微生物分析技術(shù)及其在醬香型白酒中的應(yīng)用進(jìn)展

山其木格，唐 平，王 麗，王 凡，畢榮宇，李長文，盧 君*

（1.貴州國臺(tái)酒業(yè)股份有限公司，貴州 仁懷 564501；2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院，天津 300410）

白酒是中華民族的瑰寶，它凝聚著我國勞動(dòng)人民的智慧，至今已有幾千年的歷史。由于原料、酒曲、工藝及地處環(huán)境等因素的差異，我國白酒又形成了風(fēng)格特色各異的不同香型[1]。正宗大曲醬香白酒應(yīng)使用貴州紅纓子糯高粱，采用“四高兩長”（高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒和生產(chǎn)周期長、貯存時(shí)間長）獨(dú)特的釀造工藝，使得眾多微生物共同參與白酒發(fā)酵，使其具有“醬香突出，幽雅細(xì)膩，酒體醇厚，回味悠久，空杯留香持久”的風(fēng)格特點(diǎn)和豐富口感，深受廣大消費(fèi)者的青睞。醬香型白酒在中國白酒產(chǎn)業(yè)中雖然產(chǎn)量占比不高，但利潤大幅提升，呈現(xiàn)出快速發(fā)展的良好勢態(tài)。2019年僅仁懷醬香白酒以中國白酒總產(chǎn)量3%的份額，實(shí)現(xiàn)了全國白酒業(yè)超40%的利潤。

醬香型白酒釀造中微生物的生長代謝具有十分重要的作用，將原料中的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行分解、轉(zhuǎn)化，生成相應(yīng)的代謝產(chǎn)物，賦予白酒獨(dú)特風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值[2]。醬香型白酒生產(chǎn)企業(yè)強(qiáng)調(diào)保持傳統(tǒng)工藝的同時(shí)也十分重視科學(xué)技術(shù)的應(yīng)用。醬香型白酒的科學(xué)研究起始于20世紀(jì)50年代末。目前，國內(nèi)學(xué)者對其釀酒微生物、釀造工藝和酒體特征成分等方面進(jìn)行了深入的研究，取得了不少研究成果，推動(dòng)了醬香型白酒產(chǎn)業(yè)不斷向機(jī)械化、智能化方向發(fā)展[3-4]。

隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，各種微生物分析技術(shù)逐步應(yīng)用于醬香型白酒發(fā)酵研究中，人們逐漸認(rèn)識(shí)到釀酒微生物的豐富多樣及其貢獻(xiàn)。本文總結(jié)了近20年微生物分析技術(shù)在醬香型白酒研究中的應(yīng)用情況，并對醬香型白酒微生物研究提出了展望，旨在推動(dòng)醬香白酒行業(yè)的技術(shù)升級和高質(zhì)量發(fā)展。

1 微生物分析技術(shù)及其應(yīng)用

隨著科技的發(fā)展，微生物分析技術(shù)不斷地推陳出新。從最初的傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)，到不依賴于菌種培養(yǎng)的生物標(biāo)記法，再到依賴于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的分子生物學(xué)分析技術(shù)等的應(yīng)用，均在釀酒微生物菌群分析方面取得了較為全面精準(zhǔn)的分析結(jié)果。

1.1 傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法

傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法是最早應(yīng)用的微生物研究手段，它通過適宜的分離篩選條件得到純菌，經(jīng)生態(tài)學(xué)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行微生物的種屬歸類[5]。Biolog全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)的出現(xiàn)使得鑒定工作簡單快速，確保鑒定的完整性與準(zhǔn)確性。Biolog基于微生物對底物利用能力的差異，通過系統(tǒng)讀取信息并與數(shù)據(jù)庫對比，得出鑒定結(jié)果，因此也稱為代謝指紋技術(shù)。2008年WANG C L等[6]研究醬香型大曲不同發(fā)酵時(shí)期、不同層面的微生物群落動(dòng)態(tài)變化，從中分離出200多株釀酒微生物，并通過形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌、曲霉菌、釀酒酵母為大曲中優(yōu)勢菌屬。2013年董瑞麗等[7]應(yīng)用Biolog技術(shù)從醬香型大曲中分離到的一株細(xì)菌進(jìn)行鑒定，實(shí)現(xiàn)了Biolog技術(shù)在醬香型大曲菌種鑒定中的首次應(yīng)用。

但是傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法也存在局限性。自然界中可培養(yǎng)的微生物只占總數(shù)的0.1%～10%，絕大多數(shù)微生物無法實(shí)現(xiàn)純菌培養(yǎng)[8]。對于厭氧菌的培養(yǎng)，厭氧環(huán)境是關(guān)鍵。但厭氧環(huán)境不易形成，需要特殊設(shè)施設(shè)備。直到自動(dòng)厭氧手套箱的出現(xiàn)，有利推動(dòng)了厭氧微生物的研究。2018年王曉丹等[9]借助于厭氧手套箱從下層糟醅中分離篩選到4株厭氧細(xì)菌，并經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和核糖體脫氧核糖核酸（ribosomal deoxyribonucleic acid，rDNA）基因同源性分析鑒定為丁酸梭菌、解木聚糖梭菌、近端梭菌和煎盤梭菌。

1.2 生物標(biāo)記法

生物標(biāo)記法是指依據(jù)微生物細(xì)胞中特定生物化學(xué)物質(zhì)的種類、數(shù)量來反映某類微生物的組成與數(shù)量的一種方法。常用的標(biāo)記物有醌、脂肪酸和麥角甾醇[10]。常用的方法有醌指紋法（quinone profile，QP）、磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）圖譜法等[11-12]。這些方法不依賴于分離培養(yǎng)，對樣品直接進(jìn)行微生物定性定量分析。但其微生物的分類水平較低，不能鑒定到種。對于微生物群系更為詳細(xì)的分析，還需借助其他鑒定方法。1985年TUNLID首次應(yīng)用PLFA技術(shù)對油菜根際微生物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，后來逐漸引入到土壤、發(fā)酵食品以及白酒釀造等多種微生物研究領(lǐng)域中[13]。2017年趙金松等[14]應(yīng)用PLFA技術(shù)對醬香、濃香和清香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同工藝大曲微生物群落結(jié)構(gòu)差異明顯，制曲溫度的升高對大曲微生物多樣性影響較大。

1.3 分子生物學(xué)技術(shù)

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子生物學(xué)分析技術(shù)正在逐步取代生物標(biāo)記法，廣泛應(yīng)用于釀酒微生物的研究中。

1.3.1 rDNA基因同源性分析

rDNA基因具有良好的進(jìn)化保守性、適宜分析的長度以及與進(jìn)化距離相匹配的良好變異性，所以成為分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)識(shí)序列。通常用于微生物鑒定、親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建的序列有細(xì)菌16S rDNA基因、真菌26S rDNA基因D1/D2區(qū)或轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列。張榮等[15]應(yīng)用rDNA基因同源性分析，將高溫大曲中分離篩選到的3株產(chǎn)醬香的G+桿菌鑒定為地衣芽孢桿菌。

1.3.2 克隆文庫的構(gòu)建

克隆文庫技術(shù)最早在1991年被GIOVANNONI等用來分析浮游細(xì)菌多樣性[16]，目前已廣泛應(yīng)用于白酒微生態(tài)研究中。常用細(xì)菌16S rDNA基因、真菌18S rDNA基因以及ITS基因克隆文庫等進(jìn)行分析。克隆文庫法因避開了純化培養(yǎng)，能夠鑒定不可培養(yǎng)微生物，而且因其針對微生物的16SrDNA或18S rDNA全長，能更為全面準(zhǔn)確地反映樣品中的微生物多樣性。2014年葉光斌等[17]通過16S rRNA基因文庫技術(shù)研究郎酒超高溫大曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落組成較為單一，主要以芽孢桿菌科和高溫放線菌科為主。

1.3.3 限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)

限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)（restriction fragment length polymorphism，RFLP）是利用不同種屬的微生物基因組DNA被限制性內(nèi)切酶酶切可產(chǎn)生分子質(zhì)量不同的DNA片段，通過酶切圖譜與數(shù)據(jù)庫的比對，分析微生物種群的差異以及種屬鑒定。2012年顏林春等[18]從福矛高溫大曲中分離出89株芽孢桿菌，對其16S rDNA進(jìn)行PCR-RFLP分析，揭示了福矛高溫大曲中可培養(yǎng)芽孢桿菌的豐富多樣。

1.3.4 核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析

核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）是20世紀(jì)末在美國發(fā)展起來的一項(xiàng)現(xiàn)代生物鑒定技術(shù)，也是一種PCR技術(shù)和RFLP技術(shù)相結(jié)合的方法。該技術(shù)是選擇性擴(kuò)增微生物rDNA保守性片段，將擴(kuò)增的rDNA片段進(jìn)行限制性酶切，通過酶切圖譜來對菌種多樣性進(jìn)行分析[19]。LI H等[20]應(yīng)用ARDRA技術(shù)和16S rDNA基因克隆文庫的建立，從醬香型大曲中鑒定出了枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌等優(yōu)勢細(xì)菌。

1.3.5 變性梯度凝膠電泳技術(shù)

變性梯度凝膠電泳技術(shù)（denaturing gradient gel e1ectrophoresis，DGGE）的原理是在聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，引入變性劑梯度，從而使長度相同但序列不同的DNA片段區(qū)分開。對目的條帶進(jìn)行測序分析，即可得到相關(guān)微生物信息。隨后又發(fā)展出其衍生技術(shù)，即溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。1993年MUYZER G首次將DGGE技術(shù)引入到微生物多樣性分析，后來逐漸應(yīng)用于微生物相關(guān)的各個(gè)領(lǐng)域[21]。該技術(shù)的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)一些問題：（1）對大于500 bp的DNA片段分離度較差，只能選用rRNA基因中某些可變區(qū)進(jìn)行分析，因此包含的信息量較少；（2）無法檢出樣品中相對含量低于1%的微生物，從而忽略一些含量低的關(guān)鍵微生物；（3）同一個(gè)菌株也可能有多個(gè)拷貝的核糖體RNA基因，由于突變的存在勢必會(huì)使這些拷貝體之間存在差異，從而高估微生物多樣性。雖然存在以上缺陷，但該技術(shù)因其無需培養(yǎng)微生物，快速且低成本等突出優(yōu)點(diǎn)，目前在醬香型白酒釀酒微生物分析研究中仍然與高通量測序技術(shù)并行成為當(dāng)前最常用的分析方法。譚映月等[22]應(yīng)用DGGE技術(shù)研究制曲過程中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及其演變規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著大曲的發(fā)酵，細(xì)菌多樣性下降，發(fā)酵后期芽孢桿菌屬和乳酸桿菌屬成為絕對優(yōu)勢菌，對醬香風(fēng)味的形成至關(guān)重要。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-timequantitativepolymerasechain reaction，RT-qPCR）是一種基于特異性引物在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中以熒光化學(xué)物質(zhì)標(biāo)記并測量每個(gè)PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，以此作為定量的依據(jù)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對特定菌起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析。它具有高特異性、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品微生物定量分析[23]。由于該技術(shù)對引物特異性要求高，目前在釀造微生物研究中仍處于探索階段。邵明凱等[24]應(yīng)用DGGE技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對產(chǎn)量、酒質(zhì)較高的第五輪次和較低的第七輪次釀造過程中酵母群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，同時(shí)分析糟醅中的代謝組分，結(jié)果表明酵母菌群多樣性較豐富，酵母菌菌群變化對白酒產(chǎn)量及品質(zhì)影響明顯。

1.3.7 高通量測序技術(shù)

在Sanger發(fā)明第一代測序技術(shù)以來測序技術(shù)不斷革新，開發(fā)出二代測序技術(shù)。二代測序技術(shù)具有通量高、準(zhǔn)確率高、可獲得定性及相對定量信息以及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，而且能檢測出稀有種屬，能全面客觀地揭示微生物群落信息，具有先進(jìn)性和優(yōu)越性[25]。但由于第二代測序技術(shù)測序讀長所限，只能以rRNA基因部分可變區(qū)為擴(kuò)增和測序靶點(diǎn)，導(dǎo)致對微生物的鑒定只能停留在“屬”或“科”的水平，不能精準(zhǔn)描述微生物群落結(jié)構(gòu)。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，研發(fā)人員開發(fā)出了第三代測序技術(shù)。它在序列長度和測序速度上得到了大幅度提升。

自2006年，高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing，HTS）在微生物研究中的應(yīng)用呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，于2014年首次應(yīng)用于白酒釀造微生物的研究。目前白酒釀酒微生物研究中，應(yīng)用最多是第二代測序技術(shù)，在對其他發(fā)酵食品、腸道微生物的研究中已引入了三代測序技術(shù)。王莉等[26]應(yīng)用高通量測序技術(shù)對不同時(shí)間的窖泥及環(huán)境土壤微生物區(qū)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在土壤馴化成窖泥的過程中，微生物多樣性逐漸降低，乳桿菌科、梭菌科和瘤胃菌科厭氧微生物逐漸成為優(yōu)勢種群。

1.4 宏基因組學(xué)技術(shù)

隨著測序技術(shù)的進(jìn)步和生物信息學(xué)的發(fā)展，宏基因組學(xué)技術(shù)也在微生物群落代謝與功能研究中得到了應(yīng)用。高通量測序數(shù)據(jù)的處理算法和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫成為宏基因組學(xué)發(fā)展的重要基礎(chǔ)，也是目前宏基因組學(xué)發(fā)展的一個(gè)技術(shù)瓶頸[27]。利用高通量測序技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行物種分類學(xué)注釋的同時(shí)也可以進(jìn)行功能注釋和代謝通路分析[16]。

各種微生物分析技術(shù)均有其優(yōu)缺點(diǎn)，在不斷地發(fā)展和完善的同時(shí)，相互彌補(bǔ)相互推進(jìn)。醬香型白酒釀造研究中，以傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，并引入多種分子生物學(xué)技術(shù)，使釀酒微生物的研究從表型特征的鑒定深入到遺傳特性的鑒定，為微生物研究提供可信度高、靈敏度高、重復(fù)性好且客觀、快速的分析方法。生物技術(shù)推陳出新，將會(huì)更加有力地推動(dòng)白酒釀造微生態(tài)的解析。

2 微生物分析技術(shù)在醬香型白酒發(fā)酵研究中的應(yīng)用

2.1 應(yīng)用階段

醬香型白酒釀酒微生物的來源廣泛，來源于大曲、糟醅、窖泥、原料、生產(chǎn)用水、設(shè)備、環(huán)境及空氣等。釀酒過程中微生物代謝主要發(fā)生在高溫制曲、堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵三個(gè)階段。因此，醬香型白酒釀酒微生物研究主要圍繞該三個(gè)階段展開。

2.1.1 高溫制曲階段

醬香型白酒生產(chǎn)中高溫大曲作為糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑，對酒質(zhì)具有至關(guān)重要的作用。醬香型大曲選用小麥為原料，以適量優(yōu)質(zhì)母曲作為接種源，發(fā)酵溫度高達(dá)65 ℃，經(jīng)過3～6個(gè)月的貯存后方可投入生產(chǎn)。在開放式環(huán)境下不同來源的微生物不斷更替富集，經(jīng)長期自然選擇，在大曲中形成以細(xì)菌、酵母菌和霉菌為主的微生物體系[28]。經(jīng)過高溫制曲能夠存活下的優(yōu)勢菌主要為耐熱的芽孢桿菌屬細(xì)菌，因此醬香型大曲也可以說是細(xì)菌曲。

大曲中細(xì)菌和霉菌都可以分泌多種水解酶；酵母菌雖然在大曲中的數(shù)量不多，但仍是一類產(chǎn)酒生香的關(guān)鍵功能菌；放線菌在發(fā)酵過程中通過代謝抗生素調(diào)節(jié)多菌種混合發(fā)酵途徑和代謝。在醬香型白酒釀造過程中眾多微生物相互作用，最終影響著醬香型白酒的發(fā)酵及風(fēng)味物質(zhì)的形成。

隨著微生物分析手段不斷更新，拓展了大曲微生物的研究范圍，對大曲菌群進(jìn)行更為全面、實(shí)時(shí)、精確的研究。目前，在醬香型白酒制曲階段，對于釀酒微生物的研究主要集中在大曲發(fā)酵的不同階段、不同層面微生物群落結(jié)構(gòu)及其變化以及不同區(qū)域甚至不同工藝大曲之間微生物群落差異分析（詳見表1）。

表1 醬香型大曲微生物多樣性研究近況Table 1 Recent research on the microbial diversity of sauce-flavor Daqu

續(xù)表

不同區(qū)域、不同階段、不同層面微生物群落結(jié)構(gòu)及變化揭示著醬香型大曲明顯的時(shí)空特征。大曲微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系、微生物相互作用以及代謝產(chǎn)物的深入研究將有助于揭示白酒微生物釀造機(jī)理，有助于確定關(guān)鍵微生物及特征成分，有利于指導(dǎo)生產(chǎn)更多的優(yōu)質(zhì)醬香型白酒。

2.1.2 堆積發(fā)酵階段

高溫制曲過程中酵母菌被高溫殺死得所剩無幾。堆積過程中網(wǎng)羅環(huán)境及空氣中的微生物，尤其富集酵母菌，因此該階段稱為“二次制曲”。高溫堆積淘汰了一部分雜菌，馴化了耐高溫菌，有利于釀酒微生物的繁殖代謝，使原料中淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)產(chǎn)生初步的分解，生成醬香物質(zhì)或其前體物質(zhì)，為入窖發(fā)酵創(chuàng)造條件[44]。糟醅堆積在醬香型白酒質(zhì)量和產(chǎn)量的重要性也得到了證實(shí)。

該階段主要圍繞不同釀酒輪次、不同堆積時(shí)間及不同位置的堆積糟醅展開釀酒微生物的分析研究，揭示著環(huán)境因素對微生物菌群的影響以及不同的菌群結(jié)構(gòu)對于不同輪次酒酒體差異的影響（詳見表2）。

表2 堆積糟醅微生物多樣性研究近況Table 2 Recent research on the microbial diversity of stacking Zaopei

不同堆積時(shí)間、不同空間位置形成不同的菌群結(jié)構(gòu)，從而造就酒體差異。堆積環(huán)境因素、微生物相互作用對微生物菌群的相關(guān)性研究以及不同菌群對酒體相關(guān)性研究，有助于揭示微生物發(fā)酵在酒體風(fēng)味形成的重要性，從而指導(dǎo)優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高原料利用率和優(yōu)質(zhì)酒產(chǎn)率。

2.1.3 窖池發(fā)酵階段

窖池發(fā)酵階段是產(chǎn)酒的過程，也是大量風(fēng)味物質(zhì)生成的重要環(huán)節(jié)。醬香型白酒生產(chǎn)中，窖內(nèi)發(fā)酵由于發(fā)酵工藝及所處位置的不同，形成了上、中、底層等三個(gè)層次。其糟醅微生物分布及生長代謝有明顯差異，這些差異是造就不同酒體（即上層窖面酒、中層醇甜酒、底部窖底酒）風(fēng)格的重要原因[55]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，窖池內(nèi)部會(huì)形成高乙醇含量、低氧、低pH值的特點(diǎn)，微生物數(shù)量下降，形成一系列對白酒產(chǎn)香產(chǎn)氣影響較大的厭氧微生物體系[56]。研究者們借用現(xiàn)代科技技術(shù)，在窖池發(fā)酵不同時(shí)期、不同位置的微生物群落分析、功能菌的篩選以及不同區(qū)域微生物差異分析等方面展開了大量研究（詳見表3）。由于窖底酒在醬香型白酒勾調(diào)中的重要地位，窖泥厭氧微生物的研究也開始受到重視。

表3 窖池微生物多樣性研究近況Table 3 Recent research on the microbial diversity in pits

續(xù)表

2.2 微生物分析技術(shù)在醬香型白酒研究中作用

醬香型白酒獨(dú)特的工藝造就獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)及其生物代謝過程，這是形成醬香風(fēng)味的重要物質(zhì)保障。研究醬香型白酒釀造過程中微生物及其代謝過程，對于揭示其風(fēng)味形成、品質(zhì)提升以及工藝優(yōu)化都具有重要意義。目前，研究人員根據(jù)各種微生物分析技術(shù)的特點(diǎn)，使其以較為適宜的方式致力于醬香型白酒微生物研究（見圖1）。

圖1 醬香型白酒釀酒微生物研究概況Fig.1 Research situation on brewing microorganisms of sauce-flavor Baijiu

2.2.1 菌種鑒定

目前微生物分析技術(shù)用于醬香型白酒釀酒微生物的分離及鑒定研究較多，通過可培養(yǎng)方法或厭氧工作站獲得純菌，并通過形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)、Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)或者rDNA基因同源性分析進(jìn)行菌株鑒定。獲得純種微生物是微生物研究的基礎(chǔ)，對于菌株發(fā)酵特性研究、耐受性研究、酶學(xué)研究、代謝產(chǎn)物研究、相互作用研究、菌株強(qiáng)化應(yīng)用以及微生物全基因組測序都具有重要的意義。

2.2.2 微生物群落定性分析

目前微生物分析技術(shù)用于醬香型白酒釀酒微生物群落多樣性分析和差異分析占絕大多數(shù)。微生物多樣性和差異分析最常用的分析方法有PCR-DGGE技術(shù)、16S rRNA基因文庫以及高通量測序。對于可培養(yǎng)微生物，可通過稀釋涂布培養(yǎng)法進(jìn)行多樣性分析。李登勇等[39]應(yīng)用高通量測序技術(shù)，對不同產(chǎn)地、不同酒廠、生產(chǎn)場地及陳曲時(shí)間醬香型大曲群落組成進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)醬香型大曲的微生物群落具有顯著的時(shí)空性特征。很多學(xué)者在應(yīng)用基因文庫構(gòu)建技術(shù)或rDNA基因同源性分析方法研究釀酒微生物群落多樣性時(shí)常聯(lián)合應(yīng)用ARDRA、RFLP或隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）等技術(shù)，先對所涉及微生物進(jìn)行分型，再對代表性樣品進(jìn)行測序，即減輕工作量，也避免了重復(fù)測序。邊名鴻等[60]構(gòu)建古菌16S rDNA文庫研究醬香型窖泥中古菌群落結(jié)構(gòu)時(shí)聯(lián)合應(yīng)用了ARDRA技術(shù)篩分出不同的古菌類型。除此之外，PLFA技術(shù)也應(yīng)用于釀酒微生物群落分析。趙金松等[14]采用PLFA技術(shù)對清香、濃香和醬香型大曲微生物多樣性進(jìn)行對比分析，解析不同工藝大曲微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯的差異，并隨著制曲溫度的升高，微生物多樣性具有下降趨勢。

2.2.3 微生物定量分析

在釀酒微生物研究過程中，除了定性分析，有時(shí)定量分析也是有必要的。對于復(fù)雜樣本中的可培養(yǎng)微生物，可以通過稀釋涂布法進(jìn)行相對定量分析。在不進(jìn)行純培養(yǎng)的情況下，可通過克隆文庫構(gòu)建的方法觀察微生物的相對數(shù)量。生物標(biāo)記法也可用于復(fù)雜樣本中某類微生物的定量分析。目前，高通量測序在微生物相應(yīng)分類水平上根據(jù)微生物豐度進(jìn)行相對定量分析。但相對定量難以準(zhǔn)確反映微生物的生長變化趨勢及其代謝活力。熒光定量PCR技術(shù)是目前微生物分析技術(shù)中最為準(zhǔn)確的定量分析方法。該方法不僅可以揭示釀酒環(huán)境中的微生物分布特點(diǎn)，也有助于揭示某種微生物的代謝功能，彌補(bǔ)相對定量數(shù)據(jù)的不足。杜如冰等[71]應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了白酒釀造系統(tǒng)中乳桿菌屬（Lactobacillussp.）的鑒定和定量，為進(jìn)一步結(jié)合宏組學(xué)數(shù)據(jù)揭示在整個(gè)釀酒系統(tǒng)中該菌的功能和價(jià)值研究提供了有效方法和參考。

2.2.4 全基因組測序基礎(chǔ)研究

獲得關(guān)鍵微生物全基因組信息，有助于了解該菌在釀酒過程中的代謝機(jī)理，對醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)和健康因子調(diào)控研究具有重要的意義。王和玉等[69]對茅臺(tái)酒釀造優(yōu)勢菌—宛氏擬青霉進(jìn)行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)參與代謝及風(fēng)味物質(zhì)合成的基因及其代謝通路，為解析其釀造功能提供了重要的生物信息學(xué)基礎(chǔ)。

3 展望

現(xiàn)代生物技術(shù)使得醬香型白酒的生產(chǎn)和科研水平都取得了較大的進(jìn)步。但由于醬香型白酒釀造工藝較為復(fù)雜，至今還有很多發(fā)酵機(jī)理方面的問題還未得到探明。統(tǒng)覽近20年相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)對釀酒微生物的研究主要集中在釀酒微生物多樣性構(gòu)成、功能菌株的篩選及應(yīng)用，而對發(fā)酵過程中功能微生物間的相互作用、香氣成分的微生物溯源研究較少。欲弄清白酒發(fā)酵的本質(zhì)，還需要加大微生物分析技術(shù)在以下幾個(gè)方面的應(yīng)用研究力度。①微生物代謝特征與功能研究；②環(huán)境因素對微生物生長代謝的影響；③白酒關(guān)鍵特征物質(zhì)和有害代謝產(chǎn)物的微生物溯源；④關(guān)鍵微生物及特征物質(zhì)的確定；⑤風(fēng)味物質(zhì)比例對白酒質(zhì)量的影響；⑥主要功能微生物的相互作用研究；⑦菌劑制備和應(yīng)用；⑧現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的利用及完善。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對釀酒微生物的研究已從細(xì)胞水平上升至分子生物學(xué)水平，已積累大量宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)，有待于充分利用和完善。相信隨著微生物分析手段的更新發(fā)展和各類組學(xué)在微生物群落代謝及功能研究中的更多更廣泛的應(yīng)用，醬香型白酒釀酒微生物群落、物質(zhì)代謝及其與酒質(zhì)的關(guān)系更加清晰化，在發(fā)酵機(jī)理研究中取得突破性的進(jìn)展。為此，醬香型白酒企業(yè)在秉承傳統(tǒng)工藝的同時(shí)還需要加大科研力度，借助于先進(jìn)的理論和技術(shù)，推動(dòng)白酒微生物及代謝研究更上一個(gè)層次，全面解析醬香型白酒釀造機(jī)理，從而進(jìn)行科學(xué)合理的工藝改造及優(yōu)化，推動(dòng)醬香白酒行業(yè)的技術(shù)升級和高質(zhì)量發(fā)展。