賀蘭山東麓不同產(chǎn)區(qū)‘北紅’葡萄酒游離態(tài)香氣差異研究

李濤，劉成敏，單守明，李萍，韋偉，王巖璞，張穩(wěn)穩(wěn)

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

揮發(fā)性香氣物質(zhì)是影響葡萄酒風(fēng)味、品質(zhì)與典型性的主要因素之一，對(duì)葡萄酒風(fēng)味和品質(zhì)有著重要影響[1]。目前已有800多種揮發(fā)性香氣成分通過(guò)定性方法被鑒定，據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)主要被分為醇、醛、酮、酸、酯等種類[2-3]。其中大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)氣味不活躍，僅有少部分揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)葡萄酒的品種香氣起著關(guān)鍵影響[4]。按其揮發(fā)性可分為兩類：一類是對(duì)葡萄香氣構(gòu)成有直接貢獻(xiàn)，能同時(shí)引起嗅覺(jué)和味覺(jué)，具有揮發(fā)性的游離態(tài)香氣成分；另一類是沒(méi)有直接的香氣貢獻(xiàn)和揮發(fā)性的結(jié)合態(tài)香氣成分，但可以在葡萄酒發(fā)酵和陳釀過(guò)程中，被酵母糖苷酶水解或葡萄酒環(huán)境酸水解，轉(zhuǎn)變?yōu)閾]發(fā)的、可感知的游離態(tài)香氣物質(zhì)[5]，轉(zhuǎn)而協(xié)同游離態(tài)香氣成分影響葡萄酒的品種香氣。

葡萄酒游離態(tài)香氣成分是受多種因素共同作用的結(jié)果，除土壤、氣候、品種等自然因素外，還包括栽培技術(shù)、釀造工藝環(huán)境等人為因素的影響[6-7]。葡萄品種潛在優(yōu)良特征只有在適宜的地理及自然環(huán)境條件中才能得到充分表現(xiàn)，不同地域種植的相同品種也會(huì)因環(huán)境差異的影響而表現(xiàn)出不同的理化特性，使得所釀造的葡萄酒具有區(qū)域化品質(zhì)和風(fēng)味特征[8-11]。目前，我國(guó)在某一地域不同子產(chǎn)區(qū)同一葡萄品種香氣成分方面的研究還相對(duì)較少，所以研究葡萄酒在某一地域不同產(chǎn)區(qū)的特征性香氣成分，對(duì)分析葡萄酒產(chǎn)品風(fēng)味特征具有現(xiàn)實(shí)意義[12]。

為研究賀蘭山東麓不同子產(chǎn)區(qū)‘北紅’葡萄酒游離態(tài)香氣差異，選取2019年賀蘭山東麓不同酒莊的‘北紅’葡萄作為試材，利用頂空固相微萃取（HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法結(jié)合香氣活性值（Odor Activity Value，OAV）對(duì)青銅峽、銀川和永寧3個(gè)產(chǎn)區(qū)的‘北紅’葡萄酒的香氣成分進(jìn)行定性定量分析，檢測(cè)并篩選出各產(chǎn)區(qū)‘北紅’葡萄酒中的香氣成分含量和特征香氣活性值，采用多元統(tǒng)計(jì)分析學(xué)中的主成分分析（Principle Component Analysis，PCA）篩選出各產(chǎn)區(qū)‘北紅’葡萄酒中特有特征香氣成分，為賀蘭山東麓不同產(chǎn)區(qū)‘北紅’葡萄酒的鑒別和差異化研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以賀蘭山東麓3個(gè)產(chǎn)區(qū)2019年‘北紅’葡萄酒為試材。其原料分別選自寧夏華昊葡萄酒有限公司（青銅峽市甘城子鄉(xiāng)）、寧夏農(nóng)墾平吉堡生態(tài)莊園有限公司（銀川市西夏區(qū)）和中糧長(zhǎng)城葡萄酒（寧夏）有限公司（銀川市永寧縣）的葡萄園，栽培管理、采收時(shí)期等基本保持一致。

無(wú)水乙醇（色譜純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；2-辛醇（內(nèi)標(biāo)物），上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），日本島津公司；75 μm聚二甲基硅氧烷/碳分子篩/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB）萃取頭，美國(guó)Supelco公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HS-SPME法提取香氣

取葡萄酒樣5 mL，置于15 mL頂空瓶，并加入1 g NaCl，添加5 μL 2-辛醇（用無(wú)水乙醇稀釋200倍）作為內(nèi)標(biāo)物，密封頂空瓶，用已活化的75 μm聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB）萃取頭插入頂空瓶距離液面1 cm處，置于磁力攪拌加熱臺(tái)上，60 ℃萃取30 min，使頂空瓶中的揮發(fā)性物質(zhì)達(dá)到平衡狀態(tài)，然后從樣品瓶中取出萃取頭插入GC進(jìn)樣口，解析溫度250 ℃，解析時(shí)間5 min。

1.3.2 GC-MS條件

GC條件：汽化室溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣（純度≥99.999 %）；流速為1.5 mL/min，采用手動(dòng)進(jìn)樣，不分流進(jìn)樣模式；柱溫箱程序升溫：起始柱溫35 ℃，保持3 min，然后以4 ℃/min的速度升溫至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持8 min。

MS條件：離子源溫度為200 ℃，離子能量70 eV，電離方式EI，檢測(cè)器電源350 eV。

1.3.3 定性與定量分析

將未知物圖譜與NIST 98標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并初步鑒定，再結(jié)合保留時(shí)間、參考文獻(xiàn)、質(zhì)譜離子圖對(duì)香氣物質(zhì)進(jìn)行定性分析；以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行相對(duì)定量（假定校正因子為1），具體公式為：待測(cè)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的濃度＝(待測(cè)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的峰面積/內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積)×內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度。

1.4 環(huán)境溫度測(cè)定

3個(gè)產(chǎn)區(qū)2019年月均溫度數(shù)據(jù)源自www.tianqi.com。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Word 2012和IBM SPSS Statistics 23進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，采用OriginPro 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘北紅’葡萄酒游離態(tài)香氣成分定性與定量分析

如表1所示，共檢測(cè)出75種香氣成分，根據(jù)其化學(xué)式結(jié)構(gòu)和特征可分為脂類、醇類、酸類、醛類、酮類、呋喃類、烴類和其他8類。其中脂類物質(zhì)最多，有22種；其次是醇類18種和酸類13種；醛類、酮類、呋喃類、烴類和其他類物質(zhì)含量相對(duì)較少；呋喃類化合物只在青銅峽產(chǎn)區(qū)的葡萄酒中出現(xiàn)。

利用青銅峽產(chǎn)區(qū)葡萄釀造的‘北紅’葡萄酒共檢測(cè)出37種香氣物質(zhì)，如表1、圖1所示。其中，酯類15種，占總含量的43.79%；醇類8種，占總含量的51.86%；酸類8種，占總含量的2.97%；酮醛類2種，占總含量的0.79%；且脂類、醇類物質(zhì)與銀川和永寧產(chǎn)區(qū)間存在顯著性差異。相對(duì)含量最高的5種香氣成分為：苯乙醇占33.43%，乙酸乙酯占18.26%，異戊醇占14.36%，癸酸乙酯占11.57%，辛酸乙酯占6.45%。

表1 3個(gè)產(chǎn)區(qū)‘北紅’葡萄酒香氣成分及相對(duì)含量分析結(jié)果（部分）Table 1 Aroma components and relative content of 'Beihong' wines from three regions (part)

利用銀川產(chǎn)區(qū)葡萄釀造的‘北紅’葡萄酒共檢測(cè)出40種香氣物質(zhì)。其中，脂類10種，占總含量的46.91%；醇類14種，占總含量的41.91%；酸類6種，占總含量的6.86%；酮醛類4種，占總含量的1.80%。相對(duì)含量最高的5種香氣成分為：苯乙醇占23.50%，乙酸乙酯占19.78%，癸酸乙酯占13.71%，異戊醇占8.29%，辛酸乙酯占8.05%。

圖1 3個(gè)產(chǎn)區(qū)‘北紅’葡萄酒香氣種類及相對(duì)含量的比較Figure 1 Comparison of aroma types and relative content of'Beihong' wines from three regions

利用永寧產(chǎn)區(qū)葡萄釀造的‘北紅’葡萄酒共檢測(cè)出37種香氣物質(zhì)。其中，脂類13種，占總含量的44.47%；醇類8種，占總含量的43.83%；酸類8種，占總含量的5.88%；酮醛類5種，占總含量的4.34%。相對(duì)含量最高的5種香氣成分為：苯乙醇占34.02%，乙酸乙酯占20.39%），癸酸乙酯占10.21%，異戊醇占6.50%，辛酸乙酯占6.38%。

由以上分析可以發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)區(qū)‘北紅’葡萄酒的主要呈香物質(zhì)種類基本相同，這也很好的體現(xiàn)了‘北紅’葡萄酒的香氣特征，但同一品種在不同產(chǎn)區(qū)各類香氣物質(zhì)的種類和含量存在明顯差異，為更明確的了解3個(gè)產(chǎn)區(qū)葡萄酒的主體結(jié)構(gòu)和特征香氣成分，需通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析手段進(jìn)行分析和判定[14]。

2.2 特征香氣成分的活性值（OAV）比較

為進(jìn)一步明確各子產(chǎn)區(qū)間差異對(duì)葡萄酒香氣成分的影響，本研究對(duì)各類物質(zhì)的OAV值進(jìn)行了計(jì)算，列出了OAV＞0的成分，結(jié)果如表2所示。通常認(rèn)為化合物OAV＞1的成分對(duì)整體香氣有貢獻(xiàn)[15]。因此，由表2可以看出，OAV＞1的香氣成分有乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸戊酯和正壬醇，具有花香和果香的癸酸乙酯、辛酸乙酯在‘北紅’葡萄酒中更為突出。

在各產(chǎn)區(qū)特征香氣方面，乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯和乙酸戊酯只在青銅峽產(chǎn)區(qū)的葡萄酒中出現(xiàn)，具有花香和果香的香氣特征，或?yàn)榍嚆~峽產(chǎn)區(qū)葡萄酒特有的風(fēng)味；癸酸乙酯和辛酸乙酯在3個(gè)產(chǎn)區(qū)共同出現(xiàn)，具有花香和果香的香氣特征，或?yàn)?個(gè)產(chǎn)區(qū)葡萄酒共有的風(fēng)味；己酸乙酯出現(xiàn)在了青銅峽和銀川產(chǎn)區(qū)，具有青蘋果味、茴芹味的香氣特征，或?yàn)榍嚆~峽和銀川產(chǎn)區(qū)葡萄酒特有的風(fēng)味；正壬醇只出現(xiàn)在了銀川產(chǎn)區(qū)，具有塵土味、油脂味、未成熟花香味的香氣特征，或?yàn)殂y川產(chǎn)區(qū)葡萄酒特有的風(fēng)味。

表2 3個(gè)產(chǎn)區(qū)‘北紅’葡萄酒主要香氣成分的香氣活性值分析Table 2 Analysis of OAV of main aroma components of 'Beihong' wines from three regions

圖2 3個(gè)產(chǎn)區(qū)‘北紅’葡萄酒特征香氣組分主成分雙標(biāo)圖Figure 2 Double plots of characteristic aroma components and principal components of 'Beihong' wines from three regions

圖3 3個(gè)產(chǎn)區(qū)月均高溫與低溫比較Figure 3 Comparison of monthly average high temperature and low temperature from three regions

2.3 不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒特征香氣主成分分析

利用降維的思維，借助SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)賀蘭山東麓不同產(chǎn)區(qū)‘北紅’葡萄酒OAV＞0的香氣成分進(jìn)行主成分分析（圖2）。結(jié)果顯示，當(dāng)提取兩個(gè)主成分時(shí)，PC1&PC2兩個(gè)成分共同的累積分離度為95.208%，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）對(duì)所有參與分析參數(shù)的累積分離度分別為52.859%和42.349%，表明經(jīng)PCA處理分析得到的兩個(gè)成分因子對(duì)所選參數(shù)有極佳的分離描述度。

圖2是賀蘭山東麓3個(gè)產(chǎn)區(qū)在PC1和PC2上的雙標(biāo)圖。由圖2可知，青銅峽產(chǎn)區(qū)和永寧產(chǎn)區(qū)處在第四象限，且具有較高的得分關(guān)聯(lián)度。銀川產(chǎn)區(qū)處在第一象限，相較在PC1上的映射在PC2上明顯更大，說(shuō)明該產(chǎn)區(qū)對(duì)PC2的累積分離度最高，且銀川產(chǎn)區(qū)與PC1&PC2呈正相關(guān)。并且，銀川產(chǎn)區(qū)與青銅峽、永寧產(chǎn)區(qū)的香氣得分關(guān)聯(lián)度較低。由圖2可知，癸酸乙酯、乙酸異戊酯為青銅峽和永寧產(chǎn)區(qū)特有特征香氣物質(zhì)，呈果香味、花香、蠟質(zhì)味；己酸乙酯為銀川產(chǎn)區(qū)特有特征香氣物質(zhì)，呈茴芹味；辛酸乙酯為3個(gè)產(chǎn)區(qū)共有特征香氣成分，呈香蕉、梨、花香。

2.3 環(huán)境溫度對(duì)葡萄酒香氣種類及含量的影響

圖3為2019年全年3個(gè)產(chǎn)區(qū)月均低溫和月均高溫變化圖。由圖3可知，1—5月青銅峽和永寧產(chǎn)區(qū)的月均高溫持續(xù)高于銀川產(chǎn)區(qū)，溫差在1 ℃；6—7月銀川和永寧產(chǎn)區(qū)的月均高溫相同持續(xù)高于青銅峽產(chǎn)區(qū)；8月青銅峽和銀川產(chǎn)區(qū)的月均高溫相同且低于永寧產(chǎn)區(qū)；9月銀川和永寧產(chǎn)區(qū)的月均高溫相同且高于青銅峽產(chǎn)區(qū)。3—9月銀川和永寧產(chǎn)區(qū)月均低溫相同持續(xù)高于青銅峽產(chǎn)區(qū)，在7月時(shí)月均低溫溫差達(dá)到最大，為2 ℃。對(duì)比3個(gè)產(chǎn)區(qū)月均溫差（月均高溫-月均低溫）發(fā)現(xiàn)，在4月的溫差同時(shí)達(dá)到最大，青銅峽為16 ℃、銀川為14 ℃、永寧為15 ℃。綜合圖2對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在葡萄生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期內(nèi)（2—10月）銀川產(chǎn)區(qū)的月均溫度變化最為明顯，可初步認(rèn)為造成銀川產(chǎn)區(qū)與其他2個(gè)產(chǎn)區(qū)擁有不同特征香氣成分的原因可能與環(huán)境溫度變化有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

世界上任何一個(gè)葡萄酒產(chǎn)區(qū)都有其無(wú)法復(fù)制的地域性，單品種也會(huì)因海拔、氣候、土壤等環(huán)境因子的不同而表現(xiàn)出釀酒品質(zhì)的差異[28-29]，這與研究初步判定的環(huán)境溫度可能是造成產(chǎn)區(qū)間‘北紅’葡萄酒特征香氣成分差異的原因相一致。利用GC-MS和OAV對(duì)西班牙原產(chǎn)地的葡萄酒香氣特征進(jìn)行檢測(cè)、描述和比較，發(fā)現(xiàn)有的產(chǎn)區(qū)葡萄酒較為突出的是蔬菜氣味，而有的產(chǎn)區(qū)葡萄酒較為突出的是化學(xué)香氣，表明不同產(chǎn)區(qū)間具有典型的香氣特征[30]，這與研究中‘北紅’葡萄酒在銀川產(chǎn)區(qū)蔬菜氣味較為突出，青銅峽和永寧產(chǎn)區(qū)水果香氣較為突出結(jié)果一致。李媛媛等[31]利用OAV確定具有花香和果香特征的大馬士酮在‘赤霞珠’干紅葡萄酒中香氣貢獻(xiàn)最為突出，本研究則通過(guò)OVA確定具有花香和果香特征的癸酸乙酯、辛酸乙酯在‘北紅’葡萄酒中香氣貢獻(xiàn)最為突出。前人還利用主成分分析等多元統(tǒng)計(jì)方法對(duì)單產(chǎn)區(qū)葡萄酒進(jìn)行香氣成分分析并挖掘出該產(chǎn)區(qū)葡萄酒特征香氣成分及其含量[30]，而研究則是利用此方法對(duì)單品種多產(chǎn)區(qū)的‘北紅’葡萄酒進(jìn)行主成分分析，并發(fā)現(xiàn)銀川產(chǎn)區(qū)的特征香氣物質(zhì)為己酸乙酯，青銅峽和永寧產(chǎn)區(qū)的特征香氣物質(zhì)為癸酸乙酯和乙酸異戊酯。此類研究方法雖然在對(duì)香氣成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行產(chǎn)區(qū)信息的挖掘和區(qū)分方面有良好的效果，但其還存在著抽象，不直觀等問(wèn)題，而李華等[32]利用可視化分析技術(shù)將葡萄酒香氣成分建立成化學(xué)信息條形碼，即二維灰度圖，可在不同產(chǎn)區(qū)的葡萄酒的區(qū)分方面有更高精確度，很好的彌補(bǔ)了包括主成分在內(nèi)的其他分析方法存在的弊端。單一香氣成分定性與定量分析還不能完全對(duì)各產(chǎn)區(qū)單品種釀酒葡萄果實(shí)香氣和葡萄酒香氣進(jìn)行定性，在此基礎(chǔ)上還應(yīng)進(jìn)行專業(yè)感官鑒評(píng)，為判定不同產(chǎn)區(qū)單品種酒的特征果香物質(zhì)和構(gòu)建香氣指紋圖譜提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。