殼寡糖對生長育肥豬生長性能、肉品質、抗氧化功能以及免疫功能的影響

蘇維發 周洪彬 蔣登湖 劉 鑫 汪以真 王新霞 路則慶*

(1.浙江大學動物科學學院，生物飼料安全與污染防控國家工程試驗室，農業部華東動物營養與飼料重點試驗室，浙江省飼料與動物營養重點試驗室，杭州 310058；2.大連成三畜牧業有限公司，大連 116000)

現代集約化養殖模式下，“飼料禁抗”與非洲豬瘟給生豬健康養殖帶來嚴峻的挑戰。具有抗菌抗炎、提高免疫力和增強抗氧化能力的綠色飼料添加劑的開發與應用是提升豬只健康水平和改善肉品質的重要手段，也是飼料營養領域研究的熱點之一。殼寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)是甲殼素脫乙酰后的殼聚糖經降解而得的2～10個氨基葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的低聚糖。COS具有黏度低、水溶性好的優點，能夠更好地被細胞吸收利用[1]，從而更好地發揮其抗炎、抗菌、抗氧化和免疫調節等生物學功能[2-4]，在提高動物生產性能、增強機體免疫功能以及調節動物腸道菌群平衡等方面發揮著重要作用[5]。

COS在動物營養中的應用多在水產養殖業和家禽業，對豬的研究則主要集中斷奶仔豬與母豬，COS對豬生長育肥階段的影響則報道較少。而生長育肥階段是商品豬養殖周期中持續時間最長的階段，也是直接影響肉品質優劣的關鍵時期。因此，本研究旨在探索COS對生長育肥豬生長性能、肉品質、抗氧化功能以及免疫功能的影響，在此基礎上探討添加COS能否降低生產成本，提高經濟效益，為COS在生豬產業中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗COS以米糠粕為載體，添加COS混合物300 mg/kg，COS的有效含量為10%，由某生物科技有限公司提供。

1.2 試驗動物和試驗設計

試驗選取體重[(37.00±1.55) kg]相近“杜×長×大”生長豬225頭，隨機分成3組，每組3個重復，每個重復25頭。對照組飼喂基礎飼糧，COS組飼喂添加30 mg/kg COS的基礎飼糧，低能低蛋白質+COS組飼喂添加30 mg/kg COS的低能低蛋白質飼糧(粗蛋白質含量降低1個百分點，消化能降低0.21 MJ/kg)。基礎飼糧參照NRC(2012)營養需要配制，其組成及營養水平見表1。飼糧按試驗期分3個階段：生長期(30～65 kg)、育肥前期(66～90 kg)和育肥后期(91 kg至出欄)。試驗前對豬舍進行消毒，試驗期間每天06:00、11:00和17:00飼喂3次，自由采食，自由飲水。試驗期98 d。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3 指標測定

1.3.1 生長性能測定

試驗開始和結束時，以欄(重復)為單位測定各組試驗豬空腹體重，統計每個重復試驗豬的總采食量，并計算平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.3.2 樣品采集與處理

試驗結束時，禁食12 h后，每組選取6頭體重接近平均體重的試驗豬頸靜脈采血后屠宰，血液樣品于促凝管中室溫放置30 min，離心(3 000 r/min，15 min)，分裝血清于1.5 mL離心管，儲存在-20 ℃，用于血清免疫和抗氧化指標的檢測。取每頭豬的肝臟組織，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，迅速切小塊并轉移至液氮中，存于-80 ℃，用于肝臟抗氧化相關基因表達的測定。試驗豬屠宰后，分離并取出背最長肌用于肉品質的檢測。

1.3.3 肉品質測定

肌肉pH24 h和滴水損失的測定參照《豬肌肉品質測定技術規范》(NY/T 821—2004)進行測定，肌肉肉色采用色差儀檢測背最長肌亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)值，肌肉樣品的剪切力參照《肉嫩度的測定剪切力測定法》(NY/T 1180—2006)進行測定，肌苷酸含量采用高效液相色譜儀分析測定。

肌肉樣品中水解氨基酸的測定方法：稱取0.5 g樣品裝于安培瓶中，加入10 mL 6 mol/L的鹽酸溶液，封口。105 ℃恒溫烘箱，水解24 h。冷卻后轉移至蒸餾瓶中，用0.02 mol/L鹽酸溶液沖洗安培瓶中殘留的溶液2～3次，調節65 ℃水浴鍋至蒸發干。移取20 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液至蒸餾瓶中，溶解后取2 mL溶液于25 mL容量瓶中，用上述鹽酸溶液定容。取合適量過濾后用L-8900型氨基酸自動分析儀測定肌肉樣品中水解氨基酸的含量。

1.3.4 血清免疫指標檢測

血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、補體3(C3)和補體4(C4)含量的測定嚴格按照深圳邁瑞提供的試劑盒說明書進行。IgA、IgG和IgM試劑盒檢測范圍分別為0.025～0.800 g/L、2～20 g/L和0.4～2.6 g/L，最低檢出限為0.01、0.5和0.05 g/L；C3和C4試劑盒檢測范圍分別為0.01～3.00 g/L和0.005～2.000 g/L，最低檢出限分別為0.005和0.002 g/L。

1.3.5 血清抗氧化指標檢測

血清總抗氧化能力(T-AOC)的測定采用鐵離子還原法，血清丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法。測定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，2種試劑盒檢測范圍分別為0.2～55.2 U/mL和1～113 nmol/mL，最低檢出限分別為0.2 U/mL和0.2 nmol/mL。

1.3.6 肝臟抗氧化相關基因表達測定

采用實時熒光定量PCR技術檢測肝臟抗氧化基因谷胱甘肽過氧化物酶1(GPx1)、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPx4)、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)和p53的mRNA相對表達量。肝臟組織中總RNA的提取和質量檢測參照井洋洋等[6]的方法進行。然后根據cDNA合成試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]合成cDNA，-20 ℃保存。利用Applied Biosystems 公司StepOne PlusTM儀器進行實時熒光定量PCR檢測，引物序列見表2，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。實時熒光定量PCR反應體系為10 μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，日本) 5 μL，上游、下游引物各0.5 μL，cDNA 4 μL。PCR擴增條件為：95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，共40個循環。內參基因為β-肌動蛋白(β-actin)，目的基因mRNA相對表達量的計算采用2-△△Ct法。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.3.7 十二指腸、空腸和回腸腸道黏膜形態分析

試驗結束時，禁食12 h后，每個重復隨機選擇2頭試驗豬屠宰，按組織學準確區分各腸段，然后分別取試驗豬的十二指腸近端、空腸中段和回腸遠端各2 cm，在PBS中將腸斷的內容物漂洗干凈后，用4%多聚甲醛固定液固定。之后進行脫水、石蠟包埋、切片及蘇木精-伊紅(HE)染色。使用光學顯微鏡(Carl Zeiss，德國)觀察HE染色后的腸道組織切片，然后用軟件Motic Images 2000進行不同腸斷切片絨毛高度和隱窩深度的測量，并計算絨毛高度與隱窩深度的比值。

1.4 數據處理

試驗數據利用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著，數據結果以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 COS對生長育肥豬生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，COS組生長育肥豬平均日增重無顯著差異(P>0.05)，但料重比顯著降低了4.7%(P<0.05)；而低能低蛋白質+COS組生長育肥豬平均日增重和料重比均無顯著差異(P>0.05)。這表明，在適當降低飼糧粗蛋白質和消化能水平的情況下，飼糧添加30 mg/kg COS可在降低飼糧成本的前提下不影響生長育肥豬的生長性能。

表2 COS對生長育肥豬生長性能的影響

2.2 COS對生長育肥豬肉品質的影響

由表3可知，各組生長育肥豬屠宰后背最長肌24 h的pH均在正常值5.6～6.0，且差異不顯著(P>0.05)。在肉色方面，與對照組相比，COS組生長育肥豬背最長肌L*值顯著降低(P<0.05)，背最長肌a*值和b*值無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，COS組和低能低蛋白質+COS組生長育肥豬背最長肌滴水損失和剪切力均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，COS組與低能低蛋白質+COS組生長育肥豬背最長肌肌苷酸含量顯著提高了24.4%和19.6%(P<0.05)。

表3 COS對生長育肥豬肉品質的影響

對于水解氨基酸而言，由表4可知，與對照組相比，COS組生長育肥豬背最長肌谷氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸含量顯著提高(P<0.05)，而低能低蛋白質+COS組與對照組相比則無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，COS組和低能低蛋白質+COS組生長育肥豬背最長肌異亮氨酸含量均顯著降低(P<0.05)。

表4 COS對生長育肥豬背最長肌水解氨基酸組成的影響

2.3 COS對生長育肥豬抗氧化功能的影響

由圖1可知，與對照組相比，COS組生長育肥豬血清T-AOC顯著提高(P<0.05)，而低能低蛋白質+COS組則無顯著差異(P>0.05)。同樣，與對照組相比，COS組生長育肥豬血清MDA含量顯著降低(P<0.05)，而低能低蛋白質+COS組則無顯著差異(P>0.05)。

數據柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。

由圖2可知，與對照組相比，COS組生長育肥豬肝臟GPx1 mRNA相對表達量顯著提高(P<0.05)，COS組和低能低蛋白質+COS組生長育肥豬肝臟GPx4 mRNA相對表達量均顯著提高(P<0.05)。此外，COS組生長育肥豬肝臟p53 mRNA相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)，而COS組和低能低蛋白質+COS組生長育肥豬肝臟Cu/Zn-SODmRNA相對表達量與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

圖2 COS對生長育肥豬肝臟抗氧化相關基因表達的影響

2.4 COS對生長育肥豬免疫功能的影響

由表5可知，與對照組相比，COS組生長育肥豬血清IgG和IgM含量顯著提高(P<0.05)，低能低蛋白質+COS組生長育肥豬血清IgM含量顯著提高(P<0.05)；其中，COS組血清IgG含量比對照組提高了15.0%(P<0.05)，血清IgM含量提高了6.0%(P<0.05)。此外，與對照組相比，COS組和低能低蛋白質+COS組生長育肥豬血清C4含量均顯著提高(P<0.05)，而COS組和低能低蛋白質+COS組生長育肥豬血清C3含量均無顯著差異(P>0.05)。

表5 COS對生長育肥豬免疫功能的影響

2.5 COS對生長育肥豬腸道黏膜形態的影響

由圖3和表6可知，COS組和低能低蛋白質+COS組生長育肥豬十二指腸、空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，COS組生長育肥豬十二指腸絨毛高度與隱窩深度的比值顯著提高(P<0.05)，而低能低蛋白質+COS組十二指腸、空腸和回腸絨毛高度與隱窩深度的比值與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

表6 COS對生長育肥豬腸道黏膜形態的影響

圖3 COS對生長育肥豬腸道黏膜形態的影響

3 討 論

3.1 COS對生長育肥豬生長性能的影響

目前，COS對豬生長性能影響的研究多集中在仔豬上，在生長育肥豬中的研究較少，而生長育肥階段是商品豬養殖周期中持續時間最長、消耗飼糧最多的階段，因此，研究COS對生長育肥豬飼料轉化率以及生長性能的影響具有重要意義。Yang等[7]研究表明，飼糧添加0.04%和0.06%COS均可顯著提高斷奶仔豬的平均日增重；魏亞浩等[8]研究表明，仔豬飼糧添加COS復合物能夠提高仔豬平均日采食量和平均日增重；Liu等[9]也研究表明，飼糧添加100和200 mg/kg COS能夠顯著提高斷奶仔豬平均日采食量和平均日增重，降低料重比，同時能夠顯著提高斷奶仔豬對飼糧總能、干物質和粗蛋白質的消化率；Walsh等[10]在斷奶仔豬飼糧中添加不同分子量的COS，發現分子量在5～50 ku的COS能夠顯著提高斷奶仔豬平均日增重和降低料重比，同時能提高糞便中乳酸菌數量和降低大腸桿菌數量。以上研究均提示COS在改善仔豬生長性能方面具有良好的效果。在生長育肥豬上，楊偉麗等[11]研究表明，飼糧添加40 mg/kg低聚殼聚糖能夠顯著提高生長育肥豬平均日采食量，可在一定程度上提高平均日增重和降低料重比。本研究結果表明，基礎飼糧中添加30 mg/kg COS能夠顯著降低生長育肥豬料重比，提高飼料利用率；同時，在低能低蛋白質飼糧中添加30 mg/kg COS對生長育肥豬的平均日增重和料重比均無顯著影響，這表明在降低飼料生產成本的前提下，添加COS具有良好的經濟效益。COS對動物生長性能的改善作用可能與其對腸道功能的改善有關。研究表明，COS能夠增強腸道消化吸收功能、改善腸道微生物環境和改善腸道形態，以此達到提高飼料利用率的效果[12]。

3.2 COS對生長育肥豬肉品質的影響

近年來豬肉品質越來越受到消費者關注，肉品質主要由肌肉的理化特性所決定，其化學組成與肌肉的營養價值密切相關，而物理指標如系水力、嫩度和肉色等則直接影響著消費者對肌肉的感官感受。肌苷酸是肌肉在熟化過程中產鮮味的重要物質，也是肌肉中提供鮮味最重要的物質之一。Koohmaraie等[13]研究發現，飼糧添加COS可提高肉仔雞肌肉中肌苷酸的含量，進而提高肌肉風味。本試驗也發現，生長育肥豬飼糧添加30 mg/kg COS可顯著提高背最長肌中肌苷酸的含量。對于氨基酸而言，常將天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸這6種具有鮮味的氨基酸稱為鮮味氨基酸。呂成才等[14]報道了在黃河鯉魚飼糧中添加不同水平COS改變了肌肉氨基酸的組成；董琦等[15]報道了在刺參餌料中添加0.5% COS能夠改變刺參體壁氨基酸組成。本試驗結果表明，基礎飼糧添加COS能夠提高生長育肥豬背最長肌中谷氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸這3種鮮味氨基酸的含量。Yin等[16]研究表明，在生長豬飼糧中添加0.01%COS能夠促進氨基酸進入門靜脈，提高生長豬機體蛋白質合成，其潛在的機制可能與COS調控后腸菌群參與氨基酸的代謝有關。相關報道也提出低聚木糖可能通過調控后腸菌群的氨基酸和蛋白質代謝，進而影響生長育肥豬肌肉氨基酸的組成[17-18]。此外，李陽[19]研究表明，飼糧添加120 mg/kg COS顯著提高肉雞肌肉a*值。本試驗結果表明，飼糧添加COS顯著降低生長育肥豬背最長肌L*值，改善肉色。脂質氧化是影響肉品質的重要因素，并影響諸如味道、香氣、顏色、質地和營養價值等屬性[20]，COS抗氧化作用可能是其改善肉質的重要的原因之一。目前關于COS對肉品質改善的作用機理尚不明確，有待進一步研究。

3.3 COS對生長育肥豬抗氧化功能的影響

在生長育肥豬養殖過程中，許多因素會導致機體內產生大量自由基，當機體處在正常的代謝狀態時，機體會處在不斷產生自由基與清除自由基的動態平衡狀態。而在養殖過程中此動態平衡被破壞時，如飼料污染、高溫、高代謝負擔以及長時間運輸等均會造成機體產生過多的自由基，而過多的自由基會與組織、血液或細胞等相結合，造成氧化損傷，影響動物機體的免疫功能[21-22]。COS抗氧化性的研究表明，COS清除自由基的能力會隨著COS水平的提高而增強，其作用機制可能是COS分子中的銨根離子所提供的單電子是清除自由基的根源。申杰等[23]在對COS保護小鼠肝臟的試驗中發現，COS可降低小鼠血清MDA含量，并可顯著抑制由高血脂導致的脂質過氧化物大量堆積而對肝臟的氧化損傷。陳偉軍等[24]報道了飼糧中添加COS能夠提高凡納濱對蝦血清T-AOC和超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低肌肉組織中的MDA含量。Xie等[25]研究表明，妊娠母豬飼糧中添加COS可顯著提高血漿SOD活性，血漿MDA含量呈下降趨勢，胎盤組織中抗氧化基因，如Cu/Zn-SOD和過氧化氫酶(CAT)的mRNA表達量提高，提示妊娠后期母豬飼糧中添加COS可增強母豬的抗氧化功能。在斷奶仔豬上，劉媛媛等[26]研究表明，飼糧添加COS能夠顯著提高斷奶仔豬血清SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和T-AOC，改善機體的抗氧化功能。本試驗結果表明，基礎飼糧添加COS可顯著提高生長育肥豬血清T-AOC，并顯著降低血清MDA含量；在肝臟抗氧化指標方面，本試驗結果也表明，COS組生長育肥豬肝臟抗氧化基因GPx1、GPx4和p53的mRNA相對表達量均顯著提高。這些結果提示COS能夠提高生長育肥豬機體抗氧化功能，從而緩解生長育肥豬在養殖過程中氧化應激對機體造成的損傷。

3.4 COS對生長育肥豬免疫功能的影響

血清中免疫球蛋白和補體的含量可反映機體免疫能力的強弱。免疫球蛋白是體液免疫應答中的重要免疫成分，在抗原刺激的情況下可轉為抗體，發揮抗菌、抗病毒的功能[27]。機體補體系統是免疫系統中重要的部分，C3是激活補體途徑中重要的中心環節，C4是激活補體途徑中的重要組成成分，可協同抗體發揮對病原微生物的清除作用。COS能夠作用于機體免疫器官和免疫細胞，并影響相關免疫細胞因子的表達和分泌從而調節機體的免疫。劉瑩瑩等[28]研究表明，母豬飼糧中添加低聚殼聚糖能夠提高母豬初乳中IgG、IgA和IgM含量，同時提高仔豬血清IgG和IgA含量。Ho等[29]也報道了在母豬妊娠后期補充COS會顯著提高母豬和仔豬血清IgM、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量及母豬糞便中sIgA含量。陳虹等[30]在鵪鶉飼糧中添加COS可以顯著提高鵪鶉血清C3含量。孫夢潔[31]研究發現，在俄羅斯鱘基礎飼糧中添加COS也能夠顯著提高血清C3含量。本試驗結果表明，飼糧添加30 mg/kg COS也可顯著提高生長育肥豬血清中IgG和IgM的含量，同時也顯著提高血清C4含量；此外，在低能低蛋白質飼糧中添加30 mg/kg COS也可顯著提高血清IgM和C4含量，這提示飼糧中添加COS具有提高生長育肥豬血清免疫功能的作用。

3.5 COS對生長育肥豬腸道黏膜形態的影響

腸道是機體對營養物質進行消化吸收的重要場所，腸絨毛是小腸的重要組成，不僅對營養物質的吸收起到至關重要的作用，而且絨毛規律的擺動也可阻止有害微生物的定植[32]。絨毛高度增長可導致小腸與營養物質的接觸面積增加，從而增加小腸對營養的吸收能力，因此小腸絨毛高度與機體的生長性能緊密相關[33]。研究表明，COS能夠促進腸道隱窩細胞增殖活性來改善腸道形態，從而提高養分消化利用效率[34]。史宇濤等[35]研究發現，飼糧中添加COS能夠提高白羽肉雞十二指腸絨毛高度，降低空腸隱窩深度。張鑫海等[36]也報道了飼糧中添加COS可顯著降低斷奶仔豬空腸隱窩深度。Walsh等[37]研究表明，飼糧中添加COS可提高斷奶仔豬十二指腸及空腸的絨毛高度和絨毛高度與隱窩深度的比值，從而提高機體對營養物質的吸收能力。本試驗結果表明，COS能夠提高生長育肥豬十二指腸的絨毛高度與隱窩深度的比值。結合生長性能結果，飼糧添加COS顯著降低了生長育肥豬的料重比，提示COS可能是通過提高小腸絨毛高度與隱窩深度的比值，提高腸道的消化吸收能力，進而提高生長育肥豬對飼糧的利用效率。

4 結 論

本研究結果表明，基礎飼糧添加30 mg/kg COS能夠顯著降低生長育肥豬的料重比，提高飼料轉化率。低能低蛋白質飼糧中添加30 mg/kg COS對生長育肥豬的生長性能無顯著影響，表明在降低飼糧成本的前提下，添加COS具有良好的經濟效益。此外，基礎飼糧中添加COS可在一定程度上提高生長育肥豬肌肉中風味物質肌苷酸、谷氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸的含量。同時，基礎飼糧中添加COS可以增強生長育肥豬免疫功能和抗氧化功能以及改善腸道黏膜形態。