長期飼喂羅伊氏乳酸桿菌對豬皮下脂肪及肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達的影響

田志梅 崔藝燕 魯慧杰 余 苗 劉志昌 李貞明 容 庭 馬現(xiàn)永,2* 馬新燕*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，畜禽育種國家重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東省畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評定工程技術(shù)研究中心，廣州 510640；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室茂名分中心，茂名 525000)

20世紀40年代初，偶然發(fā)現(xiàn)低劑量抗生素可促進動物生長后[1]，抗生素便開始作為促生長劑廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)[2]。然而，隨著抗生素應(yīng)用研究的發(fā)展，抗生素通過引起酶結(jié)構(gòu)破壞或失活、藥物靶標位點的改變以及阻礙微生物細胞靶標位點的通透性等，導(dǎo)致細菌產(chǎn)生抗性基因，產(chǎn)生抗生素抗性。同時，抗生素隨著食物鏈的生物傳遞，在人體富集，威脅人類健康[3-4]。

研究發(fā)現(xiàn)，益生菌具有促生長、提高飼料利用率[5]、調(diào)節(jié)動物胃腸道消化吸收及免疫等功能[6-7]，與抗生素同樣具有促生長作用，可應(yīng)用于動物生產(chǎn)[8]。羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillusreuteri1，LR1)是人類、小鼠、豬及雞等胃腸道主要菌群之一[9-11]，用于動物生產(chǎn)具有安全性、穩(wěn)定性高的特點，其可有效提高動物生長性能、預(yù)防腹瀉、緩解應(yīng)激、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，是良好的免疫調(diào)節(jié)飼料添加劑[9]。研究發(fā)現(xiàn)，LR1對仔豬腸上皮細胞(IPEC-1)具有很好的黏附作用，其抑制腸毒性大腸埃希桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)對IPEC-1細胞的黏附作用，通過肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light-chain kinase，MLCK)信號通路調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達，從而保護腸上皮細胞免于大腸桿菌引起的細胞屏障功能的損傷[12-13]。前期研究表明，LR1或抗生素均可有效促進仔豬及生長肥育豬生長[7,14]，LR1與抗生素通過不同的脂肪代謝信號通路調(diào)節(jié)背最長肌中脂肪酸含量，導(dǎo)致豬肉肌內(nèi)脂肪含量的差異，從而對豬肉品質(zhì)產(chǎn)生不同的影響[15]。目前，研究多聚焦在益生菌對動物生長性能、消化吸收功能、腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)、肌肉組織代謝及肉品質(zhì)等研究，然而，長期飼喂LR1對豬皮下脂肪、肝臟組織的脂肪代謝相關(guān)基因表達調(diào)控的研究鮮有報道。因此，本研究通過在飼糧中添加LR1飼喂21 d斷奶仔豬至肥育豬，旨在研究長期飼喂LR1對肥育豬的背脂、腹脂等皮下脂肪以及肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達的影響，闡明LR1與抗生素對豬皮下脂肪及肝臟脂肪代謝的影響差異，進一步揭示LR1與抗生素調(diào)控豬生長及生理的區(qū)別機制，為LR1在生豬養(yǎng)殖應(yīng)用的可行性及優(yōu)勢提供理論支撐，同時，為其在生豬養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及設(shè)計

選取144頭體重為(6.49±0.04) kg的21日齡三元雜交(杜×長×大)斷奶仔豬，隨機分為3組，每組8個重復(fù)，每個重復(fù)6頭。對照1組飼喂基礎(chǔ)飼糧[參照NRC(2012)配制]，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，對照2組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加抗生素的試驗飼糧，仔豬階段添加喹乙醇(100 mg/kg)和金霉素(75 mg/kg)，在生長肥育豬階段添加金霉素(75 mg/kg)，LR1組飼喂全程在基礎(chǔ)飼糧中添加5×1010CFU/kg LR1的試驗飼糧。飼養(yǎng)175 d后進行屠宰、樣品采集。試驗期間，采取自由采食及飲水方式進行飼養(yǎng)，試驗結(jié)束后進行稱重。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

1.2 屠宰及樣品采集[16-17]

試驗結(jié)束進行動物稱重，每個重復(fù)選取1頭接近平均體重的肥育豬進行電擊處死后，立即進行組織分離，將組織樣放于冰上。取3 g背脂及腹脂組織，分別分裝到3個1.5 mL的EP管中。取肝臟組織約3 g，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去表面血液，并去除表面水分后，分裝到3個1.5 mL的EP管中。取左側(cè)胴體第10根肋骨與第11根肋骨間對應(yīng)部位背部及腹部皮下脂肪組織3 g，分裝到3個1.5 mL的EP管中。樣品立即放于液氮中，最終轉(zhuǎn)移到-80 ℃保存，以備后續(xù)檢測。

1.3 脂肪代謝相關(guān)基因表達

利用實時熒光定量PCR(real-time qPCR)方法檢測背脂、腹脂及肝臟組織中膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1β(carnitine palmitoyl transferase-1 beta，CPT-1β)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、過氧化物酶體增殖物激活受體α/γ(peroxisome proliferator-activated receptor alfa/gamma，PPARα/PPARγ)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoyl CoA desaturase，SCD)、脂肪酸結(jié)合蛋白-1(fatty acid transport protein-1，F(xiàn)ATP-1)、甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)脂肪代謝相關(guān)基因的相對表達量。取100 mg皮下脂肪或肝臟組織樣品，用Trizol試劑盒提取的總RNA(TaKaRa，日本)溶解在RNase-free水中，利用試劑盒(TaKaRa，Cat. #RR047A)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行real-time qPCR檢測分析。反應(yīng)體系(20 μL)：2 μL cDNA，10 μL SYBR Green mix(Bio-Rad，1725265)，上、下游引物各0.8 μL (100 nmol/L)，6.4 μL ddH2O。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，3 min；變性95 ℃，15 s；退火30 s；延伸72 ℃，30 s；39個擴增循環(huán)。β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，并采用2-△△Ct方法計算目的基因相對表達量。real-time qPCR引物序列見表2。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)利用Prism 6(Graphpad Software，Inc)軟件進行作圖，并根據(jù)Tukey’s one-way ANOVA方法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)以平均值(mean)表示，P<0.05代表具有統(tǒng)計顯著性，0.05

2 結(jié) 果

2.1 長期飼喂LR1對豬腹脂脂肪代謝相關(guān)基因表達的影響

由圖1可知，與對照1組相比，對照2組腹脂SREBP、ACC、FAS、SCD及ATGL基因相對表達量顯著增加(P<0.05)，長期飼喂LR1顯著提高腹脂F(xiàn)ATP-1基因相對表達量(P<0.05)，對照2組及LR1組腹脂CPT-1β、PPARα及PPARγ基因相對表達量均無顯著差異(P>0.05)。與對照2組相比，添加LR1顯著降低腹脂SREBP、ACC及SCD基因相對表達量(P<0.05)，不影響腹脂中CPT-1β、FAS、PPARα、FATP-1、PPARγ及ATGL基因相對表達量(P>0.05)。

SREBP：膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 sterol regulatory element binding protein；ACC：乙酰輔酶A羧化酶 acetyl CoA carboxylase；CPT-1β：肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1β carnitine palmitoyl transferase-1 beta；FAS：脂肪酸合成酶 fatty acid synthase；PPARα/PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體α/γ peroxisome proliferator-activated receptor alfa/gamma；SCD：硬脂酰輔酶A去飽和酶 stearoyl CoA desaturase；FATP-1：脂肪酸結(jié)合蛋白-1 fatty acid transport protein-1；ATGL：甘油三酯脂酶 adipose triglyceride lipase。

2.2 長期飼喂LR1對豬背脂脂肪代謝相關(guān)基因表達的影響

由圖2可知，與對照1、2組相比，添加LR1顯著增加背脂PPARγ基因相對表達量(P<0.05)。與對照1組相比，對照2組背脂SCD及ATGL基因相對表達量顯著提高(P<0.05)，LR1組背脂SCD基因相對表達量顯著降低(P<0.05)，對照2組及LR1組背脂SREBP、ACC、CPT-1β、FAS、PPARα及FATP-1基因相對表達量無顯著差異(P>0.05)。與對照2組相比，LR1組背脂ACC、FAS及SCD基因相對表達量顯著降低(P<0.05)，SREBP、CPT-1β、PPARα、FATP-1及ATGL基因相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

圖2 長期飼喂LR1對豬背脂脂肪代謝相關(guān)基因表達的影響

2.3 長期飼喂LR1對豬肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達的影響

由圖3可知，與對照1組相比，對照2組及LR1組肝臟中SREBP、ACC、FAS及SCD基因相對表達量顯著降低(P<0.05)，CPT-1β、PPARα、FATP-1、PPARγ及ATGL基因相對表達量無顯著差異(P>0.05)。與對照2組相比，LR1組肝臟中SREBP、ACC、CPT-1β、FAS、PPARα、SCD、FATP-1、PPARγ及ATGL基因相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

圖3 長期飼喂LR1對豬肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達的影響

3 討 論

3.1 長期飼喂LR1對肥育豬生長性能及胴體品質(zhì)的影響

豬的胴體性狀直接反映豬的胴體品質(zhì)，主要包括胴體重、背膘厚、眼肌面積、胴體率及無脂瘦肉指數(shù)等，是豬生產(chǎn)性能及經(jīng)濟價值的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn)，長期飼喂抗生素有提高豬體重的趨勢，但不影響肥育豬的胴體重及胴體率。Lowell等[19]指出，長期飼喂抗生素不影響肥育豬體重、胴體重、胴體率及眼肌面積等胴體性狀，其研究結(jié)果與本研究基本一致，但抗生素使用品種及方式的差異導(dǎo)致其對肥育豬體重影響的差異。目前，LR1多應(yīng)用于仔豬生產(chǎn)，具有促進仔豬生長、改善腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)、緩解應(yīng)激、提高仔豬免疫等功效[14,20-21]，然而其在生長肥育豬中的研究較少。前期研究發(fā)現(xiàn)，長期飼喂LR1具有提高肥育豬體重的趨勢，其促生長效果與抗生素?zé)o顯著差異；而且相比抗生素具有顯著增加肥育豬胴體重的優(yōu)勢[7,14-15]。因此，LR1可作為益生菌飼料添加劑應(yīng)用于仔豬及生長肥育豬生產(chǎn)。Dowarah等[22]報道，益生菌-乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)不影響生長肥育豬的體重及胴體性狀，而Alexopoulos等[23]指出地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)及枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)益生菌的復(fù)合使用顯著提高豬生長性能及胴體品質(zhì)的。因此，益生菌的品種及使用劑量影響其對豬生長及生產(chǎn)性能的作用效果，而LR1具有良好的益生作用，促進豬生長，可應(yīng)用于生豬養(yǎng)殖生產(chǎn)。前期研究也發(fā)現(xiàn)，LR1或抗生素均可顯著提高仔豬生長性能，長期飼喂LR1或抗生素有提高肥育豬體重的趨勢，而不影響肥育豬平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)及料重比(F/G)等生長性能，以及胴體重、背膘厚等胴體性狀；而與抗生素相比，長期飼喂LR1顯著增加肥育豬胴體率，但對終體重、胴體重、背膘厚及眼肌面積的影響不顯著[7,14-15]。因此，與抗生素相比，LR1顯著增加肥育豬胴體率，不影響其他胴體性狀，LR1具有促生長及提高肥育豬胴體品質(zhì)的作用，且其總體效果優(yōu)于抗生素。此外，長期飼喂抗生素降低豬肉風(fēng)味，而與抗生素相比，LR1通過降低肌肉滴水損失、剪切力以及改變肌纖維特性降低豬肉品質(zhì)，增加豬肉風(fēng)味游離氨基酸含量及肌苷酸含量，改善豬肉風(fēng)味[15]。因此，LR1有效提高生長速度及胴體品質(zhì)，改善豬肉品質(zhì)及風(fēng)味，具有與抗生素同樣的促生長作用，其應(yīng)用于生豬生產(chǎn)是可行的。

3.2 長期飼喂LR1對肥育豬皮下脂肪組織脂肪代謝的影響

隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們對豬肉的安全及品質(zhì)需求日益增加，消費者對豬肉的喜好和要求更明確，對肥肉的需求量低，瘦肉需求量逐漸增加。脂肪沉積是生豬主要的經(jīng)濟性狀之一，脂肪組織的沉積部位直接影響胴體性狀、肉品質(zhì)及經(jīng)濟價值。背脂及腹脂等皮下脂肪影響豬的胴體性狀，皮下脂肪的脂肪代謝影響豬的脂肪沉積及瘦肉率，從而影響豬的胴體品質(zhì)的肉用經(jīng)濟價值。脂肪酸通過轉(zhuǎn)運、合成、分解等脂肪代謝過程協(xié)同調(diào)控機體脂肪沉積[24]，因此，皮下脂肪代謝調(diào)控的研究對闡明胴體性狀、瘦肉率，提高生產(chǎn)性能具有重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照1組相比，對照2組(長期飼喂抗生素)腹脂SREBP、ACC、FAS、SCD及ATGL基因相對表達量提高，而長期飼喂LR1提高腹脂F(xiàn)ATP-1基因相對表達量；而與抗生素相比，LR1降低腹脂中SREBP、ACC及SCD基因相對表達量。SREBP作為脂肪合成的候選基因，通過影響膽固醇、脂肪酸、甘油三酯及磷脂等相關(guān)酶或基因的表達從而調(diào)控脂肪合成代謝[18,25]。ACC催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酸單酰輔酶A，從而促進脂肪酸的從頭合成。FAS通過催化乙酰輔酶A及丙二酰輔酶A合成長鏈脂肪酸，是體內(nèi)脂肪酸從頭合成過程中關(guān)鍵的限速酶，F(xiàn)AS基因相對表達量及活性直接影響動物體脂的沉積[18,26]。SCD直接調(diào)控C16∶1及C18∶1單不飽和脂肪酸的從頭合成，從而調(diào)節(jié)脂肪酸代謝[27-28]，而ATGL在皮下脂肪組織中高度表達，與脂肪發(fā)育及成熟密切相關(guān)，水解儲存的甘油三酯的第1個酯鍵，釋放非酯化的游離脂肪酸[29-30]。FATP-1一方面特異性結(jié)合脂肪酸，尤其是長鏈不飽和脂肪酸，參與脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運；另一方面與脂肪酸的酰基化相關(guān)，參與動物脂肪代謝及沉積[31-32]。由此可見，長期飼喂抗生素增加肥育豬腹脂組織的合成代謝及分解代謝，而LR1增加肥育豬腹脂組織中脂肪酸的轉(zhuǎn)運。此外，與抗生素相比，長期飼喂LR1顯著降低肥育豬腹脂組織中的脂肪合成代謝。因此，抗生素通過SREBP基因上調(diào)下游ACC、FAS及SCD基因相對表達量，從而提高肥育豬腹脂的脂肪合成代謝，同時通過ATGL限速酶增加腹脂的脂肪分解代謝；LR1則通過增加脂肪酸轉(zhuǎn)運代謝及降低脂肪酸合成代謝，降低脂肪酸在肥育豬腹脂組織中的沉積。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照1相比，長期飼喂抗生素顯著提高背脂中SCD及ATGL基因相對表達量，表明抗生素不僅通過誘導(dǎo)SCD基因的表達提高背脂的脂肪合成代謝，同時也通過增加ATGL基因的表達促進背脂的脂肪分解代謝，這說明了抗生素不影響肥育豬背膘厚的原因。本研究結(jié)果顯示，與抗生素相比，LR1顯著降低背脂ACC、FAS及SCD基因相對表達量，同時也增加背脂PPARγ基因相對表達量；而與對照組相比，LR1降低背脂SCD基因相對表達量，提高PPARγ基因相對表達量。PPAR是調(diào)節(jié)脂肪代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，而PPARγ作為PPARs超家族成員，主要在脂肪組織中表達，參與調(diào)控脂肪分化、轉(zhuǎn)運及細胞中脂質(zhì)沉積等代謝過程[18,33-34]。然而，LR1不影響FATP-1基因相對表達量，因此，LR1可能通過PPARγ調(diào)控下游其他脂肪酸轉(zhuǎn)運及沉積代謝。由此可見，LR1通過下調(diào)肥育豬背脂中ACC、FAS及SCD等相關(guān)基因相對表達量，降低背脂的脂肪合成代謝；可能通過上調(diào)肥育豬背脂中PPARγ基因相對表達量，提高脂肪酸背脂沉積代謝，從而導(dǎo)致其不影響肥育豬背膘厚的胴體性狀。

Rejinders等[35]指出萬古霉素及阿莫西林抗生素上調(diào)脂肪組織的氧化信號通路，而Renu等[36]報道阿霉素通過PPARγ降低脂肪組織的脂肪合成，通過ATGL及PPARα降低脂肪組織的氧化代謝。Torres等[37]研究指出益生菌通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，以及脂肪組織的脂肪因子、炎癥因子等調(diào)控脂肪組織的代謝，調(diào)節(jié)體重及健康。Kim等[38]報道高加索酸奶乳桿菌(LactobacilluskefiriDH5)通過誘導(dǎo)PPAR-α、FABP4及CPT1基因的表達，增加脂肪組織的脂肪酸氧化分解，從而抵抗肥胖。而Park等[39]指出淀粉乳桿菌KU4(LactobacillusamylovorusKU4)通過調(diào)控PPARγ-PGC-1α轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，促進白色脂肪向褐色脂肪的轉(zhuǎn)化，從而減少皮下脂肪的脂肪沉積。因此，益生菌菌種或抗生素種類的差異可能通過不同的信號通路及靶標基因調(diào)節(jié)脂肪組織的脂肪代謝。

3.3 長期飼喂LR1對肥育豬肝臟脂肪代謝的影響

除了脂肪組織，肝臟也是脂肪合成的重要場所，其在機體脂肪代謝中起到關(guān)鍵性作用。食物脂肪經(jīng)胃腸道消化吸收生成甘油三酯，其與載脂蛋白結(jié)合形成乳糜顆粒進入血液，一方面，經(jīng)由肝臟合成脂肪酸后，與載脂蛋白或膽固醇結(jié)合形成極低密度脂蛋白微粒后，通過血液運輸?shù)缴眢w各部位，進行脂肪儲存或利用；另一方面，機體動員貯存脂肪水解為甘油及脂肪酸，釋放到血液后被肝細胞攝取，通過線粒體β氧化作用產(chǎn)生能量，供機體生理活動需要。因此，肝臟是機體脂類合成及分解的代謝中心，其通過脂肪酸氧化、合成及脂蛋白的攝取、分泌動態(tài)平衡，調(diào)控機體脂肪代謝，該平衡被破壞則導(dǎo)致脂肪代謝疾病。本研究結(jié)果表明，抗生素及LR1均顯著降低肝臟中SREBP、ACC、FAS及SCD基因相對表達量，而不影響PPARα、CPT-1β、FATP、PPARγ及ATGL基因相對表達量。PPARα調(diào)控肝臟脂肪分化及β氧化作用[40]，而CPT-1β是脂肪酸β氧化過程中的關(guān)鍵限速酶[41]，ATGL是脂肪酸水解作用的關(guān)鍵限速酶[29]，PPARγ通過控制下游FATP等脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)控脂肪酸轉(zhuǎn)運，影響脂肪轉(zhuǎn)運及沉積[18,31-32]。由此可見，抗生素及LR1均通過SREBP調(diào)控下游基因ACC、FAS及SCD的表達，從而降低肝臟的脂肪合成代謝，而不影響肝臟的分解、轉(zhuǎn)運及沉積。Cho等[42]也指出抗生素或益生菌可調(diào)控肝臟脂肪代謝，而Renu等[36]報道抗生素的使用損傷肝臟脂肪代謝。Yi等[43]研究發(fā)現(xiàn)LR1調(diào)控斷奶仔豬肝臟脂肪代謝，Wang等[44]報道谷物乳桿菌(Lactobacillusfrumenti)可提高仔豬肝臟脂肪酸的β氧化作用，而與本研究結(jié)果存在差異，可能由于菌種或豬的生長階段導(dǎo)致研究結(jié)果的差異。

此外，前期研究結(jié)果表明，抗生素通過上調(diào)SREBP基因相對表達量誘導(dǎo)下游基因ACC的表達，提高背最長肌的脂肪合成代謝，而通過上調(diào)PPARα及ATGL基因相對表達量，增加背最長肌中脂肪酸的氧化及分解代謝，顯著降低背最長肌中肌內(nèi)脂肪的含量。然而，LR1通過誘導(dǎo)背最長肌中SCD基因相對表達量，促進背最長肌的合成代謝，而通過上調(diào)PPARα基因相對表達量提高背最長肌的分解代謝，而不影響肌內(nèi)脂肪含量。此外，LR1通過誘導(dǎo)PPARα、MyOD及PGC1α基因促進肌纖維的增殖及分化[15,40]。綜上所述，LR1與抗生素對不同組織的脂肪代謝調(diào)控存在差異，二者通過不同的基因調(diào)控皮下脂肪及肌肉組織的脂肪代謝。

4 結(jié) 論

① 長期飼喂LR1促進皮下脂肪的脂肪轉(zhuǎn)運代謝，而長期飼喂抗生素增加皮下脂肪的脂肪合成及分解代謝；與抗生素相比，LR1降低皮下脂肪的脂肪合成代謝。

② 長期飼喂LR1或抗生素均降低肥育豬肝臟的脂肪合成代謝，而不影響肝臟的轉(zhuǎn)運及分解代謝。

③ 抗生素及LR1對肥育豬脂肪代謝調(diào)控存在組織差異性，兩者通過不同的基因調(diào)控皮下脂肪的脂肪代謝，但二者對肝臟脂肪代謝的調(diào)控?zé)o顯著差異。