核桃油對脂多糖誘導小鼠小腸炎性因子TNF-α的影響

繆福俊 單春蘭 耿樹香 寧德魯 王宣軍

(云南農業大學食品科學技術學院1，昆明 650201)(云南省林業和草原科學院2，昆明 650201)

腸道是機體營養消化吸收的最大場所，在維持腸道穩態中發揮了重要作用，然而機體的腸道易受環境、飲食等因素的影響下極易引發腸道炎癥[1，2]。炎癥性腸病(IBD)是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其發病機制尚未完全清楚[3]。細胞因子廣泛存在腸道黏膜中，其中腫瘤壞死因子α(TNF-α)屬重要的促炎因子，其在腸道中的表達水平直接影響腸道炎癥的變化[4]。目前用于治療IBD的主要臨床藥物包括糖皮質激素、TNF-α抑制劑、5氨基水楊酸等，長期服用存在著價格昂貴、毒副作用大、易產生藥物依賴等問題[5]。由于近年來IBD的發病率越來越高，嚴重影響人類的健康，從天然產物中提取安全、低毒或無副作用的功能性成分已成為目前的研究熱點[6]。

核桃是我國傳統的藥食兩用佳品，由核桃仁提煉的核桃油，具有核桃仁大部分的營養保健及藥理功效成分[7，8]。核桃油具有良好的脂肪酸結構(亞油酸∶α-亞麻酸比值接近于4∶1)，富含維生素E、磷脂、角鯊烯、黃酮類等脂溶性化合物，具有抗氧化、抗炎癥、降膽固醇、抗癌、健腦等功效[9-11]。補充α-亞麻酸可保護IBD患者腸壁的完整性，并通過恢復菌群平衡產生抗炎化合物[12]。

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是研究小鼠急性腸道損傷的常用方法之一，LPS經腹腔注射后可透過腸壁引發腸道炎癥，激活Toll樣受體4/核轉錄因子-κB(Toll-like receptor 4/Nuclear factor kappa B，TLR4/NF-κB)信號通路，并釋放炎性因子，其小腸組織中炎癥最為明顯[13，14]。然而，核桃油對LPS誘導的小鼠小腸損傷是否會產生保護作用尚不清楚。因此，本研究利用LPS建立小鼠小腸急性損傷模型，通過檢測小鼠腸道TNF-α表達水平變化，評價核桃油對小鼠腸道損傷的發揮的保護作用。預期研究結果即可為核桃油在機體腸道健康及其疾病的預防治療提供新的思路，又可為后期產品深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠

昆明種雄性小鼠：5周齡，(22±2) g，許可證號SCXK(滇)K2015-0002。普通維持飼料(許可證號SCXK(京)2018-06073)，飼養條件(SYXK(滇)K2018-0008)：溫度為(25±2) ℃，濕度為(40±5)%，12 h日光燈明暗交替循環，自由進食和飲水，適應性飼養7 d。

1.1.2 核桃油

1.1.3 主要試劑

Mouse TNF-α ELISA檢測試劑盒、Trizol、cDNA反轉錄試劑盒、SYBR Green試劑盒、LPS、免疫組化試劑盒，TNF-α抗體。

1.1.4 主要儀器與設備

6YY-280全自動液壓榨油機，ELx800TM酶標儀，RM2135石蠟切片機，BX43F正置顯微鏡，CFX96Touch熒光定量PCR儀，Western blot成套設備。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥

將40只小鼠隨機為4組：對照組(Con)、LPS模型組(LPS)、LPS+核桃油保護組(LPS+WO)和核桃油組(WO)。其中LPS+WO組和WO組灌胃核桃油2.5 mL/kg·d，連續灌胃4周。灌胃后常規飼養，動物自由食水，保持飼養環境清潔。第29天，LPS組和LPS+WO組通過腹腔注射LPS造成急性腸道損傷，劑量為3 mg/kg，LPS溶于無菌生理鹽水。Con組和WO組按5 μL/g腹腔注射無菌生理鹽水。注射6 h后對各處理組小鼠摘眼球血并分離血清，小鼠脫臼處死后，迅速解剖取出結腸組織，進行后續實驗。所有程序遵循中國小動物保護協會的要求。

1.2.2 血清和小腸組織中炎性因子TNF-α檢測

小鼠腸道選取十二指腸組織，根據Mouse TNF-α ELISA檢測試劑盒說明書檢測血清中炎性因子的含量。

1.2.3 腸道組織TNF-α mRNA相對表達檢測

TNF-α引物序列(F-GGCAGGTTCTGTCCCTTTCA；R-CTGTGCTCATGGTGTCTTTTC TG)由某公司合成。根據RNA提取說明書提取十二指腸組織RNA，并檢測OD260/OD280值。根據cDNA逆轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA，-20 ℃保存備用。熒光定量PCR反應體系為：SYBR 10 μL、引物各1 μL、cDNA模版2 μL、ddH2O 6 μL；反應條件為：95 ℃預變性30 s，(95 ℃變性10 s、Tm退火20 s)，40×循環。采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

1.2.4 腸道組織TNF-α蛋白Westen blot檢測

取十二指腸組織經液氮研磨后加入RAPI裂解液，并置于組織破碎儀提取蛋白，離心獲得上清液，經BCA定量檢測蛋白濃度，經SDS-PAGE電泳(60 V，30 min；120 V，80 min)，轉膜(250 mA，50 min)，封閉(5%脫脂奶粉，60 min)，一抗孵育(1∶1 000，4 ℃搖擺過夜)，二抗(1∶5 000，60 min)工序后，在凝膠成像儀中拍照觀察。

1.2.5 腸道組織病理的檢查

取各處理組小鼠十二脂腸組織0.5 cm于4%多聚甲醛固定，經酒精脫水和石蠟包埋后用徠卡切片機進行切片，厚度5 μm。常規脫蠟復水、經蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片后于光學顯微鏡下觀察。

1.2.6 腸道組織TNF-α蛋白免疫組化檢測

十二指腸石蠟切片1.2.5方法制備。根據免疫組化試劑盒說明書進行染色，用兔抗TNF-α多克隆抗體(1∶200)室溫孵育1 h，加入二抗(1∶400)，放置15 min，DAPI復染胞核，甘油封片。組織學觀察采用400倍放大，每張切片連續觀察5個視野，采用Image Pro-Plus 6.0軟件(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)統計各組TNF-α的表達面積。

1.3 統計與分析

實驗數據以平均值±標準差(x±s)表示，采用 SPSS 23.0 統計軟件的 ANOVA 程序進行單因素方差分析。采用鄧肯(Duncan)氏法進行多重比較檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 核桃油對小鼠血清TNF-α的影響

首先檢測了經LPS誘導后各處理組小鼠血清中TNF-α的含量。由圖1可知，與Con組相比，LPS組小鼠血清炎性因子TNF-α含量極顯著升高(P<0.01)。與LPS相比，LPS+WO組TNF-α、含量顯著下降(P<0.05)。WO組中小鼠血液炎性因子水平下調，但與Con組無顯著差異(P>0.05)。表明核桃油能降低LPS誘導的小鼠血清炎性因子TNF-α的水平。

注：不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；尾標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同。圖1 小鼠血清中TNF-α水平

2.2 核桃油對小鼠小腸TNF-α mRNA表達的影響

LPS誘導的小鼠腸道急性損傷在小腸組織中最為明顯，研究了核桃油對小鼠十二指腸TNF-α炎性因子mRNA表達的影響。如圖2所示，與Con組相比，LPS能極顯著上調十二脂腸組織中TNF-α mRNA的轉錄水平(P<0.01)。與LPS組相比，LPS+WO組十二指腸組織中TNF-α mRNA的轉錄水平極顯著降低(P<0.01)。WO組TNF-α mRNA的轉錄水平與Con相比無統計學差異(P>0.05)。表明核桃油能下調小鼠小腸組織中炎性因子TNF-α mRNA的轉錄水平。

圖2 小鼠十二指腸TNF-α mRNA表達水平

2.3 核桃油對小鼠小腸TNF-α蛋白表達的影響

為進一步驗證核桃油對LPS誘導的小鼠小腸組織中TNF-α蛋白表達水平的影響，分別采用免疫組化和免疫印跡方法檢測了各處理組小鼠十二指腸中TNF-α蛋白水平。免疫組化結果見圖3所示，與Con組相比，LPS組小鼠十二指腸組織中TNF-α蛋白表達面積極顯著增高(P<0.01)。與LPS相比，LPS+WO組TNF-α蛋白表達面積極顯著下降(P<0.01)。WO組與Con組無顯著差異(P>0.05)。

圖3 小鼠十二指腸TNF-α免疫組化及蛋白表達

免疫印跡結果見圖4所示，與Con組相比，LPS能極顯著誘導小鼠十二指腸中TNF-α蛋白的表達水平(P<0.01)。與LPS相比，LPS+WO組能極顯著抑制小鼠十二指腸中TNF-α蛋白表達水平(P<0.01)。WO組與Con組無顯著差異(P>0.05)。表明核桃油能抑制LPS誘導的小鼠十二指腸TNF-α蛋白的表達，與TNF-α mRNA的轉錄水平結果一致。

圖4 小鼠十二指腸TNF-α免疫印跡及定量表達

2.4 核桃油對小鼠小腸病理的影響

采用HE染色觀察了各處理組小鼠十二指腸組織病理學變化(圖5)，Con組和WO組小鼠十二指腸組織結構正常，絨毛結構完整，排列緊密，無組織學病變。LPS組十二指腸絨毛萎縮，上皮細胞脫落，絨毛有斷裂現象，固有層炎性細胞浸潤，提示小鼠腸道炎癥模型建立成功。與LPS組相比，LPS+WO組小腸損傷較輕，腸絨毛恢復、炎性細胞浸潤減輕。表明核桃油能減輕LPS誘導的小鼠急性腸道炎癥的形態損傷。

圖5 小鼠十二指腸病理變化

3 討論

攝入n-3/n-6較高比率的多不飽和脂肪酸對IBD具有明顯的預防作用[9]。腸道是機體消化吸收的最大場所，本研究評估在LPS誘導的小鼠急性腸道損傷過程中，核桃油對十二脂腸中TNF-α的影響。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的特有的一種化學成分，由脂質和多糖組成，經腹腔注射進入機體后導致腸道黏膜通透性增加，引發腸道氧化應激，活化TLR4/NF-κB炎癥通路，并釋放炎性因子TNF-α，進而誘導腸道細胞的壞死和凋亡，促使腸道發生炎癥[15]。在本研究中，LPS能顯著增加小鼠腸道組織中TNF-α水平，說明LPS誘導了小鼠腸道中TNF-α表達。

隨著對核桃油生物活性研究的深入，核桃油具有顯著的抗炎活性。Willis等[16]研究表明核桃油的抗炎作用通過磷脂酶D2(Phospholipase D2，PLD2)的活化降低小膠質細胞BV-2中TNF-α的表達水平，從而提高細胞的抗炎能力。Yolanda等研究表明核桃油可降低機體外周血單核細胞中炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA的表達水平[18]。核桃油顯著的抗炎作用機制可能是通過調控機體腸道菌群組成及多樣性水平[增加腸道柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)、羅氏菌屬(Roseburia)和梭菌屬(Clostridium)的相對豐度]相關，這3類菌可以產生丁酸鹽，作為一種短鏈脂肪酸(Short chain fatty acids，SCFAs)具有抗炎和免疫調節的功能[20]。此外，核桃油中多酚類化合物主要為鞣質、黃酮類和酚酸成分，經腸道微生物菌群代謝生成尿石素(Urolithin)A和尿石素B，尿石素在機體內可抑制相關炎性因子的表達減輕炎癥反應，如NF-κB、誘導型iNOS、TNF-α、IL-1β等[19，20]。核桃油在IBD非藥物防控研究中具有較高參考價值，但其在腸道炎癥中確切作用機制仍需進一步探索。

4 結論

本研究利用LPS建立小鼠小腸急性損傷模型，檢測了小鼠十二指腸中關鍵促炎因子TNF-α表達水平的變化。結果表明：核桃油可顯著下調LPS誘導的小鼠小腸組織中TNF-α表達水平，并改善小腸組織病理形態。核桃油可能通過抑制小鼠小腸組織中炎性因子TNF-α的表達對LPS誘導的急性腸道損傷發揮保護作用。