基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究參附注射液治療慢性心力衰竭的作用機(jī)制?

唐福星 張久亮 李春巖

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029）

慢性心力衰竭（CHF）是一種因多種心臟基礎(chǔ)疾病引起心臟結(jié)構(gòu)功能變化，致使心臟充盈與射血功能不全，循環(huán)血量不足以滿足組織器官代謝的綜合征，其發(fā)病率高，患者5年生存率與惡性腫瘤相近。目前中藥靜脈制劑參附注射液已被廣泛應(yīng)用于CHF治療中，并被納入專家共識［1］。大量臨床研究顯示，在常規(guī)藥物治療基礎(chǔ)上加入SFI能夠改善血流動力學(xué)及心衰相關(guān)化驗(yàn)指標(biāo)、減輕患者證候、提高生活質(zhì)量［2］。聯(lián)合中醫(yī)辨證施治較單純西醫(yī)治療有著諸多優(yōu)勢，故研究中醫(yī)治療CHF具有一定前景。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷和烏頭類生物堿是參附注射液的主要成分［20］，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對參附注射液主要成分進(jìn)行分析，篩選疾病與藥物共同靶點(diǎn)，從靶點(diǎn)、信號通路角度研究其治療CHF的機(jī)制，并結(jié)合諸多學(xué)者藥理分析與動物實(shí)驗(yàn)予以佐證，旨在為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供思路。

1 資料與方法

1.1 中藥活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測 通過TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫，以“RENSH?EN”“FUZI”為關(guān)鍵詞，依據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%和藥物相似性（DL）≥0.18，篩選人參與附子兩味中藥全部化學(xué)成分，并統(tǒng)計(jì)兩者活性成分所作用的靶點(diǎn)。

1.2 數(shù)據(jù)獲取與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 本研究以“chronic heart failure”為關(guān)鍵詞檢索Genecards（https：//www.gene?cards.org/）數(shù)據(jù)庫，結(jié)合疾病相關(guān)score值篩選與心力衰竭相關(guān)程度較高、信息來源可靠的靶點(diǎn)；經(jīng)Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化命名，分析得出疾病與藥物間重疊靶點(diǎn)；將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入 STRING（https：//string-db.org/）蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行分析并構(gòu)建成分中藥-疾病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)；將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件繪制中藥-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)各節(jié)點(diǎn)Degree值篩選出重要藥物與靶點(diǎn)，分析PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩詤?shù)，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)整體的“節(jié)點(diǎn)度值”和“介數(shù)中心性”，兩者是判斷網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要性的主要參數(shù)，篩選度值和介數(shù)同時(shí)在中位數(shù)以上的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，由此研究核心靶點(diǎn)可能作用機(jī)制。

1.3 信息與信號通路富集分析 將藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入 Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）數(shù)據(jù)庫分別進(jìn)行GO生物學(xué)過程（Biologi?cal Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）功能富集分析；同時(shí)進(jìn)行KEGG分析靶基因組中的信號通路及代謝網(wǎng)絡(luò)，查詢 KEGG（https：//www.kegg.jp/）、AmiGO2（http：//amigo.geneontology.org/amigo/landing）數(shù)據(jù)庫得到以上通路詳細(xì)信息，綜合預(yù)測SFI與慢性心衰關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物學(xué)特性及調(diào)控通路。

2 結(jié) 果

2.1 參附注射液活性成分靶點(diǎn)及CHF疾病靶點(diǎn)篩選 根據(jù)OB與DL閾值，經(jīng)多個(gè)數(shù)據(jù)庫確認(rèn)，剔除缺少靶點(diǎn)數(shù)據(jù)的化合物，篩除缺乏標(biāo)準(zhǔn)化命名的靶點(diǎn)后，共獲取人參活性成分17個(gè)、附子活性成分5個(gè)、藥物靶點(diǎn)共119個(gè)，見表1。共得到13 194條CHF相關(guān)靶點(diǎn)，以SCORE≥7.69為節(jié)點(diǎn)，篩選出前25%的疾病靶點(diǎn)共3 227條。充分體現(xiàn)SFI多成分、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制。

表1 SFI活性成分篩選

2.2 藥物成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，藥物成分與疾病靶點(diǎn)交集共78個(gè)。將其導(dǎo)入Cytoscape軟件，見圖1。單一節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)聯(lián)系越多說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中作用越重要，參附注射液藥物成分排名前5分別為山柰酚、β谷甾醇、原阿片堿、豆甾醇和蘇齊內(nèi)酯；網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)程度最高的基因包括環(huán)加氧酶1、2（PTGS1、2）、β2腎上腺素受體（ADRB2）、心臟鈉通道基因（SCN5A）、熱休克蛋白90（HSP90AA1）、毒蕈堿受體M3（CHRM3）等，初步推測SFI治療CHF的機(jī)制與這些藥物成分及靶點(diǎn)有關(guān)。

圖1 藥物成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 參附注射液與慢性心力衰竭潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)分析 見圖2。越是處在網(wǎng)絡(luò)中心區(qū)域、與其他節(jié)點(diǎn)交匯越多者則表明該靶點(diǎn)在本疾病中越重要，將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件綜合分析degree值，前5位依次為：蛋白激酶B（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、環(huán)加氧酶（PTGS2）、JUN基因、CASP3基因等，推測這些靶點(diǎn)可能是參附注射液治療CHF的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 參附注射液作用與CHF靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 生物信息學(xué)GO分析 見圖3。將藥物-疾病重合靶點(diǎn)輸入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集，其中與CHF較為相關(guān)的生物過程（BP）包括：影響血液循環(huán)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平、凋亡信號通路、調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)、對類固醇激素的反應(yīng)、正向調(diào)節(jié)MAPK聯(lián)級反應(yīng)；分子功能（MF）包括：G蛋白偶聯(lián)受體活動、神經(jīng)遞質(zhì)受體活動、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與的凋亡信號通路、類固醇激素受體活動、鈣調(diào)蛋白結(jié)合等。因而我們推測參附注射液中人參皂苷及生物堿類成分可能通過這些途徑治療CHF。

圖3 GO富集分子功能圖（上）與生物過程圖（下）

2.5 通路富集分析 見圖4。通過Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG富集，其中與CHF較為相關(guān)的通路包括：調(diào)節(jié)流體剪切力與粥樣硬化通路、AGE-RAGE通路、鈣離子信號通路、核因子-κB信號通路、環(huán)磷酸鳥苷（cAMP）信號通路、內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路、乙酰膽堿受體通路、雌激素受體信號通路等，推測參附注射液是經(jīng)這些通路發(fā)揮作用而治療CHF的。

圖4 KEGG富集分析圖

3 討論

中醫(yī)古籍多從證候角度描述心力衰竭，并將其歸于“喘證”“水腫”“心痹”等疾病。中醫(yī)認(rèn)為，心衰病機(jī)可概括為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以氣虛為主，《金匱要略》“勞則喘息汗出，外內(nèi)皆越，故氣耗矣”“味過于甘，心氣喘滿”，提示飲食勞倦是耗傷心氣的因素；血瘀、痰飲等為標(biāo)實(shí)之邪，《圣濟(jì)總錄》“虛勞驚悸者，甚者則悸，微者短氣”“水病累血，血病累氣”。心衰晚期病損及腎，則多見心腎陽虛之證［1］。參附注射液源自中藥名方參附湯，最早可追溯至宋《嚴(yán)氏濟(jì)生方》，方中黑附子大辛大熱，補(bǔ)火助陽，紅參乃大補(bǔ)元?dú)庵帯！侗窘?jīng)》中記載“人參味甘，主補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄，止驚悸”“附子主風(fēng)寒咳逆邪氣，溫中，金創(chuàng)，破癥堅(jiān)積聚，血瘕，寒溫”。二藥合用有益氣溫陽之功，氣行則血暢，而胸悶心悸、胸痹肢冷得解。本研究基于數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過對參附注射液分析成分，構(gòu)建疾病-藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而從分子生物學(xué)功能角度解釋其治療CHF的機(jī)制。目前對參附注射液有效成分的藥物機(jī)理作用已進(jìn)行大量動物實(shí)驗(yàn)，其中的許多論述可以佐證本研究結(jié)論。

研究顯示，慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞L型鈣通道表達(dá)下調(diào)，肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子容量減少，影響興奮-收縮偶聯(lián)過程中Ca2+的釋放，導(dǎo)致心肌收縮力降低［3］。人參總皂苷可作用于G蛋白偶聯(lián)受體影響鈣通道活動，增加心肌細(xì)胞Ca2+內(nèi)流［4］，故能增加小鼠肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+濃度，從而增強(qiáng)心肌收縮力，改善心衰小鼠血流動力學(xué)表現(xiàn)［5］。患病心臟常出現(xiàn)心肌肥厚等結(jié)構(gòu)性病變，多累及電生理系統(tǒng)，加以慢性缺氧、血離子紊亂等原因，CHF患者常出現(xiàn)房顫、傳導(dǎo)阻滯等各類心律失常，進(jìn)一步影響心室收縮及舒張功能從而加重心衰。而人參有效成分山柰酚能通過cAMP/PKA途徑開放大電導(dǎo)鈣激活鉀通道，繼而引起HUVEC細(xì)胞膜超極化［6］，以起到穩(wěn)定膜電位的作用。人參二醇組皂苷則能抑制大鼠心肌L型鈣通道活動，延長心臟動作電位第二時(shí)相中Ca2+內(nèi)流過程，從而影響其興奮性、傳導(dǎo)性和自律性［7］，這可能是參附注射液對抗心律失常作用的機(jī)制［8］。

心室重構(gòu)是CHF病程進(jìn)展中的另一重要部分，涉及神經(jīng)、體液、免疫、細(xì)胞凋亡等諸多方面。有研究表明，細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6水平異常升高與心肌肥厚程度相關(guān)［9］。核因子-kappa B受體（NF-κB）［10］與Toll樣受體（TLRs）［11］可受此類炎癥因子激活，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡與心室重構(gòu)。多項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)表明，人參皂苷Rb1能通過介導(dǎo)TLR4-MyD88-NF-κB/MAPK通路，減少小鼠丙二醛、IL-6、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生［12］，并提高超氧化物歧化酶活性，從而延緩復(fù)制性內(nèi)皮細(xì)胞衰老［13］。山柰酚能通過干預(yù)TLR4/NF-κB信號通路，減少小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子的產(chǎn)生［14］，改善血流動力學(xué)指標(biāo)［15］，并緩解血管內(nèi)皮細(xì)胞受氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的凋亡損傷［16］。此外，在糖尿病患者中，晚期糖基化終產(chǎn)物與其受體所構(gòu)成的AGE-RAGE通路表達(dá)上調(diào)，其下游產(chǎn)物涵蓋IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），所致炎癥反應(yīng)及血管內(nèi)皮異常增生被認(rèn)為與糖尿病缺血性心臟病相關(guān)［17］，山柰酚可以通過抑制AGE-RAGE通路激化，減少炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而減輕冠脈鉗夾大鼠心肌缺血癥狀［18］。人參皂苷Rh2則能抑制VEGF與受體結(jié)合，抑制異常新生血管形成與移生［19］，進(jìn)而發(fā)揮抗心衰作用。

綜上，參附注射液治療慢性心力衰竭具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特征，目前現(xiàn)有的動物實(shí)驗(yàn)研究從增強(qiáng)心肌收縮力、抗心律失常、抑制炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡、改善動脈粥樣硬化等途徑，解釋了參附注射液治療慢性心力衰竭的分子機(jī)制，今后研究亦可能從調(diào)節(jié)類固醇激素分泌、影響腎上腺能受體及膽堿能受體激活等途徑印證本文猜想。本研究尚存在局限性，原藥物的部分有效成分由于不滿足篩選條件而未能納入研究，另有部分藥物成分僅有少量動物實(shí)驗(yàn)，不足以支持本研究預(yù)測，今后還需拓展動物實(shí)驗(yàn)范圍，優(yōu)化數(shù)據(jù)篩選及處理手段，發(fā)揮中醫(yī)藥和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之所長，讓后續(xù)研究更具合理性和前瞻性。