BRCA1表達與Ⅲ期胃腺癌患者術后特異性生存的關系*

姬玉，王建，吳昊，方樂平，黃普文

210000 南京，南京醫科大學第一附屬醫院 腫瘤科

胃癌是全球第5最常見的惡性腫瘤和癌癥死亡的第3大原因，患者多分布在東亞[1]。胃癌的發生、進展是多因素、多步驟、多階段共同作用結果，癌細胞浸潤、轉移是造成胃癌患者死亡的主要原因，但確切分子作用機制目前尚未完全闡明[2]。根據NCCN指南，目前胃癌的治療方式主要包括手術、化療、放療、分子靶向藥物治療；針對晚期或轉移性胃癌，免疫治療正處于臨床研究中。就當前醫學的發展情況來看，根治性手術是無遠處轉移胃癌患者最有效的治療方法。然而由于早期胃癌病情隱匿性強，不利于早期診斷，很多胃癌患者確診時就已處于進展期，單純進行手術治療效果不佳。現階段，對于根治術后的胃癌患者主張采取個體化綜合治療，其中輔助化療的地位日益提高[3-4]。近年來，由于胃癌的早期篩查及外科手術的規范化，診斷早期胃癌的陽性率提高，胃癌的病死率下降，但5年生存率仍不足20%[5]。分期相同的患者，其預后也不同。基于此，臨床醫學有必要深入探索胃癌預后因素，以提高疾病的治療效果。

作為一個抑癌基因，BRCA1有DNA損傷修復功能，這是通過多條信號轉導途徑從而激活DNA損傷修復的調控點來實現的。BRCA1在對危險的DNA損傷(包括DNA雙鏈斷裂)的反應中起著重要作用，這些損傷可以通過無錯誤的同源重組進行修復[6]。此外，BRCA1與許多參與染色質重構、轉錄調控和細胞周期的蛋白質相互作用，以維持基因組的完整性[7]。BRCA1的改變會導致DNA復制錯誤和突變，從而導致腫瘤生長。鉑類化療藥物通過形成DNA加合物和誘導DNA損傷發揮細胞毒性作用，是治療胃癌的常用有效藥物。如果DNA損傷沒有及時得到修復，則會導致細胞凋亡。BRCA1突變所致的蛋白功能缺失或者是BRCA1蛋白的低表達將減弱機體DNA的損傷修復功能，這時腫瘤對于鉑類藥物的敏感性可能提高，化療效果更佳[8]。因此，本研究嘗試探索胃腺癌中BRCA1蛋白表達情況與胃癌患者生存的相關性，以期為臨床工作提供指導。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2007年1月至2009年12月于南京醫科大學第一附屬醫院行胃癌D2根治術并經病理確診的Ⅲ期胃癌患者共300例，獲取其手術切除的胃癌組織石蠟包埋標本。其中男218例，女82例，年齡24～93歲。300例患者中共有223例接受了術后輔助化療，77例因患者意愿未行輔助化療。納入標準：1)患者的術后病理資料、病歷資料詳細完整；2)所有的組織學類型都是腺癌；3)采取胃切除術聯合D2淋巴結清掃術進行治療；4)術后輔助化療患者采用順鉑/奧沙利鉑聯合氟尿嘧啶類兩藥方案，且至少完成4個周期的輔助化療。排除標準：1)死亡的原因與胃癌無關；2)存在嚴重器質性疾病；3)術前行新輔助化療；4)手術前或手術后行放射治療。

1.2 隨訪及生存時間計算

隨訪方式：主要通過電話隨訪進行，必要時查詢患者住院日志等信息獲取患者隨訪資料；術后2年內定期復查(每3個月一次)，術后5年內每半年檢查一次，術后5年后每年檢查一次。隨訪內容：詢問病史以及相關輔助檢查結果，比如胸腹部CT、胃鏡、腫瘤標志物等。隨訪截止日期：2020年7月31日。本次研究中以獲得病理確診為起始事件，以患者死于癌癥或癌癥相關并發癥為結局事件，截尾數據為隨訪結束時仍然存活的患者數據。生存時間計算為確診之日至死亡或末次隨訪日。

1.3 免疫組織化學染色

采用EnVision二步法檢測BRCA1蛋白的表達情況，具體步驟為：首先將石蠟標本切成4 μm切片，并將標本放置在溫度為65℃的烤箱之中，兩個小時后取出；其次，采用常規二甲苯脫蠟，水化梯度酒精水化；第三步是阻斷內源性過氧化物酶，將標片放于室溫3%過氧化氫室，孵育10分鐘；第四步是修復高壓抗原熱，煮沸其中的修復液后放入組織玻片并使之完全浸泡于其中，觀察排氣閥是否排氣，待其排氣后等待3分鐘使之自然冷卻；第五步滴加一抗(鼠抗人Ig)，并放于溫度為4℃的冰箱中過夜；第六步用PBS緩沖液沖洗并加入二抗(羊抗鼠Ig)，讓其在室溫下孵育30分鐘；第七步是DAB顯色液顯色，控制其顯示時間，利用顯微鏡掌握其染色程度；最后使用自來水充分沖洗，復染蘇木精，梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片。嚴格按照說明書要求執行各個步驟，以同一條件下已知陽性切片染色為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定

本院病理科醫師采用單盲法閱片，基于隨機選擇5個視野，一個視野可記細胞數為200，評分依據是染色細胞占比及細胞染色程度。從染色程度上看，著深褐色、棕黃色、淡黃色、基本不著色對應的分值分別為3、2、1、0。染色細胞所占百分數：1.0表示染色細胞≥50%；0.5表示染色細胞在10%～49%；0.1表示染色細胞在1%～9%；如無細胞著色則用0表示。計算出染色細胞百分比評分、染色深度的乘積，如果得出的值≥1.0，則說明為陽性表達；反之則為陰性表達。

1.5 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。計數資料的比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法，其中生存曲線的比較采用Log-rank檢驗，最后采用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析確立胃癌的獨立預后因素。所有的檢驗均為雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 BRCA1蛋白在胃癌組織中的表達

在正常胃黏膜中BRCA1蛋白主要定位于細胞核(圖1A)，表明核表達是BRCA1的正常生理表型。但是在胃癌組織中，BRCA1蛋白幾乎都表達于細胞漿，染色強度從不著色到明顯著色(圖1B～E)。其中BRCA1表達陽性97例，陰性203例，陽性率為32.3%。

圖1 BRCA1蛋白在正常胃黏膜和胃癌組織中的表達(×200)

2.2 III期胃腺癌術后患者的生存狀況

300例III期胃腺癌術后患者隨訪截止時共有47例患者生存，253例患者死亡。BRCA1陽性患者的總生存概率高于陰性患者(18.56%vs14.29%)(表1)。

表1 III期胃腺癌患者的生存狀況

2.3 BRCA1表達與臨床病理特征的關系

不同組織學分級的患者BRCA1表達存在差異，差異有統計學意義(P<0.001)，而不同性別、年齡、腫塊大小、浸潤深度、脈管神經受侵情況、淋巴結轉移、分期的患者BRCA1表達差異均無統計學意義(P>0.05)(表2)。

2.4 BRCA1表達與胃癌患者生存的關系

2.4.1 BRCA1表達狀況對III期胃腺癌患者特異性生存的影響 300例III期胃癌BRCA1陰性203例，中位生存時間(median survival time,MST)23.50個月，5年生存率19.2%；陽性組97例，MST為27.50個月，5年生存率21.6%，差異無統計學意義(P=0.209)(圖2A)。

2.4.2 未接受含鉑輔助化療胃腺癌患者BRCA1表達對特異性生存的影響 77例患者未接受輔助化療，其中BRCA1表達陽性患者28例，MST為18.57個月，5年生存率17.9%；表達陰性患者49例，MST為17.90個月，5年生存率6.1%，差異無統計學意義(P=0.122)(圖2B)。

2.4.3 接受含鉑輔助化療胃腺癌患者BRCA1表達對特異性生存的影響 223例患者接受輔助化療，其中BRCA1表達陽性患者69例，MST為28.67個月，5年生存率23.2%；表達陰性患者154例，MST為24.30個月，5年生存率23.4%，差異無統計學意義(P=0.493)(圖2C)。

表2 BRCA1的表達與臨床病理特征的關系

2.4.4 含鉑輔助化療對總體胃腺癌患者特異性生存的影響 223例患者接受輔助化療，77例患者未接受輔助化療，化療組MST為26.17個月，5年生存率23.3%；未化療組MST為18.57個月，5年生存率10.4%，差異有統計學意義(P=0.016)(圖3A)。

2.4.5 含鉑輔助化療對BRCA1表達陰性胃腺癌患者特異性生存的影響 BRCA1表達陰性的III期患者共203例，其中154例患者行術后輔助化療，49例患者無輔助治療。化療組MST為24.30個月，5年生存率23.4%；未化療組MST為18.57個月，5年生存率6.1%，差異有統計學意義(P=0.006)(圖3B)。

2.4.6 含鉑輔助化療對BRCA1表達陽性胃腺癌患者特異性生存的影響 BRCA1表達陽性的III期患者共97例，其中69例患者行術后輔助化療，28例患者無輔助治療。化療組MST為28.67個月，5年生存率23.2%；未化療組MST為17.90個月，5年生存率17.9%，差異無統計學意義(P=0.526)(圖3C)。

2.5 Cox多因素分析

采用Cox比例風險回歸模型對300 例Ⅲ期胃癌術后病例進行多因素分析，將性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、脈管神經侵犯、淋巴結轉移、有無化療、BRCA1表達納入分析的變量。結果顯示，胃癌的獨立預后因素包括腫塊大小、淋巴結轉移和化療與否(表3)。

圖2 BRCA1表達狀況與胃腺癌患者特異性生存的關系

圖3 含鉑輔助化療對胃腺癌患者特異性生存的影響

表3 胃癌患者預后的多因素分析

3 討 論

BRCA1是第一個被發現的乳腺癌易感基因，1994年由Miki等采用定位克隆方法分離出來[9]。BRCA1定位于染色體17q12-21，包含22個編碼外顯子和2個非編碼外顯子，共24個外顯子，全長l00 kb，轉錄產物mRNA為7.8 kb，編碼含1 863個氨基酸殘基的蛋白質[10]。BRCA1蛋白分子量為220 kb，在正常的乳腺上皮細胞和卵巢生發上皮的細胞核中表達。當前已經明確細胞DNA損傷可通過如下4種機制進行修復：其一是核苷酸切除修復(nucleotide excision repair,NER)；其二是雙鏈斷裂修復(double-strand break repair,DSBR)；其三是同源重組修復(homologous recombination repair,HRR)；其四是錯配修復(mismatch repair,MMR)。BRCA1在DSBR中起重要作用：1)可通過與DNA損傷修復功能必需的結構單元RAP80受體相關蛋白80(RAP80)作用，將BRCA1定位到DNA斷裂部位，參與DNA損傷的修復，且能特異性作用于細胞周期G2/M檢控點[11]；2)能通過泛素連接酶在DNA損傷修復中發揮作用；3)當DNA受損時，可與受傷部位發生磷酸化組蛋白作用，通過HRR途徑與非同源末端連接途徑，協調DNA的修復，且可切斷損傷部位的DNA雙鏈，產生單鏈DNA，并調節單鏈DNA長度和持續時間；4)具有DNA依賴性ATP酶和DNA解旋酶活性，是雙鏈DNA損傷修復所必需的；5)是DNA重組和雙鏈DNA損傷修復的關鍵蛋白。此外BRCA1還具有調控轉錄功能，并可以調節細胞凋亡[7,12]。

BRCA1為抑癌基因，當其表達缺失或發生基因突變時，可降低BRCA1蛋白合成量，對癌細胞抑制作用減弱，增加罹患癌癥風險。腫瘤患者若BRCA1蛋白低表達，則其DNA損傷的修復能力減弱，基因不穩定性增加，可能導致腫瘤的生長速度加快等惡性生物學表現，進而預后不良。

基于這些理論，學者們認為BRCA1蛋白的表達與腫瘤的發生、發展及預后相關。awniczak等[13]報道顯示，BRCA1突變與胃癌患病和復發有關。1998年Jarvis指出，BRCA1低表達可以導致乳腺癌細胞侵襲性增加[14]。2003年Grabsch等[15]研究了100例非家族性乳腺癌患者，發現BRCA1低表達與腫瘤低分化相關(P= 0.002)，究其原因，可能在于BRCA1蛋白表達越低，對于DNA修復作用越弱，從而導致惡性分化累計，產生細胞分化程度下降。我們的研究結果與Grabsch一致，BRCA1表達與組織學分級相關，差異有統計學意義(P<0.001)，BRCA1蛋白表達越低，細胞分化程度越差。

在消化系統腫瘤中，多項研究均證實BRCA1蛋白高表達患者預后優于低表達者[16-19]。本實驗結果顯示，BRCA1蛋白陽性表達患者與陰性表達患者雖然在總生存上無明顯差異(P=0.209)，但是可以看到BRCA1蛋白陽性表達患者生存較陰性表達者有延長趨勢，在MST上有4個月的延長(27.50個月vs23.50個月)。而在單純手術的患者中，陽性組和陰性組MST分別為18.57個月和17.90個月，5年生存率分別為17.90%和6.10%，雖然差異無統計學意義(P=0.122)，但是可以看出BRCA1陽性組5年生存率有高于陰性組的趨勢。而本研究Cox多因素分析顯示BRCA1表達并非胃癌的獨立預后因素。我們的結果與既往研究的結果不盡一致，可能由于我們選擇的樣本量相對較少，不足以反映胃癌整體的情況，因此還需要進行嚴謹的大樣本的前瞻性臨床研究，來評價BRCA1對胃癌患者預后判斷的實際意義。盡管如此，我們認為BRCA1蛋白的表達狀況對與胃癌預后仍有一定的參考價值。

BRCA1蛋白作為DNA修復蛋白，從理論上可以作為鉑類藥物耐藥的預測指標。Huang等[20]發現，在非小細胞肺癌中，與BRCA1表達陽性的患者相比，BRCA1陰性表達的患者從輔助順鉑化療中獲益更多。Huang等的結論也被其他學者的研究加以證實[21]。Macklin-Mantia等[22]在胰腺癌中得出類似結論。而在卵巢癌和乳腺癌中，多個研究也均證實BRCA1蛋白可以預測鉑類藥物療效[8,23-24]。

我們研究結果顯示，在所有接受術后輔助化療的患者中，BRCA1蛋白的表達情況與總生存無關(P=0.493)。在BRCA1陰性表達患者中，化療組MST為24.30個月，5年生存率23.40%，而未化療組MST為18.57個月，5年生存率6.10%，差異有統計學意義(P=0.006)，提示BRCA1陰性表達的Ⅲ期胃癌患者行含鉑方案的術后輔助化療可以帶來生存獲益，這一結果與其他學者的研究一致[16-17,25]。BRCA1陽性表達患者中，雖然化療組生存略優于未化療組，但差異無統計學意義(P=0.526)，提示BRCA1陽性表達者可能并不能從含鉑方案的術后輔助化療中取得生存獲益。因此，作者認為BRCA1蛋白可以作為III期胃癌患者術后輔助化療療效的預測指標。

綜上所述，BRCA1的表達對患者預后的評估及預測鉑類藥物療效上有一定的臨床意義。BRCA1陽性表達的患者預后較好，但同時對鉑類藥物相對耐藥，未能從鉑類藥物化療中顯著獲益；而BRCA1陰性表達的患者預后較差，但同時對鉑類藥物相對敏感，可以從鉑類藥物化療中顯著獲益。探尋評估預后的個體化分子標志物尚有待進一步的研究，以期指導臨床，從而真正達到治療個體化，使患者得到最大受益。

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