醬油中風味物質形成的研究進展

陳 杰，趙 瑩，何一龍，劉曉艷，白衛東，錢 敏，趙文紅

（1.廣東粵師傅調味食品有限公司，廣東開平 529341；2.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225；3.現代農業工程創新研究院，廣東廣州 510225）

醬油俗稱豉油，主要以大豆、餅粕等為原材料，輔以小麥、面粉或麥麩等，經微生物發酵得到的液態調味品，距今已有3 000多年的歷史[1-3]。低鹽固態型、淋澆型、高鹽稀態型和傳統發酵型是釀造醬油中常見的四類，低鹽固態型發酵時間短、醬香濃、色澤深且價格低，淋澆型色澤光亮，高鹽稀態型香氣種類較多且風味較好，而傳統發酵型具有獨特且不可復制的風味[4]。傳統發酵型醬油的發酵周期長，生產效率不高，且發酵過程中自然污染難以控制，這對產品的質量和安全構成了較大的威脅。因此，在工業化生產的前提下，釀造醬油的傳統式發酵逐漸被高鹽稀態式發酵所取代，但高鹽稀態式發酵罐的罐體較為封閉，得到的醬油風味不足，原因在于傳統發酵方式的發酵制劑很難被復制[5]。以醬油的揮發性風味物質、滋味物質及微生物對風味物質的影響為中心，近年來國內外學者對醬油中揮發性風味物質、滋味物質及微生物的種類、數量和檢測手段的報道進行歸納，總結了醬油風味形成的機理及其與微生物的關系研究，力求為后續醬油風味的研究提供理論依據。

1 醬油的揮發性風味物質

1.1 揮發性風味物質

揮發性風味物質在醬油中以醇、酸、酚、酯、醛、酮、含硫含氮和呋喃類為主。這些物質共同給予醬油特征性。

醬油中的醇類來自原料成分的降解或產生于發酵過程，主要為苯乙醇和乙醇。苯乙醇帶有玫瑰樣香氣，乙醇自身的香氣強度較弱，一般作為香氣物質的合成底物，間接對醬油的香氣提供作用。在生抽與老抽的對比中，生抽的乙醇含量較高[6]。在日式醬油中，高級醇類物質的含量較高，而廣式醬油中高級醇種類更加豐富，并且含有較多的脂肪醇[7]。醇類物質往往使人產生愉悅感并且間接地影響著醬油的風味，如帶有玫瑰樣香氣的苯乙醇和在醬油中扮演香味物質合成底物角色的乙醇[8]。乳酸菌的發酵作用是醬油中酸類物質的主要來源，酸類物質呈味的同時可與醇反應形成酯，形成醬油中特有的酯香。具有煙熏風味的酚類物質，能夠為醬油提供烘烤香氣，烘托點綴醬香，其中主要包括麥芽酚（Maltol）、愈創木酚（Guaiacol）、4-乙烯基愈創木酚（4-Vinylguaiacol）、4-乙基愈創木酚（2-Methoxy-4-ethylphenol）等成分，由原料中的木質素、糖類等為前體經霉菌、酵母菌的發酵生成[9]。酯類物質因其自身的甜香和果香味成為了醬油獨特的主體風味，并且能夠調和咸味。

醬油的釀造過程體系復雜，由氨基酸代謝和油脂氧化代謝能夠同時產生醛類物質和酮類物質，前者本身不呈味，但能夠與其他物質作用并生成特殊香氣成分[7]，后者具有的花香和果香味能夠賦予醬油醇厚的醬香風味[10]。含硫氨基酸和硫胺素代謝產生的含硫類化合物低含量時就能夠顯現其獨特的呈味特性。趙國忠等人[11]對比滬釀3.042與100-8這2種米曲霉發酵的醬油，其中米曲霉100-8變化最明顯的是吡嗪類物質的增多。該類化合物主要是由美拉德反應生成的含氮化合物，其香氣特征可隨濃度含量變化，低濃度時，具有豌豆、堅果、水果、胡椒、花生等香味[12]，能夠賦予醬油獨特的焙烤和堅果風味[13]。呋喃（酮）類是醬油中香氣貢獻較大的一類，可由魯式接合酵母產生。高獻禮等人[14]使用3種萃取方法分離鑒定醬油的揮發性風味物質，發現大部分呋喃和呋喃酮均在直接溶劑萃取法中被檢出。特別是其中的4-羥基-2（5）-乙基-5（2）-甲基-3（2H）-呋喃酮（HEMF）具有減弱咸味、增強甜味的效果，給醬油帶來焦糖香氣[15]。

1.2 揮發性風味物質的檢測方法

已發現的醬油香氣成分超過1 000種，其種類繁多，較為復雜。挑選適當的前處理方式，對揭示醬油風味組成的真實性和準確性至關重要，并且揮發性風味物質在較為單獨的前處理條件下難以得到充分的萃取，通常都是結合不同的萃取方法，對醬油的香氣成分進行前處理。

風味物質提取方法的優缺點見表1[16-21]。

揮發性風味物質的檢測第一步是對樣品進行提取處理，第二步是對提取物中的成分進行分析（定性、定量），目前常用的香氣物質檢測技術有氣相色譜法（GC）、液相色譜法（HPLC）、氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）、氣相色譜嗅聞技術和電子鼻檢測技術（GC-O）、全二維氣相色譜與飛行時間質譜聯用（GC×GC-TOF MS）等。其中，GC-MS法具有靈敏度高、分離效果好、鑒定能力強等特點，被廣泛運用于醬油風味物質的研究中。

表1 風味物質提取方法的優缺點

2 醬油的滋味物質

2.1 滋味物質

咸、甜、酸、鮮、苦五味共同組成了醬油獨有的滋味[22]。其中，氨基酸和有機酸是醬油中重要的滋味物質。

根據呈味特點的不同，醬油中的氨基酸被分為3類，即苦、甜與鮮味。近年來，對其的研究主要運用于醬油品質的評價、呈味特性的研究和種類的區分[23-25]。有學者運用全自動茚三酮顯色法對不同種類醬油中的8種游離氨基酸進行了檢測，發現醬油的風味是由各種游離氨基酸分子共同影響的結果，并不是由谷氨酸單純提供[26]。還有學者對比了中式與日式醬油非揮發性風味物質的區別，發現中式醬油中的鮮味氨基酸含量顯著高于日式醬油，然而日式醬油中的甜味和苦味氨基酸均高于中式醬油[27]。

乳酸、乙酸、丁二酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、焦谷氨酸與草酸等20多種有機酸是醬油中酸味的主要來源[28]。醬油的品質受有機酸種類與含量的影響，適量的有機酸可以對風味有重要的影響，其本身具有的酸味和特殊口感，可以獨自形成香氣，與醇類物質酯化成酯可以增強酯香，但酸含量過高或分布不平衡會使醬油的口感粗糙且刺激不協調。張露等人[29]測定了3款醬油中的10種有機酸，結果顯示乳酸和乙酸之和占總有機酸質量分數的35%以上，因此認為醬油中主要的有機酸為乳酸和乙酸，并且特級醬油中有機酸種類和總含量均高于三級醬油。張怡潔[22]測定了12種不同地區醬油中的有機酸，發現乳酸和乙酸是醬油中的主要有機酸、琥珀酸和蘋果酸在醬油中少量存在，并且發現醬油中幾乎不含丙酸。

2.2 滋味物質的檢測方法

2.2.1 氨基酸的檢測方法

大部分氨基酸沒有熒光基團或紫外吸收的小分子物質，因此其檢測方法相對較復雜，直接檢測法、柱前衍生法與柱后衍生法是氨基酸檢測中常用到的3種方法。

氨基酸的直接檢測方法中高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法（HPAEC-IPAD）和高效液相色譜-蒸發光散射檢測法（HPLC-ELSD）較為常見[30]。HPAEC-IPAD法的原理是，在一定pH值條件下，氨基酸分子中的氨基和部分羥基發生氧化反應引起微弱電流變化而被檢測[31]。ELSD是一種常用的檢測器，具有高通用性、使用簡單的特點，結合HPLC使用往往不用考慮樣品的光學性質和物質本身的結構，即使被測物質無紫外吸收或熒光基團也無太大影響，但缺點是其靈敏性不高，不適用于進行定量分析[32]。直接檢測法具有操作簡便、無需衍生等優點，但也存在一些局限性，且所使用的儀器設備一般實驗室不配備，不是常用的氨基酸檢測方法。

柱前衍生法在運用HPLC法和GC法檢測醬油中的氨基酸時往往被用到，一般結合UV或FLD使用。這2種方法都具有檢出限低、靈敏度高的特點。但由于需要進行柱前衍生，各種衍生化試劑的差異性會導致其在對氨基酸的檢測中具有一定局限性。有學者提出了RP-HPLC法、C-GC法（毛細管氣相色譜法）等經過優化后的氨基酸檢測方法，同時結合相適宜的衍生試劑，以減少柱前衍生法的局限性[33]。柱后衍生法是指先將氨基酸進行色譜柱分離，再對其進行衍生處理最后檢測。相比較于柱前衍生，柱后衍生法的可重復性更高，除特定分離柱之外，還需要泵和反應器使洗脫液和衍生試劑混合均勻。氨基酸自動分析儀就是根據該方法原理研發得來的。氨基酸的自動分析儀所需樣品衍生化時間短、衍生條件對檢測結果精確度影響較小，而且還具有樣本的耐受性較高、所需的樣品量較少的特點。由于衍生化試劑并沒有直接注入到色譜柱內部。因此，該法中色譜柱的使用壽命能夠得到有效的延長[34]。

2.2.2 有機酸的檢測方法

醬油中有機酸的檢測方法相對氨基酸的較單一，主要有GC法、HPLC法和IC（離子色譜）法。其中，醬油中有機酸的檢測HPLC法的使用頻率較高。

有機酸屬于極性小分子弱酸，易溶于水，在水系流動相中以離子形式存在而不能在非極性的鍵合相色譜柱固定相上保留。有機酸的離解常數不是很大（pKa＞2），在pH值2～3時，有機酸的解離反應向逆反應方向進行，解離受到抑制[35]。

3 醬油的相關微生物

3.1 微生物的種類

醬油是利用微生物豐富的酶系作用于原料得到的發酵產品。發酵過程中的微生物除了自身可代謝生成不同的代謝產物，還可通過自溶作用釋放出許多營養物質，這些物質經過復雜的生物化學反應過程，最終影響醬油風味的形成。米曲霉是醬油釀造中使用最廣泛的一種微生物，能夠分泌許多種酶類分解醬油原料[36]。其中，蛋白水解酶可作用于肽鍵，將蛋白質水解為小分子肽鏈和氨基酸；糖化酶可將糊化后的淀粉類原料轉換成麥芽糖或葡萄糖。另外，菌體自溶后，谷氨酰胺酶可催化降解谷氨酰胺，將其水解成谷氨酸。黑曲霉多與米曲霉混合制曲發酵醬油，黑曲霉所含的植物組織溶解酶（纖維素酶、果膠酶）能破壞植物細胞壁，使胞內蛋白質和淀粉暴露出來，然后與米曲霉的蛋白酶共同作用，使暴露出來的胞內蛋白和淀粉得到充分降解[37]。

魯氏酵母耐滲透壓能力強，可在高鹽高糖環境下生長，是一種主發酵酵母，在發酵前期加入，可產生乙醇、高級醇及芳香雜醇類物質，還能轉化糖類物質生成多元醇（如甘油）及糖醇類風味物質[38-39]。此外，也產生呋喃酮類物質、琥珀酸等有機酸[40]。在發酵中后期，醬醪糖濃度與pH值均降低，魯式酵母開始自溶，此時球擬酵母代謝活躍，參與醬醪成熟及風味物質的生成，將前期生成的醇類物質和有機酸等合成酯類物質，提升了醬油的呈香水平[41]。在醬油釀造環境中，球擬酵母可直接從釀造原料獲得營養源，不需要特別添加營養源[42]。球擬酵母可代謝產生酚類化合物（如4-乙基愈創木酚、乙基酚等），同一時期，球擬酵母生成的酸性蛋白酶也可對短肽進一步水解，給醬油提香增鮮[43]。在發酵中后期，同樣活躍的假絲酵母（Candida versatilis），可將炒小麥在微生物作用下生成的阿魏酸和香豆酸轉換成4-乙基愈創木酚和4-乙基酚[37]。乳酸菌是一類能代謝各種糖類物質產生乳酸的細菌總稱[42]，其中主要起作用的是嗜鹽片球菌屬（Pediococcus halophilus)、四鏈球菌（Tetracoccus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）等，乳酸菌可與耐鹽酵母在厭氧條件下發酵，消耗剩余的糖和氨基酸，增添醬油的風味。醬油發酵初期產生的乳酸會對酵母菌產生拮抗作用。后期成熟階段，醬醪中乳酸的積累會導致pH值降低，這使得乳酸菌的生長受到抑制，但在酸性環境下酵母菌卻能夠生長繁殖并且進行酒精發酵，給醬油增添了柔和的酸味和香氣[44]。

3.2 微生物與風味物質的關系

制曲微生物能夠代謝產生豐富酶系，同時也為香氣成分的產生提供前體物質，對醬油風味的產生具有顯著影響[45]。許多研究表明，混菌制曲發酵的醬油風味更佳。近年來，較多學者的研究方向偏向于研究菌株特性、菌種間的相互作用及通過微生物有目的性地提高某類香氣物質等。

Zhong Y等人[46]研究2株米曲霉的基因組和轉錄體，發現一株發酵性能下降的米曲霉能有效地利用葡萄糖，燃燒多余的氨基酸，為菌絲體生長提供糖酵解和TCA循環的燃料，從而成為生存競爭中的優勢菌株；另一株工業菌株則為了提高水解酶的產量而犧牲菌絲體的生長，促進風味前體物質形成的代謝途徑，使其成為有利于曲發酵的菌株。

趙謀明等人[47]對5株高鹽稀態醬油中具有代表性菌株進行理化性質分析，并探究其與酵母相互作用對菌株繁殖及風味形成的影響。研究發現，克氏庫克菌的單菌與混菌培養體系都具有較好的風味特性，提升了乙酸、乙酸乙酯、苯乙醛、3-甲硫基丙醛和3-甲硫基-1-丙醇等香氣物質。趙國忠等人[11]對比普通釀造醬油與添加植物乳桿菌釀造醬油的無鹽固形物含量區別，發現添加植物乳桿菌的醬油有助于淀粉質原料向氨基酸、多肽類物質的轉化而對糖類沒有太大影響。Harada R等人[48]運用乙醇替代酵母、乳酸和乙酸替代乳酸菌的影響，研究了微生物及其產物對醬油香氣影響發現，添加乙醇與添加酵母菌發酵的醬油風味差異明顯，說明醬油香氣成分并非乙醇轉化，而是通過酵母代謝產生，在乳酸和乙酸替代乳酸菌的試驗中，風味沒有出現顯著的變化，說明乳酸菌所產生的作用主要來自乳酸和乙酸。

張麗杰等人[49]篩選出可合成多種吡嗪化合物的枯草芽孢桿菌Nr.5，并基于此菌株研究提升醬油中吡嗪化合物種類及質量濃度的方法，對比發現只添加枯草芽孢桿菌Nr.5的醬油樣品中只有2,5-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的濃度有增加。而同時添加枯草芽孢桿菌Nr.5與發酵底物L-蘇氨酸及D-葡萄糖的樣品中，有7種吡嗪的濃度得到提升且總濃度提高了12.5倍。

4 結語

醬油風味主要分為揮發性與非揮發性（滋味）2種，揮發性風味物質往往能給消費者帶來直觀的第一感覺，滋味物質則是判斷醬油風味好壞的最后關鍵因素，同時其也間接影響著揮發性風味物質的存在。醬油風味的影響因素主要有原料、生產工藝及微生物的菌種和數量，其中微生物菌種和數量最為關鍵。迄今為止，醬油發酵過程中能夠產生作用的微生物對應的某種或某幾種風味物質（揮發性和非揮發性）尚不完全明確，單獨使用前體物如乳酸、乙酸和乙醇進行發酵對比添加產生乳酸、乙酸或乙醇的微生物發酵，將有助于進一步分析微生物參與每種揮發性風味物質的產生。因此，在今后醬油風味的研究中，不但要著重對微生物的特性進行研究，在風味提取的技術上也需多做對比，如在揮發性風味物質的提取上，幾種方法各具優缺點，可適當結合一兩種提取方法對醬油的風味進行檢測。