抗炎合劑減輕膿毒癥致急性肺損傷大鼠肺組織程序性壞死的實驗研究?

汪海慧 閆國良 樓丹飛 鄭天虹

（上海中醫藥大學附屬上海市中醫醫院，上海 200071）

膿毒癥是急危重癥醫學尚待攻克的重要臨床難題之一。急性肺損傷（ALI）作為膿毒癥最嚴重的并發癥之一，其治療亦是攻克膿毒癥的難點［1-2］。細胞程序性壞死又稱壞死性凋亡，是近年來發現的一種新的細胞程序性死亡方式。研究表明，壞死性凋亡可直接或間接加重炎癥反應，其信號的改變與膿毒癥的發生發展密切相關［3-5］，抑制壞死性凋亡可有效減輕ALI并提高患者存活率［6-7］，且壞死性凋亡調節蛋白的表達可作為膿毒癥患者早期預后的生物標志物［8］。近年來國內學者已逐步開展程序性壞死對膿毒癥炎癥反應的研究，中醫藥在調控程序性壞死方面有著廣泛的應用前景。本課題組自擬中藥復方抗炎合劑，已通過大量基礎研究及臨床試驗證實可有效減輕膿毒癥患者的炎癥反應，改善臨床癥狀［9-13］。綜上，本研究擬通過制備膿毒癥致ALI大鼠模型，探討膿毒癥致ALI發病過程中炎癥因子及組織細胞程序性壞死的變化，以及中藥抗炎合劑對其的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠，40只，清潔級，體質量200～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：20170005021765，飼養于上海市中醫醫院實驗中心清潔級動物房，飼養許可證號SYXK（滬）2014-0019，所有大鼠適應性飼養1周，自由進食飲水。

1.2 試藥與儀器 抗炎合劑，組方：大黃15 g，黃芩12 g，厚樸12 g，敗醬草 30 g，黃連15 g，由上海市中醫醫院中藥房提供，所有中藥飲片均符合2010年版《中國藥典》規定要求，并由制劑中心進行炮制加工，制備成含生藥1.0 g/mL的棕色透明液體，置于4℃冰箱保存備用。Necrostatin-1購自麥克林公司，批號C109457712。Tunel試劑盒購自江蘇凱基生物技術有限公司，批號2020001。ELISA試劑盒購自上海富勒科技有限公司，批號201911。PCNA試劑盒購自abcam公司，批號2019010。離心機：ThermoFRESCO17，石蠟切片機：Leica RM2235，水浴鍋：Lecia HI1210，水平干式烘干儀：Leica HI1220，顯微鏡：OLYMPUS BX51。

1.3 分組與造模 用隨機數字表法將大鼠分為4組：假手術組、模型組、中藥組、壞死性凋亡抑制劑組（Nec-1組），每組10只。禁食不禁水12 h，采用盲腸結扎穿孔術（CLP）制備膿毒癥致 ALI大鼠模型［14］：以10%水合氯醛麻醉大鼠后，中下腹正中做一約1.0 cm長的切口，找到盲腸，在其根部2/3處進行結扎，用5 mL注射器針頭穿通2～3次，避免損傷腸壁血管，輕擠出少量腸內容物，回納盲腸于腹腔，逐層縫合腹壁切口，術畢皮下注射0.9%NaCl抗休克。假手術組：大鼠經麻醉后開腹，輕輕翻動腸道后關腹。

1.4 干預方法 造模前3 d及造模后中藥組予抗炎合劑灌胃（14 g/kg），Nec-1組予Necrostain-1腹腔注射（0.6 mg/kg），每日1次。正常組及模型組同時灌服及注射等量生理鹽水。

1.5 標本采集與檢測 各組大鼠術后24 h麻醉并腹主動脈采血后行標本采集及檢測。1）血液白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）指標的檢測：血液標本3 000 r/min4℃離心10 min，然后吸取血清。按照ELISA試劑盒（購自上海富勒生物科技有限公司）說明書的方法進行動脈血IL-1β、IL-6、TNF-α指標的檢測。2）肺組織HE染色：沿大鼠左右肋軟骨迅速打開胸腔，取出左右肺，用生理鹽水沖洗表面，冰上切取肺組織，用4%多聚甲醛中固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋、切片，片厚分別為3 μm、5 μm。3 μm厚的石蠟組織片用于HE染色，觀察肺組織的病理變化。3）末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法（TUNEL）檢測凋亡細胞：取5 μm厚的石蠟組織片用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的原位缺口末端標記法（TUNEL），對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞，每張切片選取5個視野，按照每張切片至少計數500個細胞，計算每100個細胞內的陽性細胞數，細胞凋亡指數以百分數表示（%）。4）增殖細胞核抗原（PCNA）測定：取5 μm厚的石蠟組織片染色后細胞核內可見大小不等的黃色或棕色黃色顆粒為PCNA陽性。染色完成后，應用Im?age Pro Plus圖像分析軟件測算其積分光密度值（IOD值），并隨機選取5個視野進行測定，所得IOD值的平均值為最終值。

1.6 統計學處理 應用SPSS21.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況 假手術組大鼠進食飲水、排泄、呼吸狀況、活動量及精神狀態無明顯異常；模型組大鼠術后不欲進食，腹部膨隆，無排便，活動量減少，呼吸急促，眼鼻口處分泌物多；中藥組與Nec-1組大鼠術后精神狀況、活動量好于模型組，眼鼻口處分泌物少于模型組。

2.2 各組大鼠肺組織病理染色 假手術肺組織形態、結構正常，肺泡腔清晰，間質無水腫、炎癥等病理改變；模型組可見肺泡明顯減少，肺組織炎癥細胞浸潤，局部可見實變，肺間質可見水腫；中藥組及Nec-1組與模型組相比，炎性細胞浸潤相對較少，肺實變較輕，間質水腫較少。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 見表1。模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量較假手術組明顯增高（P<0.01），而中藥組和Nec-1組較模型組降低（P<0.01），而其中Nec-1組較抗炎合劑組降低得更為顯著（P<0.01）。

表1 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

注：與假手術組比較，??P<0.01，與模型組比較，△△P<0.01，與抗炎合劑組比較，☆☆P<0.01。下同。

?

2.4 各組大鼠肺組織凋亡指標比較 見表2，圖2～圖3。圖2中假手術組內僅見個別凋亡細胞，模型組內可見大量棕黃色的凋亡細胞，而中藥組及Nec-1凋亡細胞較模型組明顯減少。圖3中模型組PCNA陽性染色較中藥組及Nec-1組明顯增強。模型組大鼠肺組織Tunel染色細胞凋亡百分比及PCNA水平較假手術組明顯增高（P<0.01），中藥組和Nec-1組較模型組降低（P<0.01），且兩組之間無顯著差異（P>0.05）。

表2 各組大鼠肺組織中Tunel染色細胞凋亡指數及PCNA水平比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織中Tunel染色細胞凋亡指數及PCNA水平比較（±s）

?

圖2 各組大鼠肺組織細胞凋亡（Tunel染色，200倍）

圖3 各組大鼠肺組織中PCNA的陽性表達（免疫組化，200倍）

3 討 論

細胞程序性壞死是由受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）、受體相互作用蛋白激酶3（RIPK3）、混合系列蛋白激酶結構域樣蛋白（MLKL）介導的調節性細胞壞死，其參與了許多炎癥性疾病［15-16］。有研究顯示，高脂飲食可通過TLR4介導的程序性壞死和炎癥加重大鼠急性胰腺炎［17］。另外，條件性敲除TGF-βRⅡ/Smad2信號可通過減輕細胞程序性壞死、凋亡和炎癥保護急性腎損傷［18］。近年來，程序性壞死抑制劑被發現可作為一項新的治療靶點在炎癥介導疾病中發揮重要作用［19］。膿毒癥引起的ALI屬于中醫學“喘證”“暴喘”“喘脫”范疇，根據“肺與大腸相表里”的中醫經典理論，肺熱葉焦、腸道津虧，毒邪聚集腸中，久則熱毒互結，內陷營血，從而損傷臟腑脈絡為其病機。基于此，筆者采用清熱解毒、通腑活血之法，創立通腑中藥復方抗炎合劑，方中大黃為君，瀉下攻積、清熱瀉火、活血祛瘀，黃芩、黃連為臣，清熱燥濕、瀉火解毒，厚樸、敗醬草為佐，行氣平喘、消癰排膿，全方共奏清熱通腑、活血排毒之功效。在本實驗中，膿毒癥ALI模型組大鼠炎癥指標及凋亡指標較假手術組明顯升高，說明程序性壞死在膿毒癥發展過程中扮演十分重要的角色，且與炎癥反應密切相關，而中藥復方抗炎合劑對膿毒癥ALI大鼠肺組織細胞程序性壞死及炎癥反應均具有明顯的改善作用，說明該中藥復方可通過減輕組織器官的程序性壞死而起到減輕膿毒癥炎癥反應的作用。但其對程序性壞死與炎癥反應之間的具體信號通路調節機制，本研究中尚未明確，需更進一步的探索。

綜上所述，中藥在抑制程序性壞死、減輕膿毒癥器官功能損傷方面具有十分廣闊的研究前景，開辟了膿毒癥治療的新思路，值得我們進一步去深入研究。