入，對于青光眼的治療也已不再拘泥于眼內(nèi)壓的降低，視神經(jīng)的保護(hù)和再生已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。現(xiàn)將近年與青光眼發(fā)病機(jī)制相關(guān)的熱點(diǎn)信號通路研究進(jìn)展綜述如下。

1 Rho/ROCK信號通路

1.1 Rho/ROCK信號通路的組成及調(diào)節(jié)Rho蛋白屬于Ras超家族，其下游最主要的效應(yīng)分子為ROCK，稱為相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶[2]。Rho包含三種氨基酸序列高度同源的異構(gòu)體：RhoA、RhoB及RhoC。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有兩種異構(gòu)體：ROCK Ⅰ和ROCK Ⅱ，研究顯示ROCK Ⅰ和ROCK Ⅱ在睫狀體和小梁網(wǎng)中均有表達(dá)[3]。ROCK活化可使肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)磷酸化并間接抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)。ROCK被激活以后，將MLC磷酸化而發(fā)生肌絲收縮作用;也可將MLCP磷酸化，使MLCP失活，導(dǎo)致細(xì)胞胞漿內(nèi)MLC磷酸化水平增高，間接促進(jìn)肌絲收縮，而Rho或ROCK抑制劑可抑制MLCP的活性，使平滑肌擴(kuò)張[2]。Rho/ROCK信號通路與小梁網(wǎng)的收縮和舒張、抑制神經(jīng)元凋亡、保護(hù)視神經(jīng)、促進(jìn)視神經(jīng)再生等多種生理功能有關(guān)。

1.2 Rho/ROCK信號通路與青光眼

1.2.1對房水引流的影響眼壓是青光眼最可控的危險(xiǎn)因素，小梁網(wǎng)是房水循環(huán)阻力最大的部位，房水引流通道的阻力增加與原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。小梁網(wǎng)組織具有平滑肌細(xì)胞樣特性，其收縮與舒張影響房水的排出率。平滑肌收縮的程度主要由MLC的磷酸化水平?jīng)Q定，若可通過抑制Rho/ROCK信號通路來調(diào)節(jié)MLCP的活性，改變MLC的磷酸化水平，進(jìn)而改變小梁組織舒張及收縮狀態(tài)，增加房水經(jīng)小梁途徑引流，從而降低眼內(nèi)壓，這也許為POAG的治療提供新靶點(diǎn)。

1.2.2保護(hù)視神經(jīng)研究顯示，正常人的視神經(jīng)乳頭可表達(dá)RhoA、ROCK Ⅰ和Ⅱ，但在青光眼患者中RhoA的表達(dá)顯著提高，這提示Rho/ROCK通路與青光眼視神經(jīng)損傷的機(jī)制相關(guān)[4]。低血流量灌注被認(rèn)為是青光眼視神經(jīng)損害的關(guān)鍵因素。流行病學(xué)研究表明，眼部血液循環(huán)是青光眼病理發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素[5]。ROCK抑制劑可通過緩解血管痙攣，增加機(jī)體血流灌注，以提高視網(wǎng)膜和視神經(jīng)乳頭的血流量，起到保護(hù)視神經(jīng)的作用。

1.2.3抑制視神經(jīng)凋亡，促進(jìn)視神經(jīng)再生在青光眼的發(fā)病機(jī)制中，神經(jīng)營養(yǎng)因子的剝奪、氧化應(yīng)激、膠質(zhì)細(xì)胞的活化、興奮性中毒、蛋白質(zhì)的錯誤折疊等均與RGC的凋亡相關(guān)。有研究顯示，在大鼠視神經(jīng)損傷模型中，球內(nèi)注射RhoA拮抗劑，可促進(jìn)軸突再生和增加RGC存活數(shù)量[6]；在大鼠青光眼模型中，腹腔注射Rho激酶抑制劑可抑制神經(jīng)元凋亡[7]；Tura等[8]還認(rèn)為，ROCK抑制劑可能在一定程度上與降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性有關(guān)，故能夠起到保護(hù)RGC的作用。綜上所述，特異性的Rho/ROCK通路抑制劑在降低眼內(nèi)壓、增加房水外流、保護(hù)視神經(jīng)、抑制RGC凋亡以及改善眼部灌注等方面均起到積極作用。

2 TGF-β/Smad信號通路

2.1 TGF-β/Smad信號通路的組成及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)通過細(xì)胞表面的受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡。在哺乳動物中，TGF-β有三種亞型：TGF-β1、β2、β3[9]。近年來TGF-β2成為青光眼病因研究的熱點(diǎn)因子。TGF-β受體(TβRs)家族包括3型受體：TβR-1、TβR-2和TβR-3[10]。Whitman[11]在果蠅和線蟲中發(fā)現(xiàn)Smad蛋白是TGF-β受體作用的直接底物，是其配體與受體作用信號由胞漿傳導(dǎo)至細(xì)胞核的中介分子。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)存在9種Smad因子,根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能主要可分為三個亞族：受體調(diào)節(jié)型Smad(receptor regulated Smad,R-Smad)，包括Smad 1、2、3、5、8、9;通用型Smad(common partner Smad,Co-Smad)，哺乳動物中僅有Smad 4;抑制型Smad(inhibitory Smad,I-Smad)，包括Smad 6、7。TGF-β與細(xì)胞表面的受體結(jié)合形成異源三聚體，異源三聚體通過磷酸化激活R-Smad，將信號傳遞至胞漿內(nèi)，R-Smad與Co-Smad形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與靶細(xì)胞結(jié)合，細(xì)胞核中的Smad寡聚物與DNA結(jié)合后與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控蛋白質(zhì)的合成及靶基因的轉(zhuǎn)錄。I-Smads可通過受體阻斷R-Smads的磷酸化，促進(jìn)受體復(fù)合物的泛素化和降解，從而抑制信號傳遞[12]。

2.2 TGF-β/Smad信號通路與青光眼人眼角膜內(nèi)皮、虹膜、睫狀體、小梁網(wǎng)均可表達(dá)TGF-β1、TGF-β2的mRNA并轉(zhuǎn)錄[13]。POAG患者眼壓的升高與小梁網(wǎng)組織纖維化反應(yīng)有關(guān)[14]。小梁網(wǎng)是人眼中內(nèi)源性TGF-β2的主要來源[10]。TGF-β/Smad途徑是調(diào)節(jié)人小梁組織細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積的主要通路[15]。Trivedi等[16]研究證實(shí)青光眼患者房水中TGF-β2的表達(dá)濃度遠(yuǎn)高于非青光眼患者，并且隨著年齡的增長，患青光眼的風(fēng)險(xiǎn)增加，可能部分與這種細(xì)胞因子的增加有關(guān)，青光眼患者眼前段的特征性改變與TGF-β2的過度表達(dá)有關(guān)。TGF-β2與小梁細(xì)胞上相應(yīng)的受體結(jié)合后可使小梁組織產(chǎn)生層黏連蛋白、多種蛋白多糖等使ECM蛋白增加[17]。有研究表明TGF-β2可誘導(dǎo)小梁細(xì)胞合成纖溶酶原激活物抑制劑-1(pasminogen activator inhibitor,PAI-1),PAI-1作為金屬蛋白酶組織抑制劑,可間接抑制ECM的降解，從而進(jìn)一步加重ECM在小梁組織的堆積及促進(jìn)小梁網(wǎng)細(xì)胞的凋亡[18]。通過各種機(jī)制導(dǎo)致ECM沉積及降解的減少，均可引起房水流出阻力的增加，致使POAG的發(fā)生。Smad7屬于抑制型Smad蛋白,對TGF-β信號通路起負(fù)調(diào)節(jié)作用。青光眼濾過術(shù)后瘢痕形成是導(dǎo)致手術(shù)失敗的主要原因，TGF-β是已經(jīng)確定的參與瘢痕形成的主要因子，其中TGF-β2與纖維化的關(guān)系最密切。TGF-β可影響結(jié)膜囊成纖維細(xì)胞的生成、膠原合成增加，導(dǎo)致結(jié)膜囊組織纖維化[19]。Smad7可抑制眼球筋膜囊成纖維細(xì)胞合成1型膠原蛋白，從而抑制瘢痕的形成。抑制Smad7的生成、磷酸化均可抑制此通路，可為青光眼濾過術(shù)后瘢痕形成的基因治療提供理論基礎(chǔ)。

Gulab等在TGF-β/Smad與青光眼視神經(jīng)病變的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)TGF-β2可以利用規(guī)范化Smad信號通路來刺激ECM合成人視神經(jīng)乳頭(optic nerve head，ONH)細(xì)胞并進(jìn)行ONH的重塑[20]。ONH存在的主要細(xì)胞類型包括ONH星形膠質(zhì)細(xì)胞和篩板(LC)細(xì)胞。這些細(xì)胞通過合成生長因子(如神經(jīng)營養(yǎng)因子)和ECM蛋白來支持RGC軸突。抑制TβR-1或阻止Smad2或Smad3可逆轉(zhuǎn)TGF-β2刺激合成ECM蛋白質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和LC細(xì)胞。因此，抑制這些下游信號可抑制青光眼ONH中ECM的重構(gòu)。通過調(diào)節(jié)參與TGF-β/Smad通路產(chǎn)生、激活及下游的效應(yīng)因子，或與TGF-β/Smad通路相關(guān)的蛋白酶、整合蛋白等，可為以TGF-β為靶點(diǎn)的青光眼的基因治療提供可能性策略。

3 PI3K/Akt信號通路

3.1 PI3K/Akt信號通路組成及調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶B(serine/threonine protein kinase,PKB；別名Akt)信號通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子參與細(xì)胞凋亡的過程。PI3K是由調(diào)節(jié)亞單位p85與催化亞單位p110組成的異源二聚體蛋白。p85可以通過接受來自酪氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體的信號而被活化。活化的PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基將被聚集到臨近質(zhì)膜的部位，p110亞基通過與p85亞基結(jié)合把底物磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-diphosphate,PIP2)催化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate,PIP3),PIP3可介導(dǎo)PI3K的多種生物學(xué)功能。Akt是PI3K的重要下游分子，是一種可以通過磷酸肌醇被募集到質(zhì)膜而被激活的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶。其氨基末端含有PH結(jié)構(gòu)區(qū)，是與PIP3結(jié)合的主要部位，結(jié)合后Akt將從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶2(PDK2)的輔助下，分別使Akt蛋白上的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)(Thr308)和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(Ser473)磷酸化而使其激活。活化的Akt將轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)一步活化下游的靶點(diǎn),進(jìn)而參與細(xì)胞的生長、增殖與分化[21]。

3.2 PI3K/Akt信號通路與青光眼青光眼RGC的凋亡途徑目前認(rèn)為主要為內(nèi)源性線粒體途徑。Bcl-2是PI3K/Akt信號通路下游的重要效應(yīng)分子，線粒體凋亡途徑中Bcl-2家族蛋白活性與PI3K/Akt信號通路密切相關(guān)。Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，其主要分布的線粒體是Bcl-2家族中抗凋亡因子與促凋亡因子互相作用的核心場所。

眼壓升高時(shí)，RGC內(nèi)的Ca2+含量增加，加重線粒體Ca2+泵負(fù)擔(dān)，引起線粒體膜的去極化和線粒體DNA的突變及損傷，導(dǎo)致線粒體功能障礙和RGC細(xì)胞的凋亡[22-23]。線粒體受損，軸漿運(yùn)輸阻斷使RGC缺血缺氧并釋放大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),刺激細(xì)胞色素C從細(xì)胞磷脂雙分子層通過Bax蛋白孔隙釋放至細(xì)胞質(zhì)中，激活下游的caspases級聯(lián)反應(yīng)，促使凋亡小體形成。有研究表明Bcl-2可通過與Bax結(jié)合，使Bax構(gòu)象發(fā)生改變，阻止細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡過程的啟動[24]。眼壓升高后將激活Ca2+依賴的相關(guān)細(xì)胞凋亡途徑，同時(shí)鈣調(diào)磷酸酶也被激活，進(jìn)一步引起下游caspase-9的激活，導(dǎo)致RGC的凋亡。有研究顯示鈣調(diào)磷酸酶抑制劑可以明顯抑制caspase-9的激活，從而降低神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，同時(shí)Bcl-2高表達(dá)可使鈣調(diào)磷酸酶的活性降低，抑制Ca2+依賴的細(xì)胞凋亡[25]。Almeida等[26]認(rèn)為，Bcl-2可抑制miR-181的表達(dá)，從而保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡，并促進(jìn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突再生。

橋粒芯糖蛋白(DSG)是構(gòu)成細(xì)胞間橋粒的主要蛋白，根據(jù)其遺傳特性分4種亞型：DSG1-4。我們在前期關(guān)于原發(fā)性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma，PACG)家系致病基因定位研究中，通過對先證者家系進(jìn)行WES測序分析，最終篩選得到5個潛在的特異性基因，其中包含DSG1基因[27]。DSG1基因是一種Ca2+依賴型的橋粒跨膜蛋白，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升時(shí)，DSG1即與Ca2+結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，參與細(xì)胞的代謝，同時(shí)作為信號蛋白對細(xì)胞的分化、增殖和壞死凋亡發(fā)揮重要作用。Dusek等[28]研究發(fā)現(xiàn)DSG1是一種新型的caspase和金屬蛋白酶底物，其裂解可能有助于在角化細(xì)胞凋亡過程中橋粒的解體，并揭示了DSG1是以前未被識別的角化細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子。侯傳勝等[29]在有關(guān)前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)DSG2通過PI3K/Akt信號通路在原發(fā)性前列腺癌中發(fā)揮作用并成為原發(fā)性前列腺癌的關(guān)鍵預(yù)后標(biāo)志物。但DSG1與PACG的相關(guān)性研究并不清楚，故我們在后期研究中將利用視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞構(gòu)建突變體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株觀察潛在致病基因的表達(dá)水平和對細(xì)胞功能學(xué)的影響，并進(jìn)一步篩選其調(diào)控機(jī)制和相關(guān)信號通路，最終明確PACG的發(fā)病機(jī)制。

4 Nrf2/Keap1/ARE信號通路

核因子E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，受Keap1的調(diào)控，通過與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)相互作用，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和Ⅱ相代謝酶基因的轉(zhuǎn)錄。ARE是Nrf2蛋白介導(dǎo)適應(yīng)性抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要DNA結(jié)合序列。其含有一特殊性5’端的啟動序列(5-GAGTCACAGTGAGTCGGCAAAATT-3)，該序列能被多種親電性和氧化性化合物激活，從而啟動Ⅱ相代謝酶和抗氧化酶基因的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞組織正常功能。植物源性強(qiáng)的Nrf2誘導(dǎo)劑例如：姜黃素、梔子素等可激活Nrf2信號通路。

Wang等[30]通過模擬高眼壓60min后缺血再灌注模型，定量分析神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的胞體和TUNEL陽性凋亡細(xì)胞，并評估退化毛細(xì)血管的數(shù)量，再通過膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表達(dá)水平檢測膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況，發(fā)現(xiàn)姜黃素有保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)元和微血管免受缺血再灌注的損傷作用。Nrf2介導(dǎo)的信號通路可以保護(hù)氧化應(yīng)激所致的視神經(jīng)退行性病變，Nrf2誘導(dǎo)劑對眼球的細(xì)胞損傷具有保護(hù)性作用，可減輕氧化應(yīng)激引起的RGC的死亡。Koriyama等在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中均證明長效梔子素衍生物能誘導(dǎo)HO-1的產(chǎn)生，從而通過Nrf2-ARE途徑保護(hù)RGC免受氧化應(yīng)激[31]。Yang等通過小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Nrf2在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中對神經(jīng)元和毛細(xì)血管變性具有保護(hù)作用[32]。Feng等[33]在視神經(jīng)損傷小鼠模型中發(fā)現(xiàn)在視神經(jīng)損傷后Nrf2-ARE通路被激活，并在30min時(shí)達(dá)到峰值，并啟動了一系列的視神經(jīng)損傷防御機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)為分析其保護(hù)功能和潛在機(jī)制以及探索針對Nrf2-ARE通路的視神經(jīng)保護(hù)新藥物提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

5 BDNF/TrkB信號傳導(dǎo)通路

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)通過與酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor，TrKB)相互結(jié)合，通過激活下游多個重要信號通路發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。在有關(guān)BDNF/TrkB通路對青光眼治療的影響相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)BDNF/TrkB通路對RGC的生存及其重要，青光眼損傷的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度影響B(tài)DNF和TrkB的表達(dá)，特別是在視神經(jīng)乳頭處；免疫組化分析表明在健康的小鼠眼內(nèi)，視神經(jīng)束和結(jié)締組織中BDNF及TrkB的表達(dá)相對統(tǒng)一，但是在患有青光眼的小鼠視乳頭處存在神經(jīng)束的退化，BDNF和TrkB則在剩下的神經(jīng)束和星形細(xì)胞纖維中堆積。通過構(gòu)建高眼壓小鼠模型和臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在急性視神經(jīng)損傷和青光眼的發(fā)展和反應(yīng)過程中，補(bǔ)充BDNF可以成功地延緩急性視神經(jīng)損傷和青光眼患者的RGC死亡[34]。

6小結(jié)

綜上所述，基于青光眼高發(fā)病率、高致盲率的特點(diǎn)，青光眼相關(guān)信號通路的研究使我們能夠從分子生物和基因水平重新認(rèn)識青光眼的發(fā)病機(jī)制，通過定位相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，探究信號通路中上下游相關(guān)蛋白因子，集藥物、手術(shù)、視神經(jīng)的保護(hù)和再生于一體，有可能在臨床出現(xiàn)青光眼特征性損害前從分子水平做出更早的臨床前診斷，并為青光眼的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。