藤茶中二氫楊梅素對乳酸菌生長及活性的影響

樊慶濤，孫湘沛，劉 梁，趙 玲，劉華英，陳 新*

（1.武漢輕工大學 生命科學與技術學院，湖北 武漢 430023；2.湖北來鳳騰升香料化工公司，湖北 恩施 445700）

藤茶（Ampelopsis grossedentata），又稱茅巖青霜茶、青霜古藤茶、土家莓茶、龍須茶等，中國最早的《詩經總集》稱為古茶勾藤，是指由藤本植物制作出來的茶。二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）作為藤茶中主要的黃酮類化合物，占藤茶總黃酮的70%以上，近年來其生理活性受到廣泛關注[1-4]。既往研究證實二氫楊梅素具有抗氧化、調節血脂、改善腸道菌群豐度[5-7]等多方面活性。此外，二氫楊梅素還具有解除酒精中毒，預防酒精肝、脂肪肝等作用[8-10]。

乳酸菌是重要的食品釀造微生物及益生菌來源[11]，同時它也是人體中胃和小腸內的主要益生菌。在許多酸奶及益生菌制劑中常用到混合乳酸菌作為益生元添加在食品中[12-13]。乳酸菌可以通過釋放乳酸、乙酸和一些對有害菌起作用的抗菌素，抑制腸道不良微生物的增殖，調節腸道菌群平衡，同時它還兼具抗癌、增強機體免疫力與抗衰老等作用[14-15]。

將DMY加入到酸奶等乳酸菌發酵食品中，開發一種既能調節血脂、保肝護肝又可以解酒醒酒的功能性食品。但目前關于藤茶中的二氫楊梅素對乳酸菌生長及活性的影響鮮見報道。因此，本試驗以藤茶二氫楊梅素為對象，選取嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaria）、嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococcus thermophilus）三種酸奶中常見的乳酸菌，采用流式細胞術等方法研究二氫楊梅素對其生長及活性的影響，旨在為藤茶酸奶的研究開發提供技術和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，LA）AS1.2686、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgaricussubsp.bulgaria，LB）CICC6045、嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococcus thermophilus，ST）CICC6038：上海保藏生物技術中心（Shanghai Conservation Biotechnology Center，SHBCC）。

1.1.2 化學試劑

二氫楊梅素（純度＞98%）：本實驗室從來鳳藤茶中提取，經紅外光譜及核磁共振譜鑒定；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（分析純）：上海翊圣生物科技有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）（分析純）：德國Biofroxx生物試劑公司；甲醇（色譜純）：美國TEDIA天地試劑公司；其他試劑均為國產分析純；實驗用水為超純水。

1.1.3 培養基和緩沖液

MRS培養基[16]：10 g/L 蛋白胨，10 g/L 牛肉膏，5 g/L 酵母提取物，2 g/LK2HPO4，2 g/L檸檬酸二銨，5 g/L乙酸鈉，1 mL/L吐溫80，0.58 g/L MgSO4·7H2O，0.25 g/L MnSO4·4H2O，20 g/L葡萄糖，pH 6.3。121 ℃滅菌20 min。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）[17]：9 g/L NaCl，795mg/LNa2HPO4·7H2O，144 mg/LKH2P4溶于1 000 mL超純水中，調節pH值至7.4。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

CJ-1F型超凈工作臺：蘇州市金燕凈化設備有限公司；TL-205臺式高速冷凍離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；CytoFLEXS流式細胞儀：貝克曼庫爾特商貿有限公司；Agilent-1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫公司；細菌濾膜（0.22 μm）：上海興亞凈化材料廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化及種子液制備

將保存于-10～-20 ℃的3種菌種凍干管分別取出，用無菌吸管吸取適宜的無菌水，滴入凍干管內，充分混勻，使凍干菌體溶解成懸浮狀液體。接種到MRS 培養基中37 ℃靜置培養72 h。將培養液于MRS瓊脂上劃線，挑取單菌落，一份用于MRS斜面劃線，37 ℃培養，有菌落成形后，挑取單菌落轉接于裝有100 mL MRS培養基的錐形瓶中，同條件下培養48 h，制成種子液；另一份挑取1～2環菌落于菌種保藏管內，與甘油混合均勻后于-80 ℃冰箱長期保存[18]。

1.3.2 無菌二氫楊梅素標準溶液配制

準確稱取DMY 100 mg，用3 mL DMSO溶解，緩慢加入超純水，待冷卻至室溫時，于10 mL容量瓶中定容，配制成10 mg/mL的DMY標準溶液。將容量瓶外壁用體積分數75%酒精消毒液擦拭，轉入超凈工作臺中，取無菌注射器吸取溶液，過0.22 μm細菌濾膜置于無菌EP管中備用。

1.3.3 實驗設計及菌種培養

三種乳酸菌分別單獨培養，每種培養實驗設置1個空白對照組（空白對照組加入同等濃度的DMSO水溶液）及5個實驗組（D1～D5）見表1，每組3個平行樣，每組MRS培養基均為50 mL，種子液接種量均為6%。實驗組分別加入100 μL、300 μL、500 μL、1 000 μL、2 000 μL無菌DMY標準溶液，于37 ℃下厭氧靜置培養48 h。

表1 二氫楊梅素添加量實驗設計方案Table 1 Experimental design of dihydromyricetin addition

1.3.4 DMY濃度對菌株生長影響

取培養菌液分別充分搖勻，于超凈工作臺中取5 mL，在波長600 nm處測量空白對照組吸光度值（OD600nm值），然后分別測量各菌液吸光度值（OD600nm值），每個樣品測定3次，取平均值。

1.3.5 乳酸菌數量及活性檢測

取培養菌液分別充分搖勻，分別以無菌操作20倍稀釋，吸取100 μL的稀釋菌液，加入10 μL質量濃度為1 mg/mL 的PI染液（PI濃度應控制在0.002%的潛在毒性以下），再加入1 mL滅菌PBS緩沖液，后置于37 ℃恒溫培養箱中孵育15 min后上流式，以30 μL/min的上樣流速分別檢測乳酸菌顆粒數及活性[19-23]。

1.3.6 三種菌液中發酵后DMY測定

稱取DMY標準品10 mg，用無水乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，制成質量濃度為0.2 mg/mL的標準品母液，分別用移液槍吸取1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL標準品母液，用無水乙醇定容至10 mL容量瓶中，共配成6個濃度梯度的標準品溶液，分別進HPLC儀中檢測并繪制DMY標準曲線。

將空白組和實驗組菌液充分混勻后分別取30 mL，分別加入15 mL無水乙醇，靜置15 min后，于6 000 r/min、-2 ℃條件下離心15 min，取上清液，過0.22 μm有機濾膜，用HPLC分別進行DMY含量測定。

HPLC條件[24-25]：Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.03%磷酸，梯度洗脫（0 min，甲醇-0.03%磷酸比例為12∶88；25 min，甲醇-0.03%磷酸比例為65∶35；35～40 min，甲醇-0.03%磷酸比例為12∶88）；檢測波長290 nm；流速0.7 mL/min；柱溫35 ℃，進樣量5 μL。

2 結果與分析

2.1 不同DMY濃度對三種乳酸菌生長的影響

不同DMY濃度對菌株LA、LB、ST生長的影響見圖1，結果顯著性分析結果見表2。由圖1可知，10 mg/mL DMY添加量在1 000 μL以下時，對菌株LA和ST的生長有促進作用，而對于菌株LB 而言，DMY的添加量在500 μL以下時其促進生長作用不明顯。而當DMY添加量＞1 000 μL時，三種菌生長均受到抑制。由表2可知，在菌株LA中除D5組與空白組無顯著性差異外，其余各組均具有顯著性差異（P＜0.05）；在菌株LB中各組均無顯著性差異（P＞0.05）；在菌株ST中各組均與空白組具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 不同二氫楊梅素濃度對三種乳酸菌生長的影響Fig.1 Effects of different dihydromyricetin concentration on the growth of three lactic acid bacteria

表2 不同二氫楊梅素濃度的三種乳酸菌OD600nm值顯著性差異分析Table 2 Significant difference analysis of OD600nm value of three kinds of lactic acid bacteria with different dihydromyricetin concentrations

2.2 不同DMY濃度對三種乳酸菌活性的影響

在流式檢測中，根據各細菌群光散射信號和PI熒光信號對細胞群落進行劃分，選取目標群落，數據顯著性分析結果見表3。由表3可知，LA實驗組中空白組與D4組無顯著性差異（P＞0.05），其余各組均存在顯著性差異（P＜0.05）。LB實驗組中D1組與D2組無顯著性差異（P＞0.05），其余各組均存在顯著性差異（P＜0.05）。ST實驗組中空白組與D1組無顯著性差異（P＞0.05），其余各組均存在顯著性差異（P＜0.05）。

表3 流式細胞術檢測不同實驗組死菌占比顯著性差異分析Table 3 Analysis of the significant difference of the proportion of dead bacteria in different experimental groups detected by flow cytometry

通過對不同DMY添加量的菌株LA實驗組進行流式分析見圖2。由圖2可知，其中LA-D1組至LA-D3組高熒光強度顆粒從5.55%逐漸減少到3.30%，在LA-D4組至LA-D5組中又逐漸升高至16.03%。通過與空白組對照，在D1～D3組實驗中，菌株LA中被熒光標記的死菌數量隨著DMY濃度的增高而降低，在D4～D5組實驗中，菌株LA死菌數量隨著DMY濃度增高而增高。

圖2 嗜酸乳桿菌在不同二氫楊梅素濃度下的流式熒光直方圖Fig.2 Flow cytometric fluorescence histograms of Lactobacillus acidophilus at different dihydromyricetin concentrations

通過對不同DMY添加量的菌株LB實驗組進行流式分析見圖3。由圖3可知，其中LB-D1至LB-D3組高熒光顆粒從54.18%逐漸減少到42.52%，LB-D4至LB-D5中又逐漸升高至75.76%。通過與空白組對照，在D1～D3組實驗中，菌株LB中被熒光標記的死菌數量隨著DMY濃度增高而降低，在D4～D5組實驗中，菌株LB活菌數量隨著DMY濃度增高而增高。與菌株LA相比，菌株LB對DMY的添加所表現出來的抑制作用更為敏感。

圖3 德氏乳桿菌保加利亞亞種在不同二氫楊梅素濃度下的流式熒光直方圖Fig.3 Flow cytometric fluorescence histograms of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaria at different dihydromyricetin concentrations

通過對不同DMY添加量的菌株ST實驗組進行流式分析見圖4。由圖4可知，其中ST-D1至ST-D3組高熒光顆粒從5.34%逐漸減少到2.83%，ST-D4至ST-D5中又逐漸升高至6.41%。通過與空白組對照，在D1～D3組實驗中，菌株ST被熒光標記的死菌數量隨著DMY濃度增高而降低，在D4～D5組實驗中，ST死菌數量隨著DMY濃度增高而升高。

圖4 嗜熱鏈球菌在不同二氫楊梅素濃度下的流式熒光直方圖Fig.4 Flow cytometric fluorescence histograms of Streptococcus thermophilus at different dihydromyricetin concentrations

通過分析流式實驗結果，三種乳酸菌在DMY添加質量濃度為在100～1 000 mg/L時，均表現出了菌液中死菌數量顯著減少的趨勢，而當DMY質量濃度＞1 000 mg/L時菌液中死菌數量顯著增加。

2.3 三種乳酸菌發酵后發酵液DMY含量測定

以DMY標準溶液（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制DMY標準曲線，DMY標準曲線回歸方程為y=34 036x+20.292，相關系數為R2=0.999 7，表明二者線性關系良好。

三種不同的乳酸菌菌液DMY含量HPLC分析結果見圖5～圖7。依據標準曲線回歸方程計算DMY含量結果見表4。由表4可知，3菌株菌液中DMY含量未發生明顯變化，說明乳酸菌并未或極少代謝DMY。

圖5 嗜酸乳桿菌發酵液二氫楊梅素含量測定高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of dihydromyricetin contents of Lactobacillus acidophilus fermentation broth by HPLC

圖6 德氏乳桿菌保加利亞亞種菌發酵液二氫楊梅素含量測定高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of dihydromyricetin contents of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus fermentation broth

圖7 嗜熱鏈球菌發酵液二氫楊梅素含量測定高效液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of dihydromyricetin contents of Streptococcus thermophilus fermentation broth

表4 發酵前后菌液中二氫楊梅素含量Table 4 Content of dihydromyricetin in the solution before and after fermentation

3 結論

不同DMY添加量對三種乳酸菌的生長和活性均有影響，表現出雙向調節的作用。其中DMY添加量在100～1000mg/L時，LA、ST的生長和活性促進作用呈顯著增長趨勢，LB的生長促進作用不顯著，活性促進作用顯著。當DMY添加量在1 000～2 000 μg/mL時，三種菌的生長和活性均被顯著抑制。DMY往往表現為低滲透性和低生物利用度，所以在菌液發酵前后含量并無明顯變化。由于DMY擁有較強的抑制有害菌能力，故可以在低濃度時影響菌液環境從而增強乳酸菌生長和活性。所以，在應用上述三種乳酸菌發酵時可適量添加DMY使其促進發酵，并為發酵產物添加新的活性成分。