黑腹果蠅和斑翅果蠅對‘玫瑰香’葡萄酸腐病的影響

高歡歡，覃冬云，陳迎春，代曉彥，吳新穎*

（1. 山東省葡萄研究院，山東濟南 250100；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，山東濟南 250100）

葡萄酸腐病是果實采收期較為普遍的病害，主要表現(xiàn)為果實組織軟化腐爛，呈現(xiàn)明顯的醋酸氣味，腐爛流出的汁液到達處引起進一步的感染，導致整穗葡萄染病腐爛，造成產(chǎn)量下降，嚴重時可導致絕產(chǎn)[1-3]。

由機械損傷或者氣候原因、園區(qū)管理不當導致的果實裂果，給多種病原菌的侵染創(chuàng)造了有利條件，包括酵母菌、醋酸菌、真菌等[4-7]。Gao等[8]于2020年從山東煙臺地區(qū)采集腐爛葡萄，經(jīng)過分離鑒定，發(fā)現(xiàn)桔青霉（Penicillium citrinum）、層生鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、尖孢枝孢菌（Cladosporium oxysporum）、青霉菌（P. georgiense）、細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）、黑曲霉（Aspergillus niger）、棘孢曲霉（A. aculeatus）、米曲霉（A.oryzae）與葡萄酸腐病密切相關。除此之外，果蠅也被認為是葡萄酸腐病重要的誘發(fā)因子和傳播媒介，其中最廣為人知的是黑腹果蠅（Drosophila melanogaster），是因醋酸菌以及酵母菌釋放的代謝物質(zhì)吸引而來，通過取食葡萄加速其腐爛[9]。但黑腹果蠅與特定真菌病原菌的關系并未有相關報道。另外，對葡萄生長期果蠅的發(fā)生規(guī)律進行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，黑腹果蠅主要發(fā)生在葡萄成熟期，而在始熟時誘集到大量的斑翅果蠅（D. suzukii）成蟲[10]。也有報道證明，黑腹果蠅更偏好在腐爛的葡萄上產(chǎn)卵，而斑翅果蠅則偏好在完好的葡萄上產(chǎn)卵，二者的取食侵害可顯著促進腐爛葡萄中醋酸菌的生長[11]。但是斑翅果蠅是否能夠影響腐爛葡萄中真菌病原菌的致病性，并沒有明確的報道。

因此，以前期發(fā)現(xiàn)的桔青霉、層生鐮刀菌、尖孢枝孢菌、青霉菌、細極鏈格孢、黑曲霉、棘孢曲霉、米曲霉8種真菌為研究對象，通過將其與黑腹果蠅和斑翅果蠅分別聯(lián)合侵害葡萄的方式，觀察兩種果蠅是否影響真菌在葡萄上的發(fā)病情況，從而明確兩種果蠅與真菌病原菌的關系，為葡萄酸腐病的致病機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黑腹果蠅和斑翅果蠅

黑腹果蠅和斑翅果蠅來源于山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所的實驗室種群。飼養(yǎng)條件：溫度為25±1 ℃，相對濕度為60%±2%，光周期為16 h∶8 h（白天/黑夜）。

1.2 真菌

桔青霉、層生鐮刀菌、尖孢枝孢菌、青霉菌、細極鏈格孢、黑曲霉、棘孢曲霉、米曲霉菌株為山東省葡萄研究院自存菌株。用打孔器收取菌餅分別放置于PDA培養(yǎng)基中央，在溫度為25±1 ℃，相對濕度為60%±2%的人工氣候箱中培養(yǎng)3～7 d，在菌落直徑超過4 cm時取出，用于致病性試驗。

1.3 葡萄樣品

葡萄品種為‘玫瑰香’，于2020年8月采摘于濟南仲宮實驗站。采摘大小均一、成熟度一致的果穗（可溶性固形物16%）。剪取無損傷的果粒，用1%的NaClO溶液表面消毒1 min，然后在70%的酒精中浸泡1 min，用無菌水沖洗2次并晾干，用于致病性試驗。

1.4 致病性試驗

1.4.1 黑腹果蠅對8種真菌致病性的影響

用消毒解剖針在表面消毒過的健康葡萄中央刺一個2～3 mm深的小孔，以此模擬田間的機械損傷，用于下列試驗。處理1（DM）：將10粒刺傷的葡萄放置于直徑為15 cm培養(yǎng)皿中，收集10頭黑腹果蠅成蟲（雌雄比為1∶1）放入其中；處理2（Fungus1）：每種真菌分別制備濃度為1×106cfu/mL的孢子懸浮液，浸泡葡萄30 s，每10粒為1個重復；處理3（Fungus＋DM）：在葡萄上接種真菌后，收集10頭黑腹果蠅成蟲（雌雄比為1∶1）放入其中；處理4（CK）：以不接種真菌和黑腹果蠅的葡萄為對照。所有處理重復3次，置于27 ℃/25 ℃（白天/黑夜）和80% 濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在5 d和7 d后觀察葡萄的發(fā)病情況。病情分級標準采用5級記載法[12-13]。0級：無病斑；1級：病斑面積占果實面積5%以下；3級：病斑面積占果實面積5%～25%；5級：病斑面積占果實面積25%～50%；7級：病斑面積占果實面積50%～75%；9級：病斑面積占果實面積75%以上。發(fā)病率和病情指數(shù)按照如下公式統(tǒng)計：

x是相對級值；n是每一級值中發(fā)病葡萄的粒數(shù)；N是調(diào)查的葡萄總粒數(shù)。

1.4.2 斑翅果蠅對8種真菌致病性的影響

試驗設計參考1.4.1。處理5（DS）：將10粒表面消毒過的健康葡萄放置于直徑為15 cm培養(yǎng)皿中，同時放入10頭斑翅果蠅成蟲（雌雄比為1∶1）；處理6（Fungus 2）：每種真菌分別制備濃度為1×106cfu/mL的孢子懸浮液，將消毒過的葡萄在孢子懸浮液中浸泡30 s，取出后置于上述條件的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每10粒葡萄為1個重復；處理7（Fungus＋DS）：在葡萄上接種真菌后，放入10頭斑翅果蠅成蟲（雌雄比為1∶1）；處理8（CK2）：以不接種真菌和斑翅果蠅的葡萄為對照。每個處理重復3次。樣品培養(yǎng)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法同1.4.1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

4種處理條件下，對8種真菌的發(fā)病率、病情指數(shù)的顯著性差異進行S-N-K檢驗，顯著水平為P＜0.05。數(shù)據(jù)分析所用的軟件為SPSS 20.0。

2 結果與分析

2.1 黑腹果蠅對真菌致病性的影響

在模擬田間條件使葡萄存在機械損傷的情況下，各處理中葡萄的發(fā)病率均為100%。待培養(yǎng)5 d后，黑腹果蠅取食后葡萄的病情指數(shù)明顯高于對照。單獨接種8種真菌對葡萄的致病性明顯高于黑腹果蠅的為害程度。與真菌單獨侵染相比，黑腹果蠅和桔青霉、層生鐮刀菌、青霉菌、米曲霉聯(lián)合侵害葡萄，使其病情指數(shù)顯著降低。其中，青霉菌和黑腹果蠅復合侵害后葡萄的腐爛程度甚至低于單獨黑腹果蠅的為害程度。另外，黑腹果蠅對尖孢枝孢屬、細極鏈格孢、黑曲霉、棘孢曲霉的致病性沒有顯著影響（圖1）。

真菌和黑腹果蠅聯(lián)合侵害5 d時，由于黑腹果蠅的添加，真菌的菌絲面積減少；而取食7 d后，黑腹果蠅幼蟲的孵化使葡萄的腐爛程度迅速增加。此時，8種真菌聯(lián)合侵染的病情指數(shù)均高于單獨侵染時的數(shù)值，其中桔青霉、層生鐮刀菌、黑曲霉和棘孢曲霉的病情指數(shù)均高達100（圖2）。

2.2 斑翅果蠅對真菌發(fā)病率的影響

培養(yǎng)5 d后，斑翅果蠅可對所有的葡萄造成危害，發(fā)病率均為100%，顯著高于對照。尖孢枝孢菌和黑曲霉侵染葡萄后明顯低于斑翅果蠅的致腐率。與真菌單獨侵染相比，斑翅果蠅與真菌聯(lián)合侵害并沒有顯著影響葡萄的發(fā)病率。培養(yǎng)7 d后，斑翅果蠅和黑曲霉聯(lián)合侵害葡萄后，降低了黑曲霉的發(fā)病率。斑翅果蠅對其他7種真菌的發(fā)病率均無影響（圖3）。

2.3 斑翅果蠅對真菌病情指數(shù)的影響

在無機械損傷的前提下，分別接種真菌和斑翅果蠅，培養(yǎng)5 d后，真菌單獨侵染的病情指數(shù)高于對照組，卻明顯低于斑翅果蠅侵害后造成的葡萄病情指數(shù)。而斑翅果蠅與桔青霉、層生鐮刀菌、青霉菌、細極鏈格孢和棘孢曲霉聯(lián)合侵害后，與單獨接種真菌相比，葡萄腐爛程度明顯增加。斑翅果蠅與尖孢枝孢菌、米曲霉聯(lián)合侵害葡萄并沒有增加其致病能力，而黑曲霉在斑翅果蠅聯(lián)合侵害下反而降低了黑曲霉的致病能力（圖4）。

圖1 培養(yǎng)5 d后黑腹果蠅對8種真菌病情指數(shù)的影響Figure 1 Effects of D. melanogastor on disease index of eight fugus species after cultivating five days

圖2 培養(yǎng)7 d后黑腹果蠅對8種真菌病情指數(shù)的影響Figure 2 Effects of D. melanogastor on disease index of eight fugus species after cultivating sevne days

圖3 斑翅果蠅對8種真菌發(fā)病率的影響Figure 3 Effects of D. suzukii on morbidity of eight fugus species

圖4 培養(yǎng)5 d后斑翅果蠅對8種真菌病情指數(shù)的影響Figure 4 Effects of D. suzukii on disease index of eight fugus species after cultivating five days

圖5 培養(yǎng)7 d后斑翅果蠅對8種真菌病情指數(shù)的影響Figure 5 Effects of D. suzukii on disease index of eight fugus species after cultivating seven days

培養(yǎng)7 d后，各處理的葡萄病情指數(shù)均有所上升（圖5）。桔青霉、層生鐮刀菌、青霉菌、細極鏈格孢、棘孢曲霉與斑翅果蠅聯(lián)合侵害葡萄的病情指數(shù)明顯高于真菌單獨危害和斑翅果蠅單獨侵害。尖孢枝孢菌、黑曲霉、米曲霉與斑翅果蠅聯(lián)合侵害的病情指數(shù)與真菌單獨危害均無顯著差異，但仍低于斑翅果蠅對葡萄造成的損傷。

3 討論與結論

黑腹果蠅為腐生昆蟲，喜食腐爛食物，實則是取食腐爛食物中滋生的微生物或其代謝物質(zhì)，例如酵母以及醋酸菌的代謝產(chǎn)物[14]。研究中，黑腹果蠅真菌感染的葡萄上產(chǎn)卵初期，導致真菌菌絲面積明顯減少，桔青霉、層生鐮刀菌、青霉菌、米曲霉4種真菌的病情指數(shù)顯著降低，說明在卵未孵化時，黑腹果蠅的成蟲取食真菌菌絲而導致其發(fā)育受到抑制。而在黑腹果蠅產(chǎn)卵7 d后，孵化為幼蟲取食果肉，增強8種真菌的致病力。

目前，果蠅與葡萄酸腐病之間關系的研究主要以醋酸菌為研究對象。Ioriatti等[15]發(fā)現(xiàn)，完整的葡萄果實對醋酸菌的敏感性較低，而斑翅果蠅的產(chǎn)卵增加醋酸菌侵染的風險，而且斑翅果蠅卵孵化為幼蟲后，醋酸菌的數(shù)量以及乙酸的濃度比卵未孵化時要高，醋酸菌的代謝物質(zhì)誘集大量黑腹果蠅產(chǎn)卵取食，加重酸腐病的發(fā)生程度和面積[16]。但果蠅的取食并不能促進腐爛葡萄中畢赤酵母（Pichia terricola）、孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、株假絲酵母屬（Candida zemplinina）和結合囊酵母（Zygoascus hellenicus）等酵母屬真菌的發(fā)育[17]。以真菌為研究對象發(fā)現(xiàn)，完整新鮮的葡萄對8種真菌的敏感性明顯低于斑翅果蠅。斑翅果蠅的取食，可為桔青霉、層生鐮刀菌、青霉菌、細極鏈格孢和棘孢曲霉侵染提供更為有利的環(huán)境。但尖孢枝孢菌、米曲霉和黑曲霉并沒有由于斑翅果蠅的取食而增加其致病力。說明斑翅果蠅并不能促進腐爛葡萄中所有微生物的發(fā)育，且抑制黑曲霉的發(fā)育，可能是因為斑翅果蠅分泌的代謝物質(zhì)具有抑菌作用，但仍需要進一步的驗證。

另外，在人工飼料中的白地霉（Geotrichum candidum）和放射狀毛霉（Actinomucor elegans）增加了斑翅果蠅的繁殖量，而籃狀菌屬（Talaromyces minioluteus）則抑制了斑翅果蠅的發(fā)育[18]，但腐爛葡萄中真菌的侵染是否影響兩種果蠅的生長發(fā)育也需要進一步的研究。試驗首次將與葡萄酸腐病相關的真菌病害為對象，研究結果可為探索兩種果蠅、葡萄與真菌之間的關系提供重要的理論基礎。