花生紅衣中原花青素的提取工藝與活性研究

呂 筱，鄭天元，韋新月，竇子珊，代紫，高晨佳，蔡 冉，孟琬星，王汝華，3

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.通標標準技術服務（天津）有限公司，天津 300457；3.天津科技大學食品科學國家級實驗教學示范中心，天津 300457）

0 引言

花生（Arachis hypogaeaL.）屬豆科（Leguminosae sp.）落花生屬植物，又稱長果、泥豆等，是使用廣泛的一種堅果，在我國山東省和河南省生長最佳[1]。花生紅衣是花生的種皮，因絕大多數花生品種的種皮為紅色而得名。原花青素是其主要活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌抗炎和免疫調節等多種活性功能[2-3]。原花青素廣泛存在于植物的果皮、種子、花和葉片中，是一大類天然多酚化合物的總稱[4]。由于其無毒且安全性較好，具有很強的抗氧化活性，可以有效清除人體內的自由基，從而可以起到抗衰老、保護心腦血管等效果，因此可應用于功能性食品等多種領域。原花青素具有多個酚羥基，可以在人體內釋放H+，與自由基競爭性地結合，終止自由基鏈式反應，從而避免脂質氧化分解。Ariga T[5]的研究表明，原花色素的抗氧化活性在水性體系中比維C或維E強得多，且純度越高抗氧化能力越強。超聲波法提取廣泛應用于天然產物及生物活性物質提取等領域[6-9]，是最常見的原花青素提取方式[10-12]。試驗的目的是立足于有機溶劑浸提法，對花生紅衣的提取工藝進行優化，并且探究原花青素的抗氧化功能，旨在降低成本、提高得率，為花生紅衣的綜合利用和深加工提供了新途徑，實現資源高效率利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生紅衣，乳山市金果花生制品有限公司提供，原料產地山東煙臺。

石油醚、無水乙醇、甲醇、鹽酸、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等，天津市化學試劑一廠提供；香蘭素、水楊酸、維C、沒食子酸、原花青素標準品、Tris-HCl等，北京索萊寶科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

UV-3200型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產品；5418 R型微型冷凍離心機，艾本德中國有限公司產品；FC型全波長酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司產品；IKA RV8型旋轉蒸發儀，艾卡儀器設備有限公司產品；FE20型酸度計、ML104型電子天平，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司產品；BILON6-180B型超聲波清洗器，上海比郎儀器制造有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生紅衣原花青素的提取

取花生紅衣，使用搖擺式粉碎機將花生紅衣粉碎，并將花生紅衣粉用80目標準分樣篩過篩，取篩分后花生紅衣粉，稱質量，按料液比1∶15（g∶mL）加入石油醚，于30℃振蕩恒溫水槽中脫脂5 h，抽濾，脫脂后的花生紅衣置于通風櫥中自然風干，稱重后于4℃冰箱中冷藏密封保存備用。

1.3.2 花生紅衣原花青素含量測定

采用香草醛-鹽酸法測定原花青素含量[13]。以葡萄籽原花青素標準溶液（0.1～0.5 mg/mL）為標品繪制標準曲線（Y=6.774X+0.028 2，R2=0.998 5），測量樣品于波長500 nm處吸光度。花生紅衣樣品中的原花青素含量表示為毫克葡萄籽原花青素當量每克干原料（mg PC/g DM）。

1.3.3 花生紅衣原花青素提取的工藝優化正交試驗

根據單因素試驗（圖1）的結果，選取提取時間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）、乙醇體積分數（D）4個因素在3個水平上設計正交試驗。其他條件為超聲功率100 W，提取次數3次，測定各組試驗中粗提物的原花青素含量，計算得率后分析結果，得到最優提取工藝。

1.3.4 花生紅衣粗提物的純化

在最佳提取工藝條件下獲得的原花青素粗提物進行旋蒸除凈乙醇。稱取5 g新的AB-8型大孔吸附樹脂進行干燥處理，并浸泡在95%的乙醇溶液中2～4 h。蒸餾水洗去乙醇后濕法裝柱（1 cm×10 cm層析柱），再用2倍體積蒸餾水洗柱床。取20 mL粗提物上樣，靜置一段時間等待吸附飽和，再用2倍體積蒸餾水洗柱床，然后使用60%乙醇洗脫。收集流出液，觀察顏色規律。洗脫液旋轉除凈乙醇，凍干，得到原花青素純化干物質。測定所得純化干物質質量，取0.01 mg樣品，溶于1 mL甲醇后，按香草醛-鹽酸法測定原花青素含量，得到樣品純度。

1.3.5 體外抗氧化活性的測定

參照浦娜娜[14]的方法測定花生紅衣樣品的總還原力。對DPPH自由基的清除試驗參考Kamiloglu S等人[15]的方法并稍作修改。超氧陰離子自由基清除能力的測定參考Mathew S等人[16]的方法并稍作修改。清除羥自由基的測定參考Goncalves S等人[17]的方法并稍作修改。

1.3.6 數據處理

每個試驗均重復3次，試驗數據以平均值±標準偏差表示。使用Microsoft excel 2010和Origin 9.0對結果進行處理，并對數據進行單向方差分析（ANOVA），并用SPSS 17.0通過Duncan的多范圍測試計算樣本平均值之間差異的顯著性，p＜0.05表示差異。

2 結果與分析

2.1 原花青素提取單因素試驗

不同因素對花生紅衣原花青素提取率的影響見圖1。

圖1 不同因素對花生紅衣原花青素提取率的影響

由圖1（a）可知，原花青素得率隨著時間變化呈現先增大后降低的趨勢，并在超聲提取時間20 min時，達到最大值6.63%±0.77%。這是由于超聲時間越長，原花青素的溶解量就越多，提取率也會隨之升高，而提取時間過長，會導致導致花生紅衣的纖維素網絡結構松散，將原花青素限制在內部，導致得率下降[18]。由圖1（b）可知，原花青素得率隨著溫度升高呈現先增大后降低的趨勢，并在提取溫度30℃時，達到最大值6.05%±0.34%。隨著溫度增高導致細胞脫水，細胞結構發生變化，分子運動的速度加快，從而導致溶出的速度變快，原花青素得率升高[19]。然而，隨著溫度的進一步增高，會加速原花青素氧化的進程，同時雜質也會增加，影響后續的純化過程，并且高溫會加速提取溶劑的揮發，影響提取效果同時造成浪費。由圖1（c）可知，原花青素得率呈現出先增大后降低的趨勢，并且在料液比1∶16（g∶mL）時，達到最大值6.97%±0.76%。這是由于溶劑的用量增大，提取率也會隨之有較明顯的升高，原花青素的率達到最大之后降低，出現這種現象可能的原因是在一定量的提取劑中，原花青素已經基本溶出，如果仍繼續加大提取劑的用量，不僅會造成提取劑的浪費并增加成本，還反而會因為提取劑使用過量，使超聲波的能量傳遞及空化效應減弱，從而使原花青素得率降低[20-21]。在使用低體積分數乙醇作為提取劑時，出現了難以抽濾的情況，可能的原因是體積分數低于50%的乙醇溶液可提取出某些分子量較大的物質，造成抽濾困難，因此提取劑濃度不能過低。由圖1（d）可知，原花青素得率呈現出先增大后降低的趨勢，并且在體積分數為70%時，達到最大值5.29%±1.45%。這可能是因為水的極性較大，乙醇的極性較小，乙醇溶液的極性會隨著體積分數的增大而逐漸下降，因此在極性降低至一定程度后，原花青素在其中的溶解量會減少。

2.2 正交試驗

通過單因素試驗的結果，選定提取時間、提取溫度、料液比和乙醇體積分數4個因素的最優條件設計正交試驗，其他試驗條件為，超聲功率100 W，提取3次，每組試驗均進行3次。

正交試驗因素與水平設計見表1，正交試驗L9（34）設計及結果見表2。

表1 正交試驗因素與水平設計

表2 正交試驗L9（34）設計及結果

由表2可知，花生紅衣中原花青素最優提取條件為提取時間17.5 min，提取溫度為30℃，料液比1∶16（g∶mL），提取劑為70%的乙醇溶液，超聲功率100 W的條件下，提取3次。由極差分析可以看出各因素對花生紅衣中原花青素提取影響的主次順序為料液比（C）＞提取溫度（B）＞提取時間（A）＞乙醇體積分數（D）。料液比對提取得率影響較大。選取最優提取條件提取原花青素，重復3次，得率為7.82%±0.02%。

2.3 花生紅衣原花青素粗提物的純化

對粗提物干物質使用香草醛-鹽酸法進行純度測定，所得純度為34.28%±0.12%。使用AB-8型大孔吸附樹脂分離純化，測定洗脫曲線（見圖2（a））。純化后原花青素純度為76.85%±0.24%，純度較比未純化前提升42.57%，純度比較結果（見圖2（b））。

原花青素粗提物的分離純化見圖2。

圖2 原花青素粗提物的分離純化

2.4 原花青素的抗氧化活性研究

原花青素的抗氧化活性見圖3。

圖3 原花青素的抗氧化活性

分別測定質量濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL的粗提物、純化物樣品的總還原力、超氧陰離子自由基的清除率、羥基自由基的清除率。測定質量濃度為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL的粗提物、純化物樣品的對DPPH自由基的清除率。均以0.2 mg/mL維C溶液為對照。由圖3（a）可知，在質量濃度0.1～0.5 mg/mL范圍內，未純化與純化后的原花青素溶液的總還原力隨質量濃度的增大而增強，在0.5 mg/mL質量濃度下達到最大，最大值為分別0.718±0.021和0.685±0.014。相同作用質量濃度下未純化原花青素清除率與純化原花青素總還原力無顯著性差異，總還原力隨原花青素質量濃度的升高而升高。相同質量濃度下花生紅衣中原花青素的總還原力略低于維C，當原花青素質量濃度達到0.5 mg/mL時，與0.2 mg/mL的陽性對照維C總還原力能力相當。由圖3（b）可知，在0.1～0.5 mg/mL質量濃度范圍內，未純化與純化后的原花青素溶液對超氧陰離子自由基的清除率隨質量濃度的增大而增大，在0.5 mg/mL質量濃度下達到最大，最大值分別為31.94%±5.1%和33.04%±5.2%。其中，未純化原花青素清除率略低于純化原花青素清除率。在同樣的質量濃度下，花生紅衣中原花青素對超氧陰離子自由基的清除效果低于維C。由圖3（c）可知，在質量濃度0.1～0.5 mg/mL范圍內，未純化與純化后的原花青素溶液對羥基自由基的清除率隨質量濃度的增大而增大，在質量濃度0.5 mg/mL時達到最大，最大值分別為33.80%±6.22%和39.97%±3.72%。其中，未純化原花青素清除率略低于純化原花青素清除率。在同樣的質量濃度下，花生紅衣中原花青素對羥基自由基的清除效果低于維C。由圖3（d）可知，在質量濃度0.01～0.02 mg/mL范圍內，未純化與純化后的原花青素溶液對DPPH自由基的清除率隨質量濃度的增大而增大，在質量濃度0.03～0.05 mg/mL范圍內，對DPPH自由基的清除率幾乎趨于恒定，在0.05 mg/mL質量濃度時達到最大，最大值分別為91.58%±0.14%和92.08%±0.01%。在同樣的質量濃度下，未純化原花青素清除率與純化原花青素清除率無顯著性差異。花生紅衣中原花青素對DPPH自由基的清除效果遠高于維C。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗論證，可知料液比對花生紅衣中原花青素的提取影響較大，因此在工業生產中可嚴格控制提取過程中的料液比，適當改變其他條件來降低成本、提高得率，實現工業生產利益最大化。經過分析得出花生紅衣中提取原花青素的最優提取工藝：超聲功率100 W，提取溫度30℃，提取時間17.5 min，按料液比1∶16（g∶mL）加入70%乙醇溶液作為提取劑，提取3次，合并濾液。在最優工藝條件下，花生紅衣中提取原花青素的得率為7.82%±0.02%。將原花青素粗提物純化后，純度可達到76.85%±0.24%，較未純化提升42.57%，同時抗氧化活性也有一定的提升，在工業上具有純化價值。因此，花生紅衣作為生產廢料的再利用價值較高，花生紅衣原花青素可作為一種天然抗氧化劑，廣泛應用于食品、化妝品、保健品和醫藥領域。